CN105368816B - 用于从单一植物样品中分离dna、rna和蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，包括步骤：提取液的制备：按照水饱和苯酚：异硫氰酸胍2:1的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷,形成混合液；组织样品的粉碎；组织样品的裂解；RNA、蛋白质、DNA样品的制备。本发明对TRIzol试剂中有效成分进行了改良，选取了非离子表明活性剂TWEEN‑20替换阴离子表明活性剂十二烷基肌氨酸钠，十二烷基肌氨酸钠为阴离子表明活性剂与蛋白质结合会对蛋白质的带电荷产出影响，TWEEN‑20与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。
Description
技术领域
本发明涉及用于分离基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法。更具体地，本发明涉及用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的简单且快速的系统和方法。
背景技术
提取DNA、RNA和蛋白质是分子生物学研究的第一步。随着分子生物学的深入，常常需要对一份样品进行多层次的研究，如：DNA的SNP分析、mRNA的表达量分析以及蛋白质的双向电泳分析等。对许多珍贵植物样品，如：植物突变体等，由于数量少按照传统的方法只能获取到DNA、RNA或蛋白质的一种。此外，不同样品在DNA、RNA和蛋白研究也存在组织差异性，而对实验结果产生影响。建立一套能同步从组织样品中提取DNA、RNA和蛋白的方法有重要实践意义。已报到的试剂中TRIzol试剂具有从同一样品中分离DNA、RNA和蛋白质的功能，但在植物组织样品的分离中存在以下问题：1.DNA分离效果不稳定，在植物样品中分离的量比较少；2.分离的蛋白质纯粹较低，不适用于后续蛋白质组学分析。
植物组织中富含糖类、脂类、色素、酚、醌及其他多种次生代谢产物，这些物质将严重干扰DNA、RNA和蛋白质的纯化。本发明依据TRIzol的基本原理，对其试剂成分进行了改良，提高了分离植物样品的DNA的稳定性，提高了分离蛋白质的纯度，分析表明其分离蛋白质完成适用于后续蛋白质组学分析。
发明内容
本发明提供了用于从单个植物材料中高效、简单地提取基因组DNA、RNA和蛋白质的纯化的方法。
本发明的另一个发明目的是制备一种改良型的TRIzol试剂。
本发明的技术方案是：
一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，所述方法包括步骤：
①.提取液的制备：按照水饱和苯酚:异硫氰酸胍＝2:1(V/W)的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷,使用HCl调节pH7，形成混合液A；
②.组织样品的粉碎
取植物组织样品0.5g，放入灭菌并预冷的研钵中，并加入约50mg PVPP混合，液氮研磨成细粉，将粉末转入离心管；
③.组织样品的裂解
向离心管中加入5ml混合液A，上下混匀10-15s，室温放置5min；按0.2ml氯仿/ml混合液A加入氯仿，按照2％(w/v)DTT,轻微振荡10-15s，室温放置3-4min；在4℃，8000×g条件下离心15min；
离心后混合物分为三层，移取上层水相a至新离心管，用于后续RNA制备；取下层酚相b至另外一个离心管，用于蛋白质提取；剩余部分c用于DNA制备。
④.RNA样品制备
取所述水相a到新离心管，按照0.5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min；在4℃，12000×g条件下离心10min，弃上清；加入1ml 75％乙醇，经DEPC处理悬浮沉淀，4℃,8000×g条件下离心5min，去上清；室温晾干沉淀，加入适量DEPC处理水溶解RNA，-80℃冰箱保存；
⑤.蛋白质样品制备
取所述酚相b到新离心管，按1.5ml异丙醇/ml混合液a加入下层酚相，4℃孵育20min,每5-10min震荡混匀10-20s；4℃，10000×g条件下离心10min；去上清，按2ml洗液/mlTrizol加入蛋白质沉淀物，所述洗液为0.3M盐酸胍/95％乙醇，室温孵育15-20min；4℃，20000×g条件下离心5min，重复2次；最后一次沉淀后，用1ml无水乙醇代替洗液洗涤蛋白；沉淀真空冻干燥，干粉保存于-80℃备用；
⑤.DNA样品制备
在剩余部分c加入65℃的CTAB提取液900μL，65℃水浴15至20min；冷却后加入500μL氯仿和异戊醇，所述氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)，室温，10000×g条件下离心10min；取上清液，加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀；室温，10000×g条件下离心5min，倒掉上清液；用75％酒精清洗，室温干燥1h后溶于TE缓冲液。
一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的改良提取液，其特征在于，所述的提取液的制备为：按照水饱和苯酚:异硫氰酸胍＝2:1(V/W)的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷，使用HCl调节pH7。
本发明的有益效果是：
1.本发明对TRIzol试剂中有效成分进行了改良，选取了非离子表明活性剂TWEEN-20替换阴离子表明活性剂十二烷基肌氨酸钠，十二烷基肌氨酸钠为阴离子表明活性剂与蛋白质结合会对蛋白质的带电荷产出影响，TWEEN-20与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。使用Tris代替醋酸钠/柠檬酸钠组成的混合缓冲剂，醋酸钠和柠檬酸钠为有机盐，将会对最终提取纯化蛋白产生影响。
2.在植物样品粉碎中添加了交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，PVPP是一种大分子有机物，能强烈的吸附植物组织中酚类，醌类等有机物，从而提高了分离成分，尤其是蛋白质的纯度。在分离过程中添加了二硫苏糖醇(DTT)，是一种强还原剂，其不能阻止酚类对蛋白的氧化，但是可以减少蛋白质二硫键的形成，而减少RNA酶、DNA酶和蛋白酶的对目标物的影响。
附图说明
图1是琼台糖凝胶电泳检测提取DNA样品比较的凝胶图像；
图2是琼台糖凝胶电泳检测提取RNA样品比较的凝胶图像；
图3是本发明的水稻幼苗双向电泳图谱；
图4是现有技术的水稻幼苗双向电泳图谱；
图5是本发明的白三叶双向电泳图谱；
图6是现有技术的白三叶双向电泳图谱；
图7是本发明的紫花苜蓿幼苗双向电泳图谱；
图8是现有技术的紫花苜蓿幼苗双向电泳图谱；
图1中左边1,2,3本实施方案分离结果，右边4,5,6为常用的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方案获分离结果；其中1,4为水稻幼苗；2,5为白三叶；3,6为紫花苜蓿幼苗。
图2中左边1,2,3本实施方案分离结果，右边4,5,6为常用的TRIzol试剂盒方案获分离结果；其中1,4为水稻幼苗；2,5为白三叶；3,6为紫花苜蓿幼苗。
具体实施方式
具体地：
1.提取液的制备：按照水饱和酚:异硫氰酸胍＝2:1(v/w)的比例配置成混合液，其后按照2％(V/V)体积加入吐温20(TWEEN-20)，加入50mM三羟甲基氨基甲烷,使用HCl调节pH7，形成混合液A。
2.组织样品的粉碎
取组织样品(水稻、白三叶、紫花苜蓿等组织样品)0.5g，放入灭菌并预冷的研钵中，并加入约50mg PVPP混合，液氮研磨成细粉，将粉末转入离心管。
3.组织样品的裂解
向离心管中加入5ml混合液A，上下混匀10-15s，室温放置5min；按0.2ml氯仿/ml混合液A加入氯仿，按照2％(w/v)DTT,轻微振荡10-15s，室温放置3-4min；在4℃，8000×g条件下离心15min。离心后混合物分为三层，移取上层水相a至新离心管，用于后续RNA制备；取下层酚相b至另外一个离心管，用于蛋白质提取；剩余部分c用于DNA制备。
4.RNA样品制备
取上步水相a到新离心管，按照0.5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min；在4℃，12000×g条件下离心10min，弃上清；加入1ml 75％乙醇(DEPC处理)悬浮沉淀，4℃,8000×g条件下离心5min，去上清；室温晾干沉淀，加入适量DEPC处理水溶解RNA，-80℃冰箱保存。
5.蛋白质样品制备
取上步酚相b到新离心管，按1.5ml异丙醇/ml混合液a加入下层酚相，4℃孵育20min,每5-10min震荡混匀10-20s；4℃，10000×g条件下离心10min；去上清，按2ml洗液(0.3M盐酸胍/95％乙醇)/ml Trizol加入蛋白质沉淀物，室温孵育15-20min；4℃，20000×g条件下离心5min，重复2次。最后一次沉淀后，用1ml无水乙醇代替洗液洗涤蛋白；沉淀真空冻干燥，干粉保存于-80℃备用。
5.DNA样品制备
在中间层和沉淀层(C)加入65℃的CTAB提取液900μL，65℃水浴15至20min；冷却后加入500μL氯仿：异戊醇(24：1)，室温，10000×g条件下离心10min；取上清液，加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀。室温，10000×g条件下离心5min，倒掉上清液；用75％酒精清洗，室温干燥1h后溶于TE缓冲液。
其中V/W为L/kg的体重比，w/v为kg/L的重体比，v/v为L/L的体积比。
0.3M盐酸胍/95％乙醇指的是0.3摩尔质量的盐酸胍溶解在1L的95％乙醇中。
下面结合附图对本发明作进一步说明：
实验结果验证：
一、DNA质量验证：
1、琼台糖凝胶电泳检测提取DNA质量
参见图1，本发明的实施方案分离的基因组DNA样品与常用方案所得的那些基因组DNA样品比较的凝胶图像。其中1,2,3本实施方案分离结果，4,5,6为常用的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方案获分离结果。其中1,4为水稻幼苗；2,5为白三叶；3,6为紫花苜蓿幼苗。
结果表明，本发明方案获得的DNA和传统方案获得的DNA无明显差异。
2.分光光度检测提取DNA质量
结果表明，本发明方案获取的DNA在产量上低于传统CTAB方案，但差异不显著，而本发明方案获取的DNA纯度要高于传统CTAB方案。
二、RNA质量验证
1、琼台糖凝胶电泳检测提取RNA质量
参见图2，本发明的实施方案分离的RNA样品与常用方案所得的那些RNA样品比较的凝胶图像。其中1,2,3本实施方案分离结果，4,5,6为常用的TRIzol试剂盒方案获离结果。其中1,4为水稻幼苗；2,5为白三叶；3,6为紫花苜蓿幼苗。
结果表明本方案提取的RNA条带清晰，无DNA和蛋白质污染，质量较高与对照不存在显著差。
2.分光光度检测提取RNA质量
结果表明，本发明方案获取的RNA在产量和纯度上与传统的TRIzol方案无显著差异性。
三、蛋白质质量检测
参见图3、4、5、6、7、8，采用考马斯亮蓝G-250染料法和双向电泳凝胶结合银染法比较了本发明方案获取的蛋白质与市售的植物蛋白质提取试剂盒(Plant TotalProteinExtraction Kit，PE0230|SIGMA)在产量和质量上的差异。
本发明的实施方案分离的蛋白质样品与市售试剂盒分离的蛋白质样品比较的双向电泳图谱。其中3,5,7本实施方案分离结果，4,6,8为市售试剂盒方案获分离结果。其中3,4为水稻幼苗；5,6为白三叶；7,8为紫花苜蓿幼苗。
结果表明本方案提取的蛋白质最终获取的双向电泳图谱质量要高于市售试剂盒,体现在分离的蛋白质点更多,拖尾更少。
比较发现，本方法提取的蛋白在质和量上都优于市售的植物专用试剂盒。
Claims (2)
1.一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，所述方法包括步骤：
①.提取液的制备：按照水饱和苯酚:异硫氰酸胍＝2:1(V/W)的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷，使用HCl调节pH7，形成混合液A；
②.组织样品的粉碎
取植物组织样品0.5g，放入灭菌并预冷的研钵中，并加入约50mgPVPP混合，液氮研磨成细粉，将粉末转入离心管；
③.组织样品的裂解
向离心管中加入5ml混合液A，上下混匀10-15s，室温放置5min；按0.2ml氯仿/ml混合液A加入氯仿，其后加入2％(w/v)DTT，轻微振荡10-15s，室温放置3-4min；在4℃， 8000×g条件下离心15min；
离心后混合物分为三层，移取上层水相a至新离心管，用于后续RNA制备；取下层酚相b至 另外一个离心管，用于蛋白质提取；剩余部分c用于DNA制备；
④.RNA样品制备
取所述水相a到新离心管，按照0.5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min；在4℃，12000×g条件下离心10min，弃上清；加入1ml75％乙醇，经DEPC处理悬浮沉淀，4℃,8000×g条件下离心5min，去上清；室温晾干沉淀，加入适量DEPC处理水溶解RNA，-80℃冰箱保存；
⑤.蛋白质样品制备
取所述酚相b到新离心管，按1.5ml异丙醇/ml混合液a加入下层酚相，4℃孵育20min,每5-10min震荡混匀10-20s；4℃，10000×g条件下离心10min；去上清，按2ml洗液/mlTrizol加入蛋白质沉淀物，所述洗液按照0.3摩尔的盐酸胍溶于在1L的95％乙醇比例配置，室温孵育15-20min；4℃，20000×g条件下离心5min，重复2次；最后一次沉淀后，用1ml 无水乙醇代替洗液洗涤蛋白；沉淀真空冻干燥，干粉保存于-80℃备用；
⑥.DNA样品制备
在剩余部分c加入65℃的CTAB提取液900μL，65℃水浴15至20min；冷却后加入500μL氯仿和异戊醇，所述氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)，室温，10000×g条件下离心10min；取上 清液，加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀；室温，10000×g条件下离心5min，倒掉上清液；用75％酒精清洗，室温干燥1h后溶于TE缓冲液。
2.一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的提取液，其特征在于，所述的提取液的制备为：按照水饱和苯酚:异硫氰酸胍＝2:1(V/W)的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷，使用HCl调节pH7。
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