CN105925568A - 一种共提取dna/rna病毒核酸的方法 - Google Patents

一种共提取dna/rna病毒核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，用含RNA助沉剂的异硫氰酸胍裂解液裂解经生理盐水稀释标本，使标本中不同核酸病毒的DNA或RNA释放游离于裂解液中，加入磁珠，形成磁珠‐核酸复合物，洗涤后获得核酸洗脱液。本发明基于纳米磁珠创建了一种新型从呼吸道标本中共提取DNA和RNA的方法，整个过程不需用到苯酚、氯仿，β‐巯基乙醇等有毒试剂，省时省力。本发明从呼吸道标本中共同提取DNA和RNA，也适用于其他如尿液、血液等不同类型样本的核酸共提取，高效除去蛋白质等杂质，减少核酸降解，实现了在同一管内同时检测DNA病毒和RNA病毒的目的。本发明简便、快速、安全，特别适用于荧光定量PCR等检测。

Description

一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，特别涉及一种基于磁珠从呼吸道标本中快速共提取核酸的方法，包括DNA病毒和RNA病毒。
背景技术
多重RT-qPCR(Reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)技术以其操作简便，灵敏度高，特异性强，成本相对减少等诸多优点已成为临床实验室检测病毒的主要手段，目前多重PCR技术多用于检测同一种类型的病毒核酸，但在临床实践中，常见呼吸道病毒分为DNA病毒和RNA病毒，如腺病毒(Adenovirus,ADV)为DNA病毒，而呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)为RNA病毒，两者重要性相当，应用多重定量PCR同时检测DNA和RNA病毒具有重要的实践意义。应用多重定量PCR前如能从标本中同时提取高质量的DNA和RNA病毒，则能进一步节省人力物力及时间。
目前核酸分离技术虽然发展较快，但存在不少缺点，如市场上的病毒核酸共提取试剂盒主要用于检测血液中病毒，如TIANGEN试剂盒，且一般基于介质吸附法，操作过程中需多次转移液体，离心，步骤过于繁琐，花费时间过长；酚氯仿抽提法虽然所提核酸纯度高，但对人体危害大，容易造成环境污染，且提取过程中同样需反复转移，造成核酸量减少或者污染，且花费时间比介质吸附法更长。
纳米磁珠是一种新型材料，表面修饰大量的羟基，能在高盐条件下吸附核酸，从而与其他杂质如蛋白等分离。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，是一种基于磁珠从呼吸道标本中快速、可自动化的快速且同时大规模提取核酸的方法(同时提取DNA和RNA病毒)。
本发明方法通过以下步骤实现：
(1)在经处理后的呼吸道标本中加入300μl病毒裂解液及6μl RNA助沉剂振荡混匀，置于60℃金属浴中保温10min；
(2)待上述裂解物冷却至室温后，加入20μl磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀充分，使核酸与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；
(3)使用500μl 70％的乙醇(用DEPC水配制)洗去复合物表面蛋白质、脂质及盐离子等杂质；
(4)洗涤后的磁珠-核酸复合物加入50-200μl无菌DEPC水，将核酸从磁珠上面洗脱下来，得到含DNA/RNA病毒核酸洗脱液。
本发明适用样本主要为呼吸道标本包括痰标本、咽拭子(分泌物拭子)、肺泡灌洗液，也适用于组织提取液、尿液、分泌物、粪便、病毒培养液及其他体液样本。
呼吸道标本包括痰标本、咽拭子、肺泡灌洗液，痰液或肺泡灌洗液处理方法为加入4倍体积的生理盐水(如痰中含较多粘性蛋白，可加0.1％DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)液化痰液，混匀后取200μl痰液加入1.5ml离心管中，离心5min，弃上清备用。分泌物拭子处理方法：加灭菌生理盐水1ml到无菌管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，取200μl移入另一离心管中，离心5min，弃上清备用。
所述的病毒裂解液为2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT(二硫苏糖醇)，pH为8；
所述的磁珠含量为10mg/ml，磁珠颗粒直径为0.2-1.5μm，纳米磁珠表面具有核壳结构，即超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠。
所述的RNA助沉剂为分子生物学级5-30mg/ml丙烯基多聚物溶液
步骤(2)加入1倍体积无水乙醇与磁珠后，上下颠倒混匀充分，室温放置5分钟，每隔2-3分钟混匀一次。
步骤(4)所加洗脱液为50μl-200μl无菌DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水。
本发明的另一个目的是提供所述方法在直接进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究及检测中的应用，尤其在多重RT-qPCR同时检测DNA病毒和RNA病毒中的应用。
本发明可配合自动化仪器，高通量提取病毒核酸。
本发明与RT-qPCR结合可以简便快速地在一个反应管中同时定量检测DNA病毒和RNA病毒。本发明操作简单快速重复性好，结果准确可靠，其应用前景看好。
本发明基于纳米磁珠创建了一种新型从呼吸道标本中共提取DNA和RNA的方法，整个过程不需用到苯酚、氯仿，β-巯基乙醇等有毒试剂，省时省力，并为将来实行核酸自动化提取提供了依据。同时结合多重荧光定量RT-PCR技术检测呼吸道病毒，实现了在同一管内同时检测DNA病毒和RNA病毒的目的，值得临床实验室推广应用。
附图说明
图1是二重RT-qPCR检测呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒(ADV)。
图2是SYBR Green法检测GAPDH基因。
图3是一步法RT-qPCR法检测HTN3基因。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明，以下实施仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1呼吸道合胞病毒和腺病毒核酸共提取及检测
(一)核酸共提取
(1)痰标本前处理与检测：收集呼吸道合胞病毒(RSV)或腺病毒(ADV)阳性的痰液标本共25份，将痰液混合，使用DTT液化，生理盐水补足至50ml，取1ml用普通PCR方法扩增，送上海生工生物工程有限公司测序验证混合痰液中含ADV和RSV。
(2)取200μl痰液加入1.5ml离心管中，离心5min，弃上清。
(3)加入300μl病毒裂解液(2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT)，加入6μlRNA助沉剂振荡混匀，置于60℃保温10min，每隔2-3min混匀一次。
(4)冷却至室温后，加入20μl磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀充分，室温放置5min，每隔2-3min混匀一次。
(5)将离心管于离心机中高速短时离心，去除壁上的残液。
(6)磁铁吸附纳米磁珠，弃上清，用200μl 70％乙醇清洗2-5次。
(7)加入50μl RNase-free H2O，用移液器吸头吹打混匀，室温放置5min。
(8)磁力架吸附已洗脱完核酸的纳米磁珠，将含有核酸的上清液转移至一新的离心管中,-30℃保存备用。
(二)二重RT-qPCR检测
从GenBank数据库下载RSV和ADV基因序列，利用NCBI数据库中Prime pick工具和Oligo 6.22进行对比和优化，选择同源性高的保守区域设计引物和探针，并用NCBI数据中的Blast验证各引物和探针序列的特异性，引物由生命(上海)生物有限公司合成，探针由上海奕跃生物公司合成，见表1。病毒靶序列见表2。
表1 二重RT-qPCR引物与探针序列
表2 病毒靶序列
将所提核酸为模板进行二重RT-qPCR检测。二重RT-qPCR反应体系，25μl反应体系包括12.5μl 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ，0.5μl TaKaRa Ex Taq HS，0.5μl PrimeScrip RT EnzymeMix Ⅱ，核酸模板4μl，各引物探针(10μmol/L)0.5μl，用灭菌水补足至25μl。以灭菌水为阴性对照。反应条件为：42℃逆转录5min，预变性95℃、10s，40个循环为95℃变性5s、60℃延伸35s采集荧光信号。
结果证实该核酸共提取方法可同时提取DNA病毒和RNA病毒核酸，且核酸质量和产量均达到了多重RT-qPCR要求，结果见图1。可用于分子杂交等各种分子生物学后续研究。
实施例2管家基因GAPDH与HTN3检测
GAPDH基因是维持人类细胞最低限度功能所不可少的基因，即管家基因，通过检测GAPDH基因的量可衡量从咽拭子中所提核酸中DNA的量，而HTN3基因(Histatin 3)是唾液中mRNA的特异标记物，可通过检测HTN3基因的量衡量从咽拭子中所提核酸中RNA的量，基因序列见表3。
(一)咽拭子标本管家基因核酸共提取
(1)样品制备：收集5份健康人咽拭子标本，加灭菌生理盐水1ml到无菌管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，取200μl加入另一1.5ml离心管中，离心5min，弃上清备用。
(2)加入300μl病毒裂解液(2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT)，加入6μlRNA助沉剂振荡混匀，置于60℃保温10min，每隔2-3min混匀一次。
(3)冷却至室温后，加入20μl磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀充分，室温放置5min，每隔2-3min混匀一次。
(4)将离心管于离心机中高速短时离心，去除壁上的残液。
(5)磁铁吸附纳米磁珠,弃上清，用200μl 70％乙醇清洗2-5次。
(6)加入50μl RNase-free H2O，用枪头吹打均匀，室温放置5min。
(7)磁力架吸附纳米磁珠，将含有核酸的上清液转移至一新的离心管中,-30℃保存备备用。
(二)管家基因定量检测
(1)采用SYBR Green法检测咽拭子中所提核酸中的GAPDH基因:反应按照Ace QTM qPCRSYBR Green试剂盒(Nanjing,China)说明书进行。PCR反应体积为20μl，包括Ace QTM qPCRSYBR Green Master Mix 10μl，GAPDH基因上下游引物0.4μl，模板(从咽拭子所提核酸混合物)5μl，用水补足至20μl。以灭菌水为阴性对照。PCR反应条件为预变性95℃、5min，40个循环为95℃变性10s、60℃延伸34s采集荧光信号,检测结果如图2,其PCR产物送上海生工生物工程公司测序验证为GAPDH基因。
(2)采用一步法qRT-PCR法检测咽拭子中所提核酸中的HTN3基因:反应按照Hiscript Ⅱ onestep qRT-PCR试剂盒(Nanjing,China)说明书进行。PCR反应体积为20μl，包括2×one step SYBRGreen Mix 10μl，one step SYBR Green Enzyme Mix 1μl，HTN3基因上下游引物0.4μl，模板(从咽拭子所提核酸混合物)5μl，用水补足至20μl。以灭菌水为阴性对照。PCR反应条件为逆转录50℃30min，预变性95℃、5min，40个循环为95℃变性10s、60℃延伸34s采集荧光信号,检测结果如图3,其PCR产物送上海生工生物工程公司测序验证为HTN3基因。
表3 GAPDH基因与HTN3基因引物序列

Claims (10)

1.一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)在经处理后的呼吸道标本中加入300μl病毒裂解液及6μl RNA助沉剂振荡混匀，置于60℃金属浴中保温10min；
(2)待上述裂解物冷却至室温后，加入纳米磁珠，加入1倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀充分，使核酸与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；
(3)使用70％的乙醇洗去复合物表面蛋白质、脂质及盐离子等杂质；
(4)经洗涤后的纳米磁珠-核酸复合物加入无菌DEPC水，将核酸从磁珠上面洗脱下来,得到含DNA/RNA病毒核酸洗脱液。
2.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(1)所述呼吸道标本包括痰标本、分泌物拭子、肺泡灌洗液。
3.根据权利要求2所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：痰标本或肺泡灌洗液处理方法：加入4倍体积的生理盐水，混匀后取200μl痰液加入1.5ml离心管中，离心5min，弃上清备用，如痰中含较多粘性蛋白，加0.1％DTT液化痰液；分泌物拭子处理方法：加灭菌生理盐水1ml到无菌管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，取200μl移入另一离心管中，离心5min，弃上清备用。
4.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(1)所述的病毒裂解液为2mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，20μg/ml糖原，0.4mol/LDTT，pH为8。
5.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(1)所述的RNA助沉剂为分子生物学级5-30mg/ml丙烯基多聚物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(2)所述的纳米磁珠含量为10mg/ml，纳米磁珠颗粒直径为0.2-1.5μm，纳米磁珠表面具有核壳结构，即超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠。
7.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(2)加入1倍体积无水乙醇与磁珠后，上下颠倒混匀充分，室温放置5分钟，每隔2-3分钟混匀一次。
8.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(3)所述的70％的乙醇用DEPC水配制。
9.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法，其特征在于：步骤(4)所加洗脱液为50μl-200μl无菌DEPC水。
10.根据权利要求1所述的一种共提取DNA/RNA病毒核酸的方法在直接进行PCR及RT-PCR等分子生物学实验研究及检测中的应用，尤其在多重RT-qPCR同时检测DNA病毒和RNA病毒中的应用。
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