CN110616218A - 血液rna保存液及其制备方法、血液rna保存管、保存提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及RNA保存技术领域,特别涉及血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法。该血液RNA保存液由如下组分组成:异硫氰酸胍2~2.5M;KCl 0.1~0.3M;EDTA 1~3mM;Tween 201vt%~1.5vt%;8‑羟基喹啉0.1~0.2M;巯基乙醇1vt%~1.3vt%;水补足;血液RNA保存液的pH值为4.5~5.2。本发明血液RNA保存液可有效抑制RNA的降解。本申请的血液RNA保存液和保存管可以使血液中RNA在4℃保存至少一周不降解,‑20℃保存至少4周不发生降解。
Description
技术领域
本发明涉及RNA保存技术领域,特别涉及血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法。
背景技术
全血是临床上最容易获得的人体标本,常用来做各种检测和研究。RNA在人类的许多的生理和病理过程中都发挥着至关重要的作用。高质量RNA可以满足文库构建、RT-PCR、Q-PCR、转录组测序、Dot Blot、芯片分析等。然而,RNA本身为单链,极不稳定,且血液中大部分的核酸存在于白细胞中,而白细胞在血细胞中含量最少,并且血液中含有丰富的RNA酶,同时许多外源性的因素如外源性的RNA酶,保存和提取过程都可能影响RNA的实验结果。这就使血液RNA保存和提取非常棘手,常常因时间过久而发生降解。因此寻找方便快捷的血液RNA保存和提取方法就显得非常重要。
近年来,RNA保存方法也逐渐由分离白膜层替换为专用的静脉真空采血管,主要是因为分离白膜层的过程较为繁琐,需要多次离心,加入RNAlater保护剂进行高盐脱水导致复性困难,提取效果差。随着生物技术的不断发展,RNA的提取方法也有了很大的改进,但RNA的提取效率还需要进一步优化。
公开号为CN105506129A的专利公开了一种RNA保存液配方(100mL)及制备方法为:1)用量筒量取40mLDEPC·H2O加入灭菌烧杯中;2)吸取0.1mLβ-巯基乙醇加入烧杯中,并搅拌均匀;3)吸取2.5mL8-羟基喹啉(2mol/L)加入烧杯中,并搅拌均匀;4)称取16.4g的醋酸钠加入烧杯中,并搅拌溶解;5)称取10g的十二烷基肌氨酸钠加入烧杯中,并搅拌溶解;6)称取15g的异硫氰酸胍加入烧杯中,并搅拌溶解;7)称取0.12g的Tris-HCl加入烧杯中,并搅拌溶解;8)吸取10mLENDA(0.5mol/L)加入烧杯中,并搅拌均匀;9)吸取0.5mLTriton-100加入烧杯中,并搅拌均匀;10)吸取5mL丙三醇加入烧杯中,并搅拌均匀;11)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中,并搅拌溶解;12)用浓盐酸调pH值至4.8~5.2;13)把已经调好pH的溶液转移到100mL的容量瓶中,用DEPC·H2O定容到100mL;14)把配制好的溶液置于试剂瓶中,密封后高压灭菌,室温备用。但该RNA保存液对RNA的保存效果较差,无法有效抑制RNA的降解。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法。该血液RNA保存液可有效抑制RNA的降解。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种血液RNA保存液,该血液RNA保存液由如下组分组成:
血液RNA保存液的pH值为4.5~5.2。
作为优选,血液RNA保存液由如下组分组成:
作为优选,血液RNA保存液的pH值为6.0。
本发明还提供了该血液RNA保存液的制备方法,将异硫氰酸胍、KCl、EDTA、Tween20、8-羟基喹啉、巯基乙醇溶于水中,pH值调至4.5~5.2。
本发明还提供了一种血液RNA保存管,包括采血管和上述血液RNA保存液。
本发明还提供了一种血液RNA的保存方法,将血液置于上述血液RNA保存液或血液RNA保存管中,混匀,保存。
作为优选,混匀为震荡20~40s。
在本发明提供的具体实施例中,混匀为震荡30s。
作为优选,保存的温度为-80℃~4℃。
作为优选,血液与血液RNA保存液的体积比为1:1。
本发明还提供了一种RNA提取试剂盒,包括上述血液RNA保存液或血液RNA保存管,以及RNA提取试剂;
所述RNA提取试剂包括提取液A、提取液B和蛋白洗脱液RW;提取液A为氯仿和HCl的混合物,氯仿与HCl体积比为1000:1;提取液B为含有0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl的异丙醇溶液;蛋白洗脱液RW为无RNase的75%乙醇水溶液。
本发明还提供了一种RNA的提取方法,包括如下步骤:
步骤1:将新鲜血液置于上述血液RNA保存液或血液RNA保存管中,混匀,保存;
步骤2:将步骤1的血液混合物与不含钙离子和镁离子的PBS缓冲液混匀,过滤,离心;
步骤3:取步骤2所得沉淀物,与裂解液混合,超声破碎细胞,静置;
步骤4:加入提取液A混匀,静置,离心,取上清液;提取液A为氯仿和HCl的混合物,氯仿与HCl体积比为1000:1;
步骤5:加入提取液B混匀,离心,取沉淀物;提取液B为含有0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl的异丙醇溶液;
步骤6:加入蛋白洗脱液RW混匀,蛋白洗脱液RW为无RNase的75%乙醇水溶液,离心,将沉淀物干燥,溶于无RNase的水中。
本发明提供了血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法。该血液RNA保存液由如下组分组成:异硫氰酸胍2~2.5M;KCl 0.1~0.3M;EDTA 1~3mM;Tween20 1vt%~1.5vt%;8-羟基喹啉0.1~0.2M;巯基乙醇1vt%~1.3vt%;水补足;血液RNA保存液的pH值为4.5~5.2。本发明具有的技术效果为:
本发明血液RNA保存液可有效抑制RNA的降解。本申请的血液RNA保存液和保存管可以使血液中RNA在4℃保存至少一周不降解,-20℃保存至少4周不发生降解。
本发明血液RNA提取方法的RNA分离得率是市场上同类型试剂盒效率3倍。使用本发明保存管及配套RNA提取试剂盒,能够获得更多且质量更好的RNA,所提RNA经质检报告验证可以用作多项RNA实验。
附图说明
图1示试验例1中本试剂盒与市场上同类型试剂盒的RNA分离得率;
图2示试验例2中血液分别于4℃保存1周和-20℃保存4周的质检效果;
图3示试验例3中Agilent 2100检测采用本发明保存管-20℃保存4周后的RNA完整性;
图4示试验例4中血液分别-80℃下保存4周和-20℃下保存4周的质检效果。
具体实施方式
本发明公开了血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的血液RNA保存液及其制备方法、血液RNA保存管、保存提取方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
1、RNA保存管实验步骤:
(1)将新鲜血液抽取3mL至RNA保存管内,RNA保存管内RNA稳定液配方为:
调节pH至6.0。
(2)将采血管放在离心机上充分震荡30s;
(3)将采血管放在4℃、-20℃或-80℃冰箱保存,用于后续提取。
2、RNA提取实验步骤:
(1)如果样品是冷冻的,可以在常温中速溶。
(2)将血液从采血管内导入50mL离心管,加入3mL 1×PBS(Ca2+/Mg2+-free)到12mL,充分震荡30s,用过滤筛除杂到新的50mL离心管。
(3)离心3000g(rcf)30min,4℃,轻轻去除上清。
(4)反扣管子到吸水纸1-2分钟,吸干净污渍。
(5)加入1mL裂解液(RNAiso Plus+NaOH),转至RNase-Free离心管,低功率超声5-10s,静置10min。
(6)加入0.2mL提取液A(氯仿+HCl),混匀15s(充分混匀),放置5min。
(7)13000g 4℃离心15min,取上清约600μL到新的RNase-Free离心管中。
(8)加入0.5mL提取液B(异丙醇+0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl),充分混匀,13000g 4℃离心10min。
(9)加入1mL蛋白洗脱液RW(75%乙醇+RNase-Free ddH2O;使用前放4℃降温冷却1h),充分混匀,13000g 4℃离心10min(可重复一次)。
(10)室温干燥5-10min,加入30μL RNase-Free ddH2O,混匀后得到RNA溶液,-80℃保存。
试验例1
将本发明实施例1血液RNA保存管和提取方法与市场同类型试剂盒Thermo FisherScientific公司的RNA保存管TEMPUS BLOOD RNA TUBE(货号4342792)及配套RNA提取试剂盒TEMPUS SPIN RNA ISOLATION KIT(货号4380204)进行对比。
试验方法:使用两种RNA保存管采血后置于4℃保存1周后,利用其配套试剂盒进行RNA提取,最后均加入50μL无RNA酶灭菌水溶解RNA,使用Nanodrop 2000进行RNA浓度测定,计算得到具体数值进行分析。
结果如图1所示。结果显示:本试剂盒与市场上同类型试剂盒相比,RNA分离得率是市场上同类型试剂盒效率3倍。
使用本采血管及配套RNA提取试剂盒,能够获得更多且质量更好的RNA,所提RNA经质检报告验证可以用作多项RNA实验。
试验例2
同一血液样本采用实施例1血液RNA保存管分别于4℃保存1周和-20℃保存4周,点样量均为5μL,提取结果质检效果见表1和图2,图2中,条带①为血液在4℃储存1周后的RNA分离后质检结果,条带②为血液在-20℃储存4周后的RNA分离后质检结果。
结果显示RNA在4℃保存1周和在-20℃保存4周均未发生明显降解,可见本申请的采血管可以使血液中RNA在4℃保存至少一周不降解,-20℃保存至少4周不发生降解,使用本采血管可以使血液中RNA得以长期保存而不降解。
而常规采血管(三价牌)储存血液4℃保存会在24h后就会发生降解,-20℃低温保存最多1周即会发生降解(表2)。
表1.本发明血液RNA保存管在4℃下保存1周及-20℃下保存4周提取结果
表2.常规血液RNA保存管在4℃下保存1周及-20℃下保存4周提取结果
试验例3
通过Agilent 2100检测采用本发明保存管-20℃保存4周后的RNA完整性,结果见图3。结果显示Agilent 2100检测到4周后RNA的RIN值为7.1,其完整性良好。
试验例4
将本发明保存管与公开专利(CN105506129A)实施例1的保存管进行对比,该对比专利实施例1的RNA保存液配方(100mL)及制备方法为:
1)用量筒量取40mL DEPC·H2O加入灭菌烧杯中;
2)吸取0.1mLβ-巯基乙醇加入烧杯中,并搅拌均匀;
3)吸取2.5mL 8-羟基喹啉(2mol/L)加入烧杯中,并搅拌均匀;
4)称取16.4g的醋酸钠加入烧杯中,并搅拌溶解;
5)称取10g的十二烷基肌氨酸钠加入烧杯中,并搅拌溶解;
6)称取15g的异硫氰酸胍加入烧杯中,并搅拌溶解;
7)称取0.12g的Tris-HCl加入烧杯中,并搅拌溶解;
8)吸取10mL ENDA(0.5mol/L)加入烧杯中,并搅拌均匀;
9)吸取0.5mL Triton-100加入烧杯中,并搅拌均匀;
10)吸取5mL丙三醇加入烧杯中,并搅拌均匀;
11)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中,并搅拌溶解;
12)用浓盐酸调pH值至4.8~5.2;
13)把已经调好pH的溶液转移到100mL的容量瓶中,用DEPC·H2O定容到100mL;
14)把配制好的溶液置于试剂瓶中,密封后高压灭菌,室温备用。
保存条件分别为-80℃下保存4周、-20℃下保存4周。然后采用实施例RNA提取方法提取RNA并进行电泳试验,点样量均为5μL。试验结果见图4。其中,泳道1示公开专利保存管-80℃保存4周,泳道2示本保存管-80℃保存4周,泳道3示公开专利保存管-20℃保存4周,泳道4示本保存管-20℃保存4周。
结果显示:泳道1和3的RNA出现不同程度的降解,而泳道2和4(本保存管)不管在-20℃还是-80℃均未出现降解情况,本发明保存管效果更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种血液RNA保存液,其特征在于,所述血液RNA保存液由如下组分组成:
所述血液RNA保存液的pH值为4.5~6.2。
2.根据权利要求1所述的血液RNA保存液,其特征在于,所述血液RNA保存液由如下组分组成:
所述血液RNA保存液的pH值为6.0。
3.权利要求1或2所述血液RNA保存液的制备方法,其特征在于,将异硫氰酸胍、KCl、EDTA、Tween 20、8-羟基喹啉、巯基乙醇溶于水中,pH值调至4.5~5.2。
4.一种血液RNA保存管,其特征在于,包括采血管和权利要求1或2所述血液RNA保存液。
5.一种血液RNA的保存方法,其特征在于,将血液置于权利要求1或2所述的血液RNA保存液或权利要求4所述的血液RNA保存管中,混匀,保存。
6.根据权利要求5所述的保存方法,其特征在于,所述混匀为震荡20~40s。
7.根据权利要求5所述的保存方法,其特征在于,所述保存的温度为-80℃~4℃。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的保存方法,其特征在于,所述血液与所述血液RNA保存液的体积比为1:1。
9.一种RNA提取试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的血液RNA保存液或权利要求4所述的血液RNA保存管,以及RNA提取试剂;
所述RNA提取试剂包括提取液A、提取液B和蛋白洗脱液RW;提取液A为氯仿和HCl的混合物,氯仿与HCl体积比为1000:1;提取液B为含有0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl的异丙醇溶液;蛋白洗脱液RW为无RNase的75%乙醇水溶液。
10.一种RNA的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:将新鲜血液置于权利要求1或2所述的血液RNA保存液或权利要求4所述的血液RNA保存管中,混匀,保存;
步骤2:将步骤1的血液混合物与不含钙离子和镁离子的PBS缓冲液混匀,过滤,离心;
步骤3:取步骤2所得沉淀物,与裂解液混合,超声破碎细胞,静置;
步骤4:加入提取液A混匀,静置,离心,取上清液;提取液A为氯仿和HCl的混合物,氯仿与HCl体积比为1000:1;
步骤5:加入提取液B混匀,离心,取沉淀物;提取液B为含有0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl的异丙醇溶液;
步骤6:加入蛋白洗脱液RW混匀,蛋白洗脱液RW为无RNase的75%乙醇水溶液,离心,将沉淀物干燥,溶于无RNase的水中。
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