CN102660537A - 一种从鸡血中提取大量高纯度dna的方法 - Google Patents

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霍金龙
刘丽仙
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Abstract

本发明公开了一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法，包括以下步骤：吸取解冻的DNA保存液保存的鸡血样品到含试剂X的离心管中；用移液枪反复垂悬，直到使原血样变为澄清的液体状；离心，弃掉上清液；加入试剂Y，轻轻悬浮上一步离心后的沉淀物；加入Rnase A，混匀后，37℃温浴30min；加入5mol/L高氯酸钠，手动振荡混合10min；水浴，期间每隔5min手工晃动一次；加入预冷的三氯甲烷，混合5min；离心，吸取上清到另一离心管中；加入等体积的异丙醇，缓慢摇动，即可见絮状DNA；用预冷的75％乙醇洗涤2次，晾干，用适量的TE溶解，4℃存放一周，转至-20℃长期保存；本发明提取DNA耗时较短、提取的DNA样品纯度高，浓度大、质量好，能完全满足下游分子生物学实验的要求。

Description

一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法
技术领域
本发明涉及，尤其涉及的是一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法。
背景技术
提取高质量、高浓度和高纯度的基因组DNA是开展分子生物学实验的重要技术步骤，从动物血液中提取基因组DNA，具有不杀死动物，经济实用等优点。常规血液DNA的提取方法多采用苯酚氯仿法提取，这种方法具有耗时长、实验试剂毒性大，操作复杂等缺点。而试剂盒提取费用相对较高，提取的DNA纯度和浓度均低，只适合近期实验的需要，提取的DNA量较少不利于多次反复使用；且由于提取量少，提取的DNA容易降解不易长期保存利用，时间稍长就不能进行下游PCR扩增反应。为了更有效、快速地提取高质量高浓度的鸡血基因组DNA，在借鉴和改进前人工作的基础上，研究建立了一种从鸡血中快速大量提取高质量基因组DNA的方法，现将试验过程报道如下。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法。
本发明的技术方案如下：
一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法，包括以下步骤：吸取100μl解冻的DNA保存液保存的鸡血样品100μl到含300μl试剂X的1.5ml离心管中；用移液枪反复垂悬，直到使原血样变为澄清的液体状；4000rpm离心5min，弃掉上清液；加入1ml的试剂Y，轻轻悬浮上一步离心后的沉淀物；加入5μl的Rnase A，混匀后，37℃温浴30min；加入250μl的5mol/L高氯酸钠，手动振荡混合10min；55℃水浴20min，期间每隔5min手工晃动一次；加入300μl预冷的三氯甲烷，混合5min；12000r/min离心5min，吸取上清到另一离心管中；加入等体积的异丙醇，缓慢摇动，即可见絮状DNA；用预冷的75％乙醇洗涤2次，晾干，用适量的TE溶解，4℃存放一周，转至-20℃长期保存；
所述的DNA保存液：TrisCl 3.03g，，Na2EDTA 9.31g，SDS 2.50g加水搅拌溶解，定容至250ml；
所述的试剂X配制方法：将1mol/LTrisCl(pH 8.0)，1mol/LMgCl2，体积百分比10％的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的终浓度为：10mmol/L Tris·Cl；0.32mol/L蔗糖；5mmol/L MgCl2；1％Triton X-100；然后用NaOH调整pH值至8.0，高压灭菌；
所述的试剂Y配制方法：将1mol/LTrisCl、pH 8.0，0.5mol/LNa2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固体和水，使混合液中各成分的终浓度为：400mmol/L TrisCl；60mmol/L Na2EDTA；150mmol/L NaCl。然后高压灭菌。再加入一定量的10％SDS，使SDS在试剂Y混合液中的质量百分比浓度为1％。
采用上述方案提取DNA耗时较短、提取的DNA样品纯度高，A260nm/A280nm在1.696-1.857，浓度大(100μl鸡血可提取46.317μg DNA)、质量好，能完全满足下游分子生物学实验的要求。
附图说明
图1为2％琼脂糖凝胶电泳检测鸡血中提取的基因组DNA结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本发明的方法为一种快速、高效的从鸡血中提取高纯度、大浓度的基因组DNA的方法。
1、鸡血样品的制备
鸡翅下静脉采血后与等体积的DNA保存液(配方见主要试剂的配制部分)混匀，-20℃低温保存。
2、提取DNA的主要试剂及配制
所用试剂为：TrisCl，Sucrose，MgCl2，Triton X-100，NaOH，Na2EDTA，NaCl，SDS，NaClO4·H2O，RNaseA。
(1)DNA保存液：TrisCl 3.03g，，Na2EDTA 9.31g，SDS 2.50g加水搅拌溶解，定容至250ml。
(2)1mol/LTrisCl：在800ml水中溶解121g Tris碱，用浓盐酸调pH值到8.0，加水至1L。
(3)1mol/L MgCl2：20.3g MgCl2·6H2O加水至100ml。
(4)0.5mol/LNa2EDTA(pH 8.0)：在800ml水中加入186.1g的EDTA，用NaOH(约20g)调pH值至8.0，定容至1L。高压灭菌。
(5)10％SDS：在900ml水中加入100g SDS，加热至68℃助溶，加HCl调pH为7.2，定容至1L，用滤器过滤以除菌。
(6)试剂X配制：将1mol/L TrisCl(pH 8.0)，1mol/L MgCl2，10％(体积百分比)的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的固体蔗糖(Sucrose)，使混合液中各成分的终浓度为：10mmol/L Tris·Cl；0.32mol/L Sucrose 5mmol/L MgCl2；1％TritonX-100。然后用NaOH调整pH值至8.0，高压灭菌。
(7)试剂Y配制：将1mol/LTrisCl(pH 8.0)，0.5mol/LNa2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固体和水，使混合液中各成分的终浓度为：400mmol/L TrisCl；60mmol/L Na2EDTA；150mmol/L NaCl。然后高压灭菌。再加入一定量的10％SDS，使SDS在试剂Y混合液中的质量百分比浓度为1％。
(8)5mol/L高氯酸钠(NaClO4)：70.24g NaClO4·H2O溶解于100ml水中。
(9)10mg/ml RNaseA：100mg RNaseA加水到10ml，分装后贮存在-20℃冰箱中。
(10)TE(pH 8.0)：2ml 1.0mol/L TrisCl(pH 8.04)和400μl 0.5mol/LNa2EDTA(pH 8.0)混合，加水定容至200ml。高压灭菌。
3基因组DNA的提取方法与步骤
吸取100μl解冻的DNA保存液保存的鸡血样品100μl到含300μl试剂X的1.5ml离心管中；用移液枪反复垂悬，直到使原血样变为澄清的液体状；4000rpm离心5min，弃掉上清液；加入1ml的试剂Y，轻轻悬浮上一步离心后的沉淀物；加入5μl的RnaseA，混匀后，37℃温浴30min；加入250μl的5mol/L高氯酸钠，手动振荡混合10min；55℃水浴20min，期间每隔5min手工晃动一次；加入300μl预冷的三氯甲烷，混合5min；12000r/min离心5min，吸取上清到另一离心管中；加入等体积的异丙醇，缓慢摇动，即可见絮状DNA；用预冷的75％(v∶v)乙醇洗涤2次，晾干，用100-200μl的TE溶解，4℃存放一周，转至-20℃长期保存。
4提取的DNA的浓度和纯度的检测结果
参考图1，图1为2％琼脂糖凝胶电泳检测鸡血中提取的基因组DNA结果，可见琼脂糖凝胶电泳检测条带单一，清晰，无拖尾及挂孔等现象，表明提取的DNA纯度较高。
参考表1，采用本方法提取的鸡血基因组DNA的纯度A260nm/A280nm在1.696-1.857之间，平均值为1.791，本方法用鸡血量仅100μl，但可一次提取到31.3-58.2μg左右的基因组DNA，平均值为46.317。利用提取的鸡血DNA进行PCR特异性基因扩增，结果显示，PCR扩增效果理想，该方法提取的DNA样品能满足鸡基因组方面研究的要求。与传统的苯酚-氯仿法相比，该方法提取DNA耗时短(平均1.2h)、提取的DNA纯度高、浓度大、实验试剂以及成本低，是一种较好的鸡血DNA提取方法。
表1本方法提取的100份鸡血基因组DNA纯度和提取总量结果
Figure BSA00000708147900041
Figure BSA00000708147900051
Figure BSA00000708147900071
Figure BSA00000708147900081
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种从鸡血中提取大量高纯度DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：吸取100μl解冻的DNA保存液保存的鸡血样品100μl到含300μl试剂X的1.5ml离心管中；用移液枪反复垂悬，直到使原血样变为澄清的液体状；4000rpm离心5min，弃掉上清液；加入1ml的试剂Y，轻轻悬浮上一步离心后的沉淀物；加入5μl的RnaseA，混匀后，37℃温浴30min；加入250μl的5mol/L高氯酸钠，手动振荡混合10mm；55℃水浴20min，期间每隔5min手工晃动一次；加入300μl预冷的三氯甲烷，混合5min；12000r/min离心5min，吸取上清到另一离心管中；加入等体积的异丙醇，缓慢摇动，即可见絮状DNA；用预冷的75％乙醇洗涤2次，晾干，用适量的TE溶解，4℃存放一周，转至-20℃长期保存；
所述的DNA保存液：TrisCl 3.03g，，Na2EDTA9.31g，SDS 2.50g加水搅拌溶解，定容至250ml；
所述的试剂X配制方法：将1mol/LTrisCl(pH 8.0)，1mol/LMgCl2，体积百分比10％的Triton X-100按比例混合，再加入一定量的蔗糖，使混合液中各成分的终浓度为：10mmol/L Tris·Cl；0.32mol/L蔗糖；5mmol/L MgCl2；1％Triton X-100；然后用NaOH调整pH值至8.0，高压灭菌；
所述的试剂Y配制方法：将1mol/L TrisCl、pH 8.0，0.5mol/L Na2EDTA按比例混合，再加入一定量的NaCl固体和水，使混合液中各成分的终浓度为：400mmol/LTrisCl；60mmol/L Na2EDTA；150mmol/L NaCl。然后高压灭菌。再加入一定量的10％SDS，使SDS在试剂Y混合液中的质量百分比浓度为1％。
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