CN108094407A - 一种细胞保存液及痰液细胞参考品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组成简单旨在保存细胞中核酸稳定性的细胞保存液以及利用此种细胞保存液制备细胞及痰液参考品的方法，细胞保存液组成为：75％乙醇，0.9％氯化钠，4％RNAsecure，余量为焦碳酸二乙酯处理水。本方法成本低廉、制备方法简单、无毒副作用。利用本方法可在常温条件(20℃)下维持细胞形态正常，同时有效保护细胞内核酸完整性。本发明旨在为痰液或其他组织样本的核酸检测类产品的参考品制备提供参考方法。

Description

一种细胞保存液及痰液细胞参考品的制备方法
技术领域
本方法属于体外细胞中核酸的保存技术领域，涉及一种简单有效的旨在保存细胞中核酸稳定性的细胞保存液及痰液细胞参考品制备的方法。
背景技术
细胞，是生物体基本的结构和功能单位，已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，细胞在生物研究、医学领域方面均有很高的应用价值。目前，肺癌等癌症发病率逐年上升，通过脱落肿瘤细胞进行核酸或基因检测成为医疗诊断技术的热点。离开人体的细胞，或者脱离培养环境的肿瘤细胞，其生理功能和细胞形态结构会发生变化，细胞中的核酸极易被降解，从而失去核酸检测的意义。
痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外。痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前最精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。随着荧光定量PCR以及多重PCR技术在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。痰液的成分复杂，黏蛋白含量高，痰液中的细胞核酸在极短的时间内就会被降解。
针对细胞及组织样本的核酸易降解问题，目前已公开的用于保护细胞及核酸的专利较多，例如中国专利申请文件CN105145545A公开的《用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液》及中国专利申请文件CN104041484A公开的《一种细胞保存液》等，这些专利涉及的技术均可用于保护组织或细胞的核酸。然而，这些专利中涉及的保护剂成分比较复杂，如含有防腐剂、缓冲剂、螯合剂、酶抑制剂、固定剂等，保护剂成分多且成本高，不适合临床广泛使用。
此外，针对痰液样本的核酸保护领域，已申请的相似发明专利：中国专利申请文件CN104263721A公开的《一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法》主要存在以下不足：其专利所述，仅在痰纸上浸润了的核酸保护液，浸润的保护液含量有限，不能保证痰液样本与核酸保护液充分接触，对痰液中核酸的保护效果一般。
发明内容
为了解决体外细胞以及其他组织样本(如痰液等)核酸易降解且目前常规细胞保存液配方复杂成本高的问题，本发明提供了一种组成十分简单的细胞保存液以及利用此种细胞保存液制备细胞及痰液参考品的方法。本方法成本低廉、制备方法简单、无毒副作用。利用本方法可在常温条件(20℃)下维持细胞形态正常，同时有效保护细胞内核酸完整性。本发明还旨在为痰液或其他组织样本核酸检测类产品的参考品制备提供参考方法。
本发明的技术方案是：
本发明提供一种细胞保存液，由以下重量百分数的成分组成：75％乙醇，0.9％氯化钠，4％RNAsecure，余量为DEPC处理水。
本发明还提供一种痰液细胞参考品的制备方法，包括以下步骤：
步骤a，痰液参考品：
①取痰液样本，分别加入5-10ml痰溶解液，37℃振荡10min，使得痰液完全溶解；
②8000r/min离心5min，弃上清；
③沉淀重悬于2ml如权利要求1所述的细胞保存液，合并到一个50ml离心管中，混匀；
步骤b，痰液细胞参考品：
①取一定浓度的1-3ml细胞原液，12000r/min离心1min，弃上清；
②向上述沉淀中加入1ml细胞保存液，充分混匀后得到细胞工作液；
③利用细胞保存液梯度稀释细胞工作液得到痰液细胞参考品。
进一步，所述痰溶解液由以下重量百分数的成分组成：
10％-30％乙醇，10-100mMβ-巯基乙醇或二硫苏糖醇，1％-5％RNAsecure，余量为PBS缓冲液。
进一步，所述细胞保存液使用前在60℃条件下预热10分钟。
本发明的原理如下：细胞保存液中乙醇的作用是固定细胞，减少细胞破裂导致核酸流失，同时还具有抑制核酸酶的作用，0.9％氯化钠为细胞提供稳定的渗透压环境，RNAsecure可抑制RNA酶活性，防止RNA被酶解；细胞保存液的溶剂为焦碳酸二乙酯处理水，即不含RNA酶的溶剂。
痰溶解液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的主要作用是破坏痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，从而液化痰液，聚集细胞；PBS缓冲液提供生理缓冲，防止细胞破裂；乙醇可固定细胞，减少细胞破裂导致核酸流失。RNAsecure可抑制RNA酶活性，防止RNA被酶解。因此，本发明通过大量研究得到的细胞保存液可保护细胞中的核酸完整性，痰溶解液可液化痰液并富集细胞，利用细胞保存液制备细胞和痰液参考品，可以稳定地检测出各参考品中的核酸。
本发明的有益效果是：提供了一种组成简单旨在保存细胞中核酸稳定性的细胞保存液以及利用此种细胞保存液制备细胞及痰液参考品的方法，本方法成本低廉、制备方法简单、无毒副作用。利用本方法可在常温条件(20℃)下维持细胞形态正常，同时有效保护细胞内核酸完整性。本发明为痰液或其他组织样本的核酸检测类产品的参考品制备提供参考方法。
附图说明
图1为实施例1中A549细胞在加入细胞保存液后于室温条件下(20℃)放置15分钟、5天、15天和20天后在显微镜下的细胞形态图。
具体实施方式
实施例中所用到的痰液样本由浙江今复康生物科技有限公司委托浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科按临床标准取痰程序采集，参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，通过目测，黄色、灰色、铁锈色、血性、脓性、稠厚，呈现团块状的标本为接收标准。肺癌阳性痰液由临床确诊的肺癌患者采集得到。肺癌阴性痰液由临床确诊的非肺癌患者采集得到。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中以及肺癌细胞A549能够检测到hTERT mRNA。相反的，非肺癌患者及正常人的痰液中无端粒酶表达，因此非肺癌患者及正常人的痰液中不能够检测到hTERT mRNA。核酸检测采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERT mRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或No Ct时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERT mRNA。
实施例1：利用细胞保存液可在常温条件下(20℃)保存细胞15天
步骤1：取1ml细胞浓度为2×106/ml的A549细胞原液，12000r/min离心1min，弃上清；
步骤2：加入1ml细胞保存液，混匀，在常温条件下(20℃)放置；
步骤3：分别于放置15分钟、5天、15天和20天后在显微镜下观察细胞形态，结果见图1。由图1可知，在室温条件下(20℃)放置15分钟、5天、15天后的细胞仍可保持完整的饱满形态，后放置20天后的细胞明显已裂解，细胞饱满形态消失。
因此实验结果表明：利用细胞保存液可在常温条件下(20℃)保存细胞15天。
实施例2：阳性痰液参考品检测
步骤1：分别领取20例临床病理确诊的肺癌患者的痰液，分别加入10ml痰溶解液，37℃振荡10min，使得痰液完全溶解，8000r/min离心5min，弃上清；
步骤2：将上步得到的沉淀重悬于2ml细胞保存液，合并到一个50ml离心管中，混匀，按50μl/管转移至10支1.5ml阳性参考品离心管中，分别编号1-10；
步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示：本方法制得的阳性参考品检测结果均为阳性，说明阳性痰液参考品的核酸保存良好。
实施例3：细胞精密度参考品检测
步骤1：取1ml细胞浓度为2×106/ml的A549细胞原液，12000r/min离心1min，弃上清，向沉淀中加入1ml细胞保存液，充分混匀后得到得到2×106/ml的A549细胞工作液；
步骤2：取50μl步骤1得到的工作液，加入450μl细胞保存液，充分混匀后得到2×105/ml的A549细胞工作液，按50μl/管转移至10支1.5ml高浓度精密度参考品离心管中，分别编号1-10；
步骤3：取50μl步骤2得到的工作液，加入450μl细胞保存液，充分混匀后得到2×104/ml的A549细胞工作液，按50μl/管转移至10支1.5ml中浓度精密度参考品离心管中，分别编号1-10；
步骤4：取50μl步骤3得到的工作液，加入450μl细胞保存液，充分混匀后得到2×103/ml的A549细胞工作液，按50μl/管转移至10支1.5ml低浓度精密度参考品离心管中，分别编号1-10；
步骤5：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2、3、4得到的样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示：本方法制得的高/中/低浓度精密度参考品检测结果均为阳性，且Ct值的变异系数(CV，％)均≤10.0％，说明细胞参考品的核酸保存良好且保存效果稳定。
实施例4：细胞检测限参考品检测
步骤1：取100μl上述精密度参考品制备方法中步骤4得到的低浓度精密度参考品，加入900μl细胞保存液，充分混匀后得到2×102/ml的A549细胞工作液，按50μl/管转移至20支1.5ml检测限参考品离心管中，分别编号1-20；
步骤2：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤1得到的样品进行检测，经过杂交、洗涤、洗脱、酶切和PCR扩增等步骤，实验结果见下表。结果显示：本方法制得的检测限参考品检测结果为阳性率达到95％，符合试剂盒性能评价要求，说明细胞参考品的核酸保存良好且保存效果稳定。

Claims (4)

1.细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液由以下重量百分数的成分组成：75％乙醇，0.9％氯化钠，4％RNAsecure，余量为焦碳酸二乙酯处理水。
2.一种痰液细胞参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤a，痰液参考品：
①取痰液样本，分别加入5-10ml痰溶解液，37℃振荡10min，使得痰液完全溶解；
②8000r/min离心5min，弃上清；
③沉淀重悬于2ml如权利要求1所述的细胞保存液，合并到一个50ml离心管中，混匀；
步骤b，痰液细胞参考品：
①取一定浓度的1-3ml细胞原液，12000r/min离心1min，弃上清；
②向上述沉淀中加入1ml细胞保存液，充分混匀后得到细胞工作液；
③利用细胞保存液梯度稀释细胞工作液得到痰液细胞参考品。
3.根据权利要求2所述的一种痰液参考品的制备方法，其特征在于，所述痰溶解液由以下重量百分数的成分组成：10％-30％乙醇，10-100mMβ-巯基乙醇或二硫苏糖醇，1％-5％RNAsecure，余量为PBS缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种痰液参考品的制备方法，其特征在于，所述细胞保存液使用前在60℃条件下预热10分钟。
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