CN111235226A - 一种分离纯化病原微生物dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离纯化病原微生物DNA的方法。将样品转移至离心管中，然后加入权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂，涡旋混匀，孵育，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA。本发明的专用于分离纯化病原微生物DNA的方法，该方法操作过程简便快捷，少量样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。

Description

一种分离纯化病原微生物DNA的方法

技术领域：

本发明属于DNA提取领域，具体涉及一种分离纯化病原微生物DNA的方法。

背景技术：

近十年来在分子检测领域中，高通量测序技术发展迅猛，其一次可以对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，这使得其可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析。高通量测序技术的独特优势，不仅推进了科学研究的进展，而且在临床医学领域也展现出很大的应用价值。

然而对人或者动物样本中低量感染的病原微生物进行测序时，面临着这样一个问题：由于感染样本中病原微生物的载量是非常少的，所以需要对感染样本进行超高深度的测序，才能获得低载量的所感染的病原微生物的信息。超高深度测序本身，会导致测序数据量大、测序成本高，且给数据的分析甚至是存储都带来极大不便。这个问题反过来又限制了高通量测序在临床感染诊断中的应用。所以，对人或动物样本中所感染的微生物进行抽提测序时，样本中的病原微生物得到有效的富集是非常关键的。

目前富集病原微生物核酸的技术，有过滤法、密度梯度离心法、磁珠吸附技术等。

过滤法富集微生物是将适当孔径的滤膜放入滤器过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物滞留在与样本溶液分开，达到微生物富集的目的。该方法主要用于体液等大体积样本微生物的富集，不适用于具有一定粘稠度的样本，并且后续样本的处理比如病原微生物核酸提取较繁琐，易造成样本的损失。

密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度将样本置于介质的顶部，根据微生物在密度梯度液中的比重不同通过离心力的作用使靶细菌分离，该方法成本昂贵，实验过程较繁琐，可处理的样本种类、体积有限，且难以实现不同种类微生物的富集与分离。

磁珠吸附技术是将临床液体样本(尿液、胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液等)中细菌、真菌或病毒特异性结合于磁珠上，无需高速离心，从而实现病原体的富集；再将剩余的待测样本进行核酸的提取和高通量测序。该方法所用试剂耗材成本昂贵，且耗时较长，无法满足临床标本检验的需求。

发明内容：

本发明的目的是提供一种专用于富集分离病原微生物DNA的试剂盒与方法，该试剂盒中的核酸释放与结合剂经过特殊优化，可从送检标本中有效富集病原微生物，且本核酸释放与结合剂能释放多种病原微生物DNA，无需更换其他试剂盒。核酸释放与结合剂同时具备保存、释放、结合的功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。该方法操作过程简便快捷，少量样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。

本发明的能释放多种病原微生物DNA，无需更换其他试剂盒的核酸释放与结合剂，包括2M～4M GuSCN、15％～17％V/V的乙醇、1％～3％V/V的Triton X100、8mM～11mM EDTA、3mM～6mM Tri-HCl、质量分数0.3％～0.6％SDS，溶剂为水。该核酸释放与结合剂同时具备保存、释放、结合的功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。

优选，所述的核酸释放与结合剂包括3M GuSCN、16.7％V/V乙醇、2％V/V TritonX100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、质量分数0.5％SDS，溶剂为水。

本发明的第二个目的是提供一种分离纯化病原微生物DNA的试剂盒，其包括上述核酸释放与结合剂、洗涤液1和洗涤液2；

所述的洗涤液1包括：2M～4M GuSCN、15％～17％V/V的乙醇、1％～3％V/V的Triton X100、8mM～11mM EDTA、3mM～6mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：20％～30％V/V的乙醇、80mM～120mM的氯化钠、8mM～11mM的Tri-HCl、溶剂为水。

优选，所述的洗涤液1包括：3M GuSCN、16.7％V/V的乙醇、2％V/V的Triton X100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：25％V/V的乙醇、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl、溶剂为水。

本发明的第三个目的是提供一种分离纯化病原微生物DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将样品转移至离心管中，然后加入上述核酸释放与结合剂，涡旋混匀，孵育，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA。

所述的再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA具体步骤为：加入洗涤液1至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再次加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，离心，取出纯化柱进行干燥，然后用无核酸酶水洗脱获得DNA；

优选，所述的洗涤液1包括：3M GuSCN、16.7％V/V的乙醇、2％V/V的Triton X100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：25％V/V的乙醇、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl、溶剂为水。

优选，具体步骤如下：

步骤一.核酸释放与结合

(1)转移250uL样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中；

(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒；

(3)61℃，250rpm速度震荡孵育2h；

(4)孵育结束后，8,000×g离心15秒，收集管壁上的液体；

(5)转移步骤(4)的750uL混合液至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(6)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中；

步骤二.核酸纯化

(1)加入500uL洗涤液1至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(2)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(3)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，13,000×g离心3分钟；

(5)取出纯化柱，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟；

步骤三.洗脱核酸

(1)将纯化柱转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中，加入10-20ulNuclease Free Water至纯化柱的膜中央，放置3分钟，13,000×g离心1分钟，收集滤液；

(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存。如保存于-20℃或-80℃

采用本试剂盒以及方法，其提取过程应使用一次性无DNase和RNase的移液器枪头和离管；所用到的其他玻璃、金属器皿均应是无DNase和RNase；无水乙醇与异丙醇应为新开封或提DNA专用。

本发明的核酸释放与结合剂中GuSCN和SDS能起到释放的作用，GuSCN能起到结合的作用，GuSCN，EDTA和Triton X100能起到保存的作用，GuSCN和SDS在释放出核酸之后，GuSCN，SDS和EDTA能有效地抑制核酸酶对核酸的降解，同时起到稳定的作用，还能一定程度上洗涤和去垢。各组分相互协同，共同起作用，起到一个试剂同时具备释放、保存和结合三大功能。

本发明提供了一种用于分离病原微生物DNA的试剂盒，该试剂盒中的核酸释放与结合剂经过特殊优化，可从送检标本中有效富集病原微生物，能释放多种病原微生物DNA，无需更换其他试剂盒。同时具备保存、释放、结合的功能，常温下即可保存样本，释放核酸，并对释放出的DNA进行结合，省时省力，大大提高了工作效率。

本发明的一种专用于分离纯化病原微生物DNA的方法，该方法操作过程简便快捷，少量样本即可获得足够的DNA，且分离的DNA含量和纯度高。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1：

一、试剂盒：

核酸释放与结合剂：含3M GuSCN、16.7％V/V乙醇、2％V/V Triton X100、10mMEDTA、5mM Tri-HCl、质量分数0.5％SDS，溶剂为水。配制方法：将各成分按其含量称量，然后将除乙醇与Triton X100以外的成分混合均匀，进行灭菌，灭菌方式为121℃104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入乙醇与Triton X100。

核酸纯化：

洗涤液1：含3M GuSCN、16.7％V/V的乙醇、2％V/V的Triton X100、10mM EDTA、5mMTri-HCl，溶剂为水。配制方法：将各成分按其含量称量，然后将除乙醇与Triton X100以外的成分混合均匀，进行灭菌，灭菌方式为121℃104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入乙醇与Triton X100。

洗涤液2：含25％的乙醇(V/V)、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl，溶剂为水。将各成分按其含量称量，然后将除乙醇以外的成分混合均匀，进行灭菌，灭菌方式为121℃，104.3KPa灭菌15分钟,待其冷却后再加入乙醇。

二、提取方法

步骤1.核酸释放与结合

(1)转移250uL含枯草芽孢杆菌或结核分枝杆菌样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中。

(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒。

(3)61℃(250rpm速度震荡)孵育2h。

(4)孵育结束后，短暂离心，8,000xg离心15秒，收集管壁上的液体。

(5)转移750uL混合液(第4步获得的混合液)纯化柱中，8,000xg离心60秒。

(6)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。

步骤2.核酸纯化

(1)加入500uL洗涤液1至柱子中。8,000xg离心60秒。

(2)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500uL洗涤液2至柱子中。8,000xg离心60秒。

(3)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。重复步骤2，洗涤液2共洗脱2次。

(4)倒弃滤液，把柱子装回收集管中。13,000xg离心3分钟。

(5)取出柱子，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟。

步骤3.洗脱核酸

(1)将柱子转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中。加入20ul NucleaseFree Water至柱子的膜中央。放置3分钟。13,000xg离心1分钟。

(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存于-20℃或-80℃。

竞品试剂盒：HiPure MycoBacterial DNA Kit，成分如下：

需要准备材料和工具

溶解Proteinase K(20mg/ml):加入Proteinase Dissolve Buffer溶解Proteinase K至终浓为20mg/ml。颠倒混匀，保存于-20℃。

溶解Lysozyme(100mg/ml):加入适量的Protease Dissolve Buffer溶解Lysozyme至终浓度为100mg/ml。颠倒混匀后，保存于2-8℃。

用无水乙醇稀释Buffer GW2，于室温保存

振荡金属浴或振荡水浴(37℃,56℃和95℃)

配制NaOH-NALC溶液:2％NaOH,0.5％N-acetyl-L-cysteine

具体操作如下：

A.转移250uL含枯草芽孢杆菌或结核分枝杆菌样品(与步骤1.核酸释放与结合中的(1)的样品相同)至1.5ml离心管中。

B.加入等倍体积的NaOH-NALC Buffer(4％NaOH,1％NAC)至样品中。涡旋混匀，室温振荡混匀20分钟液化样本。

C.10,000x g离心15分钟，小心吸弃上清液。

D.加入200μl Buffe GTL,10μl Lysozyme和10μl Proteinase K至样品中，涡旋重悬样品。

E.37℃温育20分钟。56℃温育20分钟。95℃温育20分钟。

F.加入400μl Buffer GXP至裂解液中，涡旋混匀20秒。

G.把HiPure DNA Mini Column I装在2ml收集管中。把第F步获得的混合液转移至柱子中。10,000x g离心1分钟。

H.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000x g离心1分钟。

I.Buffer GW2使用前，须用无水乙醇稀释，按瓶子标签指示进行稀释。

J.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。再加入600μl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000x g离心1分钟。

K.倒弃流出液，把柱子装回收集管中。10,000×g离心3分钟。

L.将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入20μl Buffer AE至柱子膜中央，静置2分钟。10,000×g离心1分钟。

M.丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

3.所提DNA浓度及OD值检测

采用Nandrop one对本发明试剂盒及竞品试剂盒提取的DNA进行浓度及OD检测表

由结果来看，相同体积量的标本，本发明方法提取获得的核酸浓度要高于竞品所得，并且核酸纯度也优于竞品试剂盒；且本发明方法适用于多种病原微生物的核酸提取。

实施例2：

本实施例与实施例1相同，只是：

核酸释放与结合剂包括以下组分：2M GuSCN、15％V/V的乙醇、1％V/V的TritonX100、8mM EDTA、3mM Tri-HCl、质量分数0.3％SDS，溶剂为水。

所述的洗涤液1包括：2M GuSCN、15％V/V的乙醇、1％V/V的Triton X100、8mMEDTA、3mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：20％V/V的乙醇、80mM的氯化钠、8mM的Tri-HCl、溶剂为水。

实施例3：

本实施例与实施例1相同，只是：

核酸释放与结合剂包括以下组分：4M GuSCN、17％V/V的乙醇、3％V/V的TritonX100、11mM EDTA、6mM Tri-HCl、质量分数0.6％SDS，溶剂为水。

所述的洗涤液1包括：4M GuSCN、17％V/V的乙醇、3％V/V的Triton X100、11mMEDTA、6mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：30％V/V的乙醇、120mM的氯化钠、11mM的Tri-HCl、溶剂为水。

Claims (8)

1.一种核酸释放与结合剂，其特征在于，包括2M～4M GuSCN、15％～17％V/V的乙醇、1％～3％V/V的Triton X100、8mM～11mM EDTA、3mM～6mM Tri-HCl、质量分数0.3％～0.6％SDS，溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的核酸释放与结合剂，其特征在于，所述的核酸释放与结合剂包括3M GuSCN、16.7％V/V乙醇、2％V/V Triton X100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、质量分数0.5％SDS，溶剂为水。

3.一种分离纯化病原微生物DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂、洗涤液1和洗涤液2；

所述的洗涤液1包括：2M～4M GuSCN、15％～17％V/V的乙醇、1％～3％V/V的TritonX100、8mM～11mM EDTA、3mM～6mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：20％～30％V/V的乙醇、80mM～120mM的氯化钠、8mM～11mM的Tri-HCl、溶剂为水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液1包括：3M GuSCN、16.7％V/V的乙醇、2％V/V的Triton X100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：25％V/V的乙醇、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl、溶剂为水。

5.一种分离纯化病原微生物DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将样品转移至离心管中，然后加入权利要求1或2所述的核酸释放与结合剂，涡旋混匀，孵育，再转移至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的再经洗涤和洗脱获得病原微生物DNA具体步骤为：加入权利要求3中的洗涤液1至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，加入权利要求3中的洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，再次加入洗涤液2至纯化柱中，离心去除滤液，将纯化柱装回收集管中，离心，取出纯化柱进行干燥，然后用无核酸酶水洗脱获得DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的洗涤液1包括：3M GuSCN、16.7％V/V的乙醇、2％V/V的Triton X100、10mM EDTA、5mM Tri-HCl、溶剂为水；

所述的洗涤液2包括：25％V/V的乙醇、100mM的氯化钠、10mM的Tri-HCl、溶剂为水。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一.核酸释放与结合

(1)转移250uL样品至无DNase RNase的1.5mL离心管中；

(2)加入500uL核酸释放与结合剂至样品中，涡旋混匀20秒；

(3)61℃，250rpm速度震荡孵育2h；

(4)孵育结束后，8,000×g离心15秒，收集管壁上的液体；

(5)转移步骤(4)的750uL混合液至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(6)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中；

步骤二.核酸纯化

(1)加入500uL洗涤液1至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(2)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(3)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，加入500uL洗涤液2至纯化柱中，8,000×g离心60秒；

(4)倒弃滤液，把纯化柱装回收集管中，13,000×g离心3分钟；

(5)取出纯化柱，装在无DNase RNase的1.5mL离心管中，然后放置于56℃烘箱中干燥10分钟；

步骤三.洗脱核酸

(1)将纯化柱转移至新的无DNase RNase的1.5mL离心管中，加入10-20ul NucleaseFree Water至纯化柱的膜中央，放置3分钟，13,000×g离心1分钟，收集滤液；

(2)丢弃DNA纯化柱，把DNA保存。