CN103966201B - 基于样品高效保鲜的提取水生植物dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于样品高效保鲜的提取水生植物DNA的方法，涉及分子生物学领域中提取水生植物DNA的方法。本方法主要是：放弃硅胶保存植物样品的方式，将水生植物新鲜叶片浸入到CTAB溶液中，加入β-巯基乙醇防止氧化，常温下保存。分别在10d、20d和30d后提取叶片的总DNA：经常温研磨、65℃水浴、氯仿和异戊醇萃取、-20℃无水乙醇沉淀后，得到絮状DNA沉淀物；75%乙醇洗涤和室温干燥后，加TE缓冲液溶解DNA，于-20℃保存备用。本发明主要针对水生植物提供了一种新型简便的样品保存方法，所获得的DNA纯度高，产量大。因此，本发明适用于水生植物基因组测序等方面研究所需高质量DNA的提取。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域中提取水生植物DNA的方法，尤其涉及一种基于样品高效保鲜的提取水生植物DNA的方法，具体涉及以两种不同生活型的四种大型水生植物的叶片为材料、高效提取高质量水生植物DNA的方法。
背景技术
大型水生植物是草型湖泊的主要初级生产者之一，在湖泊中不仅具有为许多草食性动物提供食物，改善水质和增加水环境稳定性的功能，并且具有较高的观赏价值。近年来，随着高多态性的分子标记技术的开发及居群遗传统计学方法的发展，在研究水生植物的遗传变异和种群动态上取得了较大的发展；而且基于DNA分子标记的方法越来越广泛地得到应用，如微卫星，又称简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)，扩增限制性片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)等。
DNA的提取和纯化是完成分子遗传学和分子标记实验的基础。尤其是野外采样或不能及时对新鲜样品进行DNA提取时，样品的保存显得尤为重要。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法(包括磨样、裂解、萃取、沉淀DNA，去除RNA等过程)。传统CTAB法是将植物新鲜叶片洗净放入变色硅胶中进行干燥，然后对DNA进行提取。使用此方法提取的DNA量比较少，对样品需求量大；同时在野外需要携带大量的硅胶，使得样品的携带和运输十分不便。
此外，水生植物的样品含水量高，在野外采样中样品的保存更为不易，使用硅胶保存需要更换多次。因此，迫切需要一种高效保存植物样品并能高产量提取高质量DNA用于水生植物的遗传学研究和基因测序工作的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的问题和不足，提供一种基于样品高效保鲜的提取水生植物DNA的方法。
本发明的目的是这样实现的：
基于样品高效保鲜的提取水生植物DNA的方法(简称本方法)
本方法的样品分别是海菜花、光叶眼子菜、睡莲和菱四种水生植物的新鲜叶片，每一种实验材料的提取均包括下列步骤：
①称取0.3g的实验材料放入1.5mL的离心管中，加入800μL的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，并加入2.5μL的β-巯基乙醇，将叶片完全浸没，常温下保存；
②分别在10d、20d和30d后将样品和样品保存液(CTAB溶液)一起转入研钵，加入0.1g的石英砂，常温研磨成细浆转入2mL离心管中，65℃水浴1h，每15min摇晃一次；
③在12000rpm下常温离心5min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入750μL的体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，充分混匀后，在摇床上摇晃10min，常温12000rpm离心5min，再重复抽提1次；
④经过两次抽提后的上清液转入新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，然后加入两倍体积的提前预冷到-20℃的无水乙醇，置于-20℃冰柜1-3h，让DNA沉淀充分析出；
⑤常温12000rpm离心5min，然后倾斜离心管，小心倒出上清液，加入1mL的75％的乙醇，漂洗1-2次，每次30-60min，倒干酒精；
⑥常温10000rpm离心5min，加入50μL无水乙醇洗涤5min，离心倒去乙醇，将离心管置于超净工作台上3-4h，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；
⑦向离心管中加50μL的1×TE缓冲液，轻轻摇动，将离心管放入4℃冰箱内过夜使DNA充分溶解，然后加入0.5μL浓度为10μg/mL的RNA酶37℃消化1h，然后将离心管放入-20℃冰柜中保存。
工作机理：
将实验材料直接放入CTAB溶液中保存，加入β-巯基乙醇防止酚氧化成醌，避免褐变，直接常温研磨，65℃水浴充分提取，再经过氯仿：异戊醇的萃取、-20℃无水乙醇沉淀，得到絮状DNA沉淀，最后利用75％的乙醇洗涤DNA沉淀，即得高质量的水生植物的总DNA。本发明可分离到高纯度(少多糖、少多酚、少色素和少蛋白质)、高产量(是传统CTAB法产量的2倍以上)，满足水生植物基因组测序与研究所需要的高质量DNA。
实验证明，与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
①主要针对水生植物提供了一种新型简便的样品保存方法；
②所获得的DNA质量和纯度高，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少；
③所获得的DNA产量是传统CTAB法的2倍以上；
④适用于水生植物基因组测序等方面研究所需高质量DNA的提取。
附图说明
图1是本方法与传统CTAB法所获DNA浓度的对比图，每0.1g样品中；
图2是两种方法提取的DNA的电泳图谱。
缩略语
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵；
EDTA：乙二胺四乙酸；
Tris：三羟甲基氨基甲烷；
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷溶液用盐酸调至pH＝8.0；
NaCl：氯化纳；
PVP-30：聚乙烯醇吡咯烷酮-30；
β-Mercaptoethanol：β-巯基乙醇。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、溶液配制
1、样品保存液(CTAB溶液)(步骤②中)
F、β-Mercaptoethanol，按体积/体积比：2.5μL/800μL＝0.3125％，临用前加入。
配制方法：
a、将前4种组分用超纯水溶解和混合后，将pH调至8.0(1M的NaOH和1M的HCl调节pH)，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa、灭菌20分钟；
b、灭菌后加入1％的PVP-30；
c、使用前加入0.3125％％的β-巯基乙醇。
2、TE缓冲液(步骤⑦中)
Tris-HCl，pH＝8.0：10mM；
EDTA,NaOH调pH＝8.0：1mM；
灭菌后使用。
3、75％乙醇(步骤⑤中)
75％为乙醇在溶液中所占的体积比，具体配制方法为75毫升无水乙醇加超纯水至总体积100毫升。
二、实验结果
将通过本方法获得的水生植物总DNA和通过传统CTAB法获得的总DNA分别置于微量紫外分光光度计(NANODROP8000)上测定DNA浓度，DNA的A260/A280和A260/A230的比值，并对其进行比较，结果如下：
表1：本方法与传统CTAB法所获DNA的A260/A280和A260/A230值的比较
由图1和表1可知，本方法所获得的总DNA量是传统CTAB法的两倍以上，且DNA的A260/A280比值均比传统CTAB法所提取DNA的A260/A280值更接近1.9，本方法提取的DNA的A260/A230值大于传统CTAB法，即通过本方法获得的总DNA不仅在产量上远大于传统CTAB法，而且质量也优于传统CTAB法所得DNA，多酚、多糖、色素及蛋白质等杂质含量较少，DNA纯度较高。
图2为本方法与传统CTAB法获得的DNA经过适当稀释后所得到的琼脂糖凝胶电泳图谱，由图2可见本方法所得DNA凝胶图谱清晰、位置准确、重复性好、杂质少，利于分析。故本发明可作为提取DNA进行水生植物基因组测序与研究的首选方法。
Claims (3)
1.一种基于样品高效保鲜的提取水生植物DNA的方法，其特征在于：
本方法的样品分别是海菜花、光叶眼子菜、睡莲和菱四种水生植物的新鲜叶片，每一种实验材料的提取均包括下列步骤：
①称取0.3g的样品放入1.5mL的离心管中，加入800μL的CTAB溶液，并加入2.5μL的β-巯基乙醇，将叶片完全浸没，常温下保存；
②分别在10d、20d和30d后将样品和样品保存液一起转入研钵，加入0.1g的石英砂，常温研磨成细浆转入2mL离心管中，65℃水浴1h，每15min摇晃一次；
③在12000rpm下常温离心5min，转移上清液到新的1.5mL离心管中，加入750μL的体积比为24∶1的氯仿：异戊醇，充分混匀后，在摇床上摇晃10min，常温12000rpm离心5min，再重复抽提1次；
④经过两次抽提后的上清液转入新的离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液，然后加入两倍体积的提前预冷到-20℃的无水乙醇，置于-20℃冰柜1-3h，让DNA沉淀充分析出；
⑤常温12000rpm离心5min，然后倾斜离心管，小心倒出上清液，加入1mL的75％的乙醇，漂洗1-2次，每次30-60min，倒干酒精；
⑥常温10000rpm离心5min，加入50μL无水乙醇洗涤5min，离心倒去乙醇，将离心管置于超净工作台上3-4h，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；
⑦向离心管中加50μL的1×TE缓冲液，轻轻摇动，将离心管放入4℃冰箱内过夜使DNA充分溶解，然后加入0.5μL浓度为10μg/mL的RNA酶37℃消化1h，然后将离心管放入-20℃冰柜中保存；
所述的样品保存液是：
F、β-Mercaptoethanol，按体积/体积比：2.5μL/800μL＝0.3125％，临用前加入；
配制方法：
a、前4种组分用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa、灭菌20分钟；
b、灭菌后加入1％的PVP-30；
c、使用前加入0.3125％的β-巯基乙醇。
2.按权利要求1所述的提取水生植物DNA的方法，其特征在于：
所述的TE缓冲液是：
Tris-HCl，pH＝8.0：10mM；
EDTA,NaOH调pH＝8.0：1mM；
灭菌后使用。
3.按权利要求1所述的提取水生植物DNA的方法，其特征在于：
所述的75％乙醇是：
乙醇在溶液中所占的体积比，具体配制方法为75毫升无水乙醇加超纯水至总体积100毫升。
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