CN112080492A - 一种高得率的游离dna和rna共抽提试剂盒及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法，包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。本发明采用特殊的裂解液提高了游离DNA和RNA的得率，同时又保证了RNA的完整性；采用磁珠进行抽提简化了操作，节约时间，易于自动化，具有良好的应用前景。

Description

一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法。
背景技术
血清/血浆或其他体液中的游离核酸(cfNA，游离DNA和RNA，cfDNA&cfRNA)的遗传和表观遗传分析，为广泛的临床疾病如癌症、自身免疫性疾病、感染或胎儿的疾病的早期检测，提供了一个极难得的机会。绝大多数的患者体液中游离核酸含量非常低，片段小，提取过程中容易丢失，得率不高，使检测灵敏度降低，给后续检测带来很大挑战。目前，已有相关技术针对抽提游离DNA或游离RNA提出了改进方案和产品，但是同时检测游离DNA和RNA是一种新的需求，而cfDNA&cfRNA共抽提试剂盒少之又少，不能很好的满足检测的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒及使用方法，解决了现有技术多用吸附柱法，但通量低、不易自动化、成本相对较高的缺陷。
本发明提供了一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒，包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。
所述含有GITC的裂解液的组成为：4-10M GITC，10-100mM Tris-HCl，1-10％SDS，5-15％TWEEN-20，1-2mM DTT。高浓度蛋白质变性剂GITC(四乙酰基-b-D-葡萄糖异硫氰酸酯)能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，从而确保了RNA的完整性。
所述硅基纳米磁珠的浓度为10-100mg/mL。磁珠当高盐低pH值时结合核酸，当低盐高pH值时洗脱，可实现手动操作类似一管内抽提，实现抽提的自动化，不需要离心、转移等步骤，最大限度地降低核酸的丢失，提高核酸的得率。硅基纳米磁珠，粒径纳米级，具有超顺磁性，快速磁响应性，悬浮性好，沉降时间长，同时吸磁时间短，吸附量大，适用于微量样本、小片段DNA/RNA的分离纯化。
所述漂洗液的组成为：1-10mM Tris-HCl，50-80％异丙醇。所述漂洗液可以有效去除残留的杂质，避免核酸的丢失，提高核酸的得率。
本发明还提供了一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
首先向样本中加入含有GITC的裂解液和硅基纳米磁珠，涡旋混匀后室温震荡，静置后再加入漂洗液，涡旋混匀后室温震荡，静置后最后加入Elution Buffer，涡旋后静置进行检测。
所述样本与含有GITC的裂解液的体积比为1:1.5-2。
所述样本与硅基纳米磁珠的体积比为1:0.02-0.04。
所述样本与漂洗液的体积比为1:1-1.5。
所述样本与Elution Buffer的体积比为1:0.04-0.08。
有益效果
本发明采用特殊的裂解液提高了游离DNA和RNA的得率，同时又保证了RNA的完整性；采用磁珠进行抽提简化了操作，节约时间，易于自动化，相比于吸附柱方法通量更高，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例中所用试剂盒的组成如下：
裂解液：5M GITC，50mM Tris-HCl，5％SDS，10％TWEEN-20，1mM DTT。硅基纳米磁珠，50mg/mL。漂洗液：2mM Tris-HCl、70％异丙醇。
实施例1
针对正常人血清样本，本发明与现有QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit方法抽提，管家基因GAPDH CT值比较。
1、样本准备：
取10例正常分离后的血清样本，每例4mL；每例血浆均分为2份，分别为2mL。
2、核酸提取：
2.1本方法
a.2ml样本中加入3ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠，涡旋震荡混匀，置于混匀仪上，室温振荡6min。在振荡期间，每隔2分钟颠倒混匀5sec。
b.将上述样本管置于磁力架上，静置1min。静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。
c.将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。重复此步骤一次。
d.将上述样本管置于磁力架上，开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架，加入80ul Elution Buffer，涡旋打散磁珠。室温静置5min，期间每隔2分钟涡旋打散一次。
e.将上述样本管置于磁力架上，静置5min，将上清转移至新的Nuclease-free离心管中。
2.2对比方法
a.取2mL样本，加入到15mL尖底离心管中，分别加入200μL蛋白酶K。加入1.6mL ACL溶液，拧紧盖子，震荡混匀30s。转移至水浴锅中60℃，孵育30min。
b.取出离心管，加入3.6mL ACB溶液，拧紧盖子，震荡混匀20s。将离心管放置-20度冰箱中孵育5min。
准备好真空抽滤装置(插上一次性适配接头)，插上QIAamp mini柱，再插入一只20mL tube extender于QIAamp mini柱中。往20mL tube extender中加入15mL尖底离心管的液体，开启真空泵。
d.待液体抽干，拔掉并丢弃20mL tube extender，往QIAamp mini柱加入600μLACW1。
待液体抽干，往QIAamp mini柱加入750μL Buffer ACW2溶液。
待液体抽干，往QIAamp mini柱加入750μL乙醇溶液。
待液体抽干，取出QIAamp mini柱，置于一个干净的2mL收集管中，14000rpm离心3min。
e.取出QIAamp mini柱，置于新的2mL收集管中，打开QIAamp mini柱的盖子，转移至金属浴，56℃干燥10分钟。
取出QIAamp mini柱，置于新的1.5mL试剂盒自带洗脱管中，加入42μL AVE溶液，盖上管盖，室温静置5min。
4000rpm离心1min，重复操作1次。
f.14000rpm离心1min，丢弃QIAamp mini柱，盖好1.5mL洗脱管盖。
3、检测：
将获得的游离核酸利用管家基因GAPDH进行荧光定量PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。与采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取的游离核酸的检测结果进行比较，两种方法的CT值间存在差异，通过管家基因的qPCR验证，可以判断本实施例抽提技术效果略高于QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，获得的核酸浓度大，得率高。而本方法更易于自动化和实现高通量提取。
结果如下表所示：
Figure BDA0002668450420000031
Figure BDA0002668450420000041
实施例2
针对含病原菌血清样本，本发明与现有QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit方法抽提，内参16srRNA基因CT值比较。
1、样本准备：
取10例正常分离后的含病原菌血清样本，每例4mL；每例血浆均分为2份，分别为2mL。
2、核酸提取：
2.1本方法
a.2ml样本中加入3ml裂解液和40μl硅基纳米磁珠，涡旋震荡混匀，置于混匀仪上，室温振荡6min。在振荡期间，每隔2分钟颠倒混匀5sec。
b.将上述样本管置于磁力架上，静置1min。静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。
c.将上述样本管取下磁力架并加入2ml漂洗液，涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min；静置结束后，小心移除上清，液面的泡沫也一并移除。重复此步骤一次。
d.将上述样本管置于磁力架上，开盖静置5min。磁珠干燥后将样本管取下磁力架，加入80μL Elution Buffer，涡旋打散磁珠。室温静置5min，期间每隔2分钟涡旋打散一次。
e.将上述样本管置于磁力架上，静置5min，将上清转移至新的Nuclease-free离心管中；
2.2对比方法
a.取2mL样本，加入到15mL尖底离心管中，分别加入200μL蛋白酶K。加入1.6mL ACL溶液，拧紧盖子，震荡混匀30s。转移至水浴锅中60℃，孵育30min。
b.取出离心管，加入3.6mL ACB溶液，拧紧盖子，震荡混匀20s。将离心管放置-20度冰箱中孵育5min。
准备好真空抽滤装置(插上一次性适配接头)，插上QIAamp mini柱，再插入一只20mL tube extender于QIAamp mini柱中。往20mL tube extender中加入15mL尖底离心管的液体，开启真空泵。
d.待液体抽干，拔掉并丢弃20mL tube extender，往QIAamp mini柱加入600μLACW1。
待液体抽干，往QIAamp mini柱加入750μL Buffer ACW2溶液。
待液体抽干，往QIAamp mini柱加入750μL乙醇溶液。
待液体抽干，取出QIAamp mini柱，置于一个干净的2mL收集管中，14000rpm离心3min。
e.取出QIAamp mini柱，置于新的2mL收集管中，打开QIAamp mini柱的盖子，转移至金属浴，56℃干燥10分钟。
取出QIAamp mini柱，置于新的1.5mL试剂盒自带洗脱管中，加入42μL AVE溶液，盖上管盖，室温静置5min。
4000rpm离心1min，重复操作1次。
f.14000rpm离心1min，丢弃QIAamp mini柱，盖好1.5mL洗脱管盖。
3、检测：
将获得的游离核酸利用内参16srRNA基因进行荧光定量PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。与采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取的游离核酸的检测结果进行比较，两种方法的CT值间存在差异，通过内参基因的qPCR验证，可以判断本实施例抽提技术效果高于QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，获得的核酸浓度大，得率高。
Figure BDA0002668450420000051

Claims (9)

1.一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒，其特征在于：包括含有GITC的裂解液、硅基纳米磁珠和漂洗液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述含有GITC的裂解液的组成为：1-10MGITC，10-100mM Tris-HCl，1-10％SDS，5-15％TWEEN-20，1-2mM DTT。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述硅基纳米磁珠的浓度为10-100mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液的组成为：1-10mM Tris-HCl，50-80％异丙醇。
5.一种高得率的游离DNA和RNA共抽提试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
首先向样本中加入含有GITC的裂解液和硅基纳米磁珠，涡旋混匀后室温震荡，静置后再加入漂洗液，涡旋混匀后室温震荡，静置后最后加入Elution Buffer，涡旋后静置进行检测。
6.根据权利要求5的使用方法，其特征在于：所述样本与含有GITC的裂解液的体积比为1:1.5-2。
7.根据权利要求5的使用方法，其特征在于：所述样本与硅基纳米磁珠的体积比为1:0.02-0.04。
8.根据权利要求5的使用方法，其特征在于：所述样本与漂洗液的体积比为1:1-1.5。
9.根据权利要求5的使用方法，其特征在于：所述样本与Elution Buffer的体积比为1:0.04-0.08。
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