CN103013984A - 从木本植物材料中提取叶绿体总rna及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，先对植物材料进行粗提、纯化，再将得到的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮，经过冻融处理、抽提、离心弃上清液，沉淀经洗涤、分离后得到叶绿体总RNA。本发明还公开了一种从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，先按照前述步骤得到叶绿体总RNA；然后向抽提液分层后保留的中间层和下层有机相中加入无水乙醇，孵育、离心后弃沉淀；再将上清液加入到含醋酸铵的甲醇溶液中，沉淀，洗涤，得到叶绿体总蛋白质。本发明的方法工艺效率高，产品纯度好，得到叶绿体总蛋白质可在二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳分析、蛋白质免疫印迹或双向电泳等分析中进行应用。

Description

从木本植物材料中提取叶绿体总RNA及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用

技术领域

本发明涉及一种植物中有机成分的提取和应用，尤其涉及一种植物中叶绿体总RNA和总蛋白质的提取以及总蛋白质的具体应用。

背景技术

我国作为茶树发源地，其品种资源非常丰富，种植规模也在逐年扩大，现已成为我国重要的经济作物。随着茶叶所具有的各种保健功能逐步被人们所发现，茶叶作为世界三大饮料之一，愈来愈受到消费者的青睐，茶叶消费量也在逐步提高，如何提高茶叶产量以满足快速增长的市场需求，已成为茶叶种植户及科技工作者的共同目标和重要课题。

叶绿体是绿色植物进行光合作用重要场所，植物通过光合作用吸收光能将二氧化碳和水合成有机物，光合作用的效率与植物产量密切相关。开展茶树叶绿体发育和作用机制的研究是提高茶树产量的有效途径之一；另一方面，对于茶树品种的遗传改良等也具有非常积极的意义。

RNA和蛋白质一直是分子生物学研究的主要内容。叶绿体作为植物的亚细胞器，往往仅能从植物材料中获得少量完整的叶绿体样品。因此，如何从少量珍贵茶树样品中获得高品质、高纯度、完整的叶绿体RNA和蛋白质，对于茶树分子生物学研究显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、操作方便、成本低、且产品纯度高无污染的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，还提供一种步骤简单、材料利用率高、工艺效率高、成本低、产品纯度质量较好的从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，还提供提取的叶绿体总蛋白质样品在二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳分析、蛋白质免疫印迹或蛋白质双向电泳等分析中的具体应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，包括以下步骤：

（1）叶绿体纯化：按照常规方法从木本植物材料的叶片中进行粗提、纯化，得到叶绿体材料；

（2）冻融处理：将上述纯化后的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮中，所述叶绿体材料与交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶1～3，然后于-20℃～-80℃温度下进行冻融处理（重复2～3次即可）；

（3）抽提总RNA：将经过冻融处理后的叶绿体材料加入冰浴预冷的Trizol试剂中，并加入冰浴预冷的氯仿，剧烈振荡后室温静置，再高速离心使抽提液分层，取分层后的上层水相加入冰浴预冷的异丙醇中，室温放置；再高速离心，弃去上清液，离心后的沉淀经洗涤、离心分离后，即得到所述木本植物材料的叶绿体总RNA。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，优选的，所述Trizol试剂按照每0.05g～0.10g叶绿体材料加入1mL的添加量进行添加；所述氯仿按照每1mL Trizol试剂添加0.15mL～0.20mL氯仿的添加量进行添加；所述异丙醇按照每1ml Trizol试剂添加0.30 mL～1.50 mL异丙醇的添加量进行添加。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，优选的，所述高速离心时的条件为10000～30000×g、0℃～10℃条件下离心10min～30 min；所述离心分离时的条件为5000～10000×g、0℃～10℃条件下离心3min～10 min。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述步骤（1）中的粗提优选包括以下步骤：将所述木本植物材料的叶片破碎，置入3～6倍于其体积且-20℃～-80℃预冷后的粗提缓冲液中，经匀浆、过滤后所得的叶片匀浆滤液再进行离心处理，100～300×g、0℃～10℃条件下离心5min～10 min，弃沉淀；离心后的上清液再进行二次离心处理，1000～3000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，弃上清，所得沉淀即为叶绿体粗提物。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述步骤（1）中的纯化包括以下步骤：将所述叶绿体粗提物加入Percoll母液和氯化钠溶液构成的密度梯度体系中，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，收集密度梯度分界面的绿色条带，再用1～3倍于其体积且预冷后的纯化缓冲液重悬，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，所得沉淀即为纯化后的叶绿体材料。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述木本植物优选为茶树。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，包括以下步骤：

（a）按照上述的方法先提取得到所述叶绿体总RNA；

（b）沉淀DNA：向所述抽提液分层后保留的中间层和下层有机相中加入无水乙醇，无水乙醇按每1ml Trizol试剂加入1.0mL～1.5mL无水乙醇的添加量添加，室温孵育，离心后弃沉淀；

（c）沉淀蛋白质：将上述步骤（b）后的上清液加入-20℃～-80℃预冷后含醋酸铵的甲醇溶液中，-20℃～-80℃条件下沉淀，1h～5h，再经高速离心后弃上清液；得到的沉淀分别用甲醇溶液、丙酮溶液洗涤，得到所述木本植物材料的叶绿体总蛋白质。

上述的从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，所述步骤（b）中，离心的条件为1000～3000×g、0～10℃条件下离心3 min～10min；所述步骤（c）中，高速离心的条件为10000～20000×g、0～10℃条件下离心15min～30min。更优选的，所述含醋酸铵的甲醇溶液中含有0.05 mol/L～0.25 mol/L醋酸铵、10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂；所述甲醇溶液和丙酮溶液中均含10mmol/L～25mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述方法获得的叶绿体总蛋白质制备双向电泳分析样品的方法，该方法所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将所述叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加5μL～20μL的蛋白质裂解液，混合均匀后冰浴上裂解1h～3h，高速离心后的上清液即为双向电泳分析的蛋白质样品；

所述蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

6mol/L～8mol/L尿素、1mol/L～2 mol/L硫脲、30mmol/L～65mmol/L三羟甲基氨基甲烷、2.0%～5.0%质量分数的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、2mmol/L～5mmol/L 三丁基膦、0.1%～0.2%体积分数的两性电解质和2%～4%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述方法获得的叶绿体总蛋白质制备二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳分析或蛋白质免疫印迹分析样品的方法，该方法所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将所述叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加10μL～30μL的蛋白质裂解液，所述蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

30mmol/L～80mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH6.8）、50mmol/L～150mmol/L二硫苏糖醇、1.0%～5.0%质量分数的十二烷基硫酸钠、0.05%～0.30%质量分数的溴酚蓝和5%～15%体积分数的甘油。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）在本发明提取叶绿体总RNA的方法中，通过在叶绿体分离和裂解过程中采用交联聚乙烯吡咯烷酮，可有效去除木本植物（尤其是像优选方案中的茶树）富含的酚类、多糖等杂质，显著提高制备RNA和蛋白质样品的质量；

（2）在本发明的同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法中，本发明仅利用一份试验材料即可同时制备高质量、高纯度的茶树叶绿体RNA和蛋白质样品，有效提高了试验材料的利用率，特别是对珍贵的试验材料具有重要意义；

（3）在本发明的同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法中，通过优选采用含有0.05 mol/L～0.25 mol/L醋酸铵、10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂的甲醇溶液沉淀蛋白质，可有效克服蛋白质沉淀后复溶困难的问题，同时显著提高了蛋白质沉淀效率；

（4）在本发明叶绿体总蛋白质的具体分析应用中，通过在蛋白质裂解液中添加三羟甲基氨基甲烷盐酸盐增加了叶绿体总蛋白质样品的溶解性；还通过采用还原性强的三丁基膦代替带负电荷的二硫苏糖醇，有效减少了由于二硫苏糖醇所带负电荷引起的双向电泳图碱性端的拖尾现象并增加了蛋白点数量，便于后续的质谱鉴定分析。

综上所述，本发明的方法操作简单、实施容易，且提取、获得的样品质量较好；采用本发明方法制备的叶绿体RNA和叶绿体总蛋白质样品的质量完全满足实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、蛋白质双向电泳等分析应用要求，这为茶树叶绿体分子生物学研究奠定了坚实的基础，同时对其它木本植物叶绿体RNA和蛋白样品的制备具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中对制备提取的茶树叶绿体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测图谱。

图2为本发明实施例中对制备的茶树叶绿体蛋白质样品进行免疫印迹杂交的图谱。

图3为本发明实施例中对制备的茶树叶绿体蛋白质样品进行双向电泳的图谱。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

一种本发明的从茶树植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，具体包括以下步骤：

1. 叶绿体纯化：从茶树的叶片中进行粗提、纯化，得到叶绿体材料。

1.1粗提：取新鲜茶树叶片剪碎，置于3倍其体积且-20℃预冷后的粗提缓冲液 [含0.33 mol/L的山梨醇、0.1%的牛血清白蛋白（w/v）、10 mmol/L的二硫苏糖醇（w/v）、5 mmol/L的EDTA、50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）和5%的交联聚乙烯吡咯烷酮（w/v），蒸馏水为溶剂]中，匀浆3次，每次10s，4层灭菌纱布过滤，经匀浆、过滤后所得的叶片匀浆滤液在200×g、4℃条件下离心5 min，弃沉淀；离心后的上清液在1000×g、4℃条件下离心10min，弃上清，所得沉淀即为叶绿体粗提物。

1.2纯化：将上述获得的叶绿体粗提物加入Percoll母液[Percoll∶0.85%质量分数的氯化钠溶液=1∶9（v/v）]和0.85%质量分数的氯化钠溶液构成的密度梯度体系中[上部：30%（w/v）；下部：60%（w/v）]，在3000×g、4℃条件下离心15 min，收集密度梯度分界面的绿色条带，再用3倍于其体积且预冷后的纯化缓冲液[包含150 mmol/L的NaCl、25 mmol/L的乙二胺四乙酸、50 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 8.0），蒸馏水为溶剂]重悬，3000×g、4℃条件下离心10 min，重复2～3次，所得沉淀即为纯化后的叶绿体材料。

2. 冻融处理：将上述纯化后的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮中，叶绿体材料与交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶1，然后于-20℃温度下进行冻融处理，重复冻融3次。

3. 抽提总RNA：将经过冻融处理后的叶绿体材料加入冰浴预冷后的Trizol试剂中，每0.05g～0.1g叶绿体材料加入1mL Trizol试剂，振荡混匀，室温静置5 min；然后按照1mL Trizol试剂加入0.2mL的添加量加入冰浴预冷后的氯仿，剧烈振荡15s，室温静置15 min，再在12000×g、4℃条件下离心15min使抽提液分层，取分层后的上层水相于新的离心管中（中间层和下层有机相保存备用），按每1ml Trizol试剂添加0.5mL的添加量加入冰浴预冷后的异丙醇中，室温放置15min；再在12000×g、4℃条件下离心15 min，弃去上清液，离心后的沉淀加入1mL 75%的乙醇溶液洗涤2次，再在7500×g、4℃条件下离心5min，即得到该茶树的叶绿体总RNA。

一种本发明的从茶树植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，具体包括以下步骤：

1. 提取叶绿体总RNA：按照本实施例上述的方法先提取得到叶绿体总RNA；

2. 沉淀DNA：向上述抽提液分层后保留的中间层和下层有机相中加入无水乙醇，以沉淀中间层和下层酚相中的DNA，无水乙醇的添加量按每1ml Trizol试剂加入1.5mL计，室温孵育3min，再在2000×g、4℃条件下离心5min，离心后弃沉淀；

3. 沉淀蛋白质：将上述步骤2后的上清液转移至新离心管中，加入5倍其体积且经-20℃预冷后含醋酸铵的甲醇溶液[含有0.1mol/L醋酸铵、10mmol/L的二硫苏糖醇和4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂]，-20℃条件下沉淀1h，再在4℃、15000×g条件下离心15min，弃上清液；得到的沉淀分别用甲醇溶液[含10mmol/L的二硫苏糖醇和2%的Cocktail蛋白抑制剂（v/v）]、80%质量分数的丙酮溶液[含10mmol/L的二硫苏糖醇和2% Cocktail蛋白抑制剂（v/v）] 各洗涤一次，得到茶树材料的叶绿体总蛋白质。

上述本实施例的方法获得的叶绿体总蛋白质可进行双向电泳分析，该分析所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加20μL的蛋白质裂解液，混合均匀后冰浴上裂解2h，4℃、15000×g条件下离心15 min，离心后的上清液即为双向电泳分析的蛋白质样品；

上述用到的蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

7mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、4%质量分数的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、3mmol/L 三丁基膦、0.2%体积分数 Bio-Lyte的两性电解质（pH 4～7）和4%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。

上述本实施例的方法获得的叶绿体总蛋白质可进行二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分析或蛋白质免疫印迹（Western blot）分析，该分析所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加10μL的蛋白质裂解液，该蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH=6.8）、100 mmol/L二硫苏糖醇、2.0%质量分数的十二烷基硫酸钠、0.1%质量分数的溴酚蓝和10%体积分数的甘油。

对上述本实施例提取的RNA进行检测，参照《分子克隆实验指南（第二版）》说明进行RNA琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。由图1可见，本发明方法提取的RNA琼脂糖凝胶电泳显示5S、18S、28S条带清晰可见，28S为18S条带浓度的2～3倍，条带之间无明显拖尾现象，这表明RNA完整无降解，且无DNA污染。RNA样品的A260/A280比值为1.9左右，在1.8～2.0之间，这说明RNA样品中无蛋白质、酚类等杂质污染，纯度较高。

对上述本实施例提取的叶绿体蛋白质样品进行免疫印迹杂交，参考《分子克隆实验指南（第二版）》说明进行蛋白质免疫印迹杂交实验检测β-actin蛋白，鉴定提取蛋白质质量，结果如图2。由图2可见，蛋白质样品的A280/A260比值为1.85左右，在1.8～2.0之间，说明蛋白质样品中无核酸污染，纯度较高。

对上述本实施例提取的叶绿体蛋白质样品进行蛋白质双向电泳检测，参照《蛋白质技术手册》进行蛋白质双向电泳试验，结果见图3。由图3可知，本发明方法提取的茶树叶绿体总蛋白样品进行双向电泳试验能获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。

Claims (10)

1.一种从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，包括以下步骤：

（1）叶绿体纯化：按照常规方法从木本植物材料的叶片中进行粗提、纯化，得到叶绿体材料；

（2）冻融处理：将上述纯化后的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮，所述叶绿体材料与交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶1～3，然后于-20℃～-80℃温度下进行冻融处理；

（3）抽提总RNA：将经过冻融处理后的叶绿体材料加入冰浴预冷的Trizol试剂中，并加入冰浴预冷的氯仿，剧烈振荡后室温静置，再高速离心使抽提液分层，取分层后的上层水相加入冰浴预冷的异丙醇中，室温放置；再高速离心，弃去上清液，离心后的沉淀经洗涤、离心分离后，即得到所述木本植物材料的叶绿体总RNA。

2.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于：所述Trizol试剂按照每0.05g～0.10g叶绿体材料加入1.0 mL的添加量进行添加；所述氯仿按照每1.00 mL Trizol试剂添加0.15 mL～0.20 mL氯仿的添加量进行添加；所述异丙醇按照每1ml Trizol试剂添加0.30 mL～1.50 mL异丙醇的添加量进行添加。

3.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于：所述高速离心时的条件为10000～30000 ×g、0℃～10℃条件下离心10min～30 min；所述离心分离时的条件为5000～10000×g、0℃～10℃条件下离心3min～10 min。

4.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的粗提包括以下步骤：将所述木本植物材料的叶片破碎，置入3～6倍于其体积且-20℃～-80℃预冷后的粗提缓冲液中，经匀浆、过滤后所得的叶片匀浆滤液再进行离心处理，100～300×g、0℃～10℃条件下离心5min～10 min，弃沉淀；离心后的上清液再进行二次离心处理，1000～3000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，弃上清，所得沉淀即为叶绿体粗提物。

5.根据权利要求4所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的纯化包括以下步骤：将所述叶绿体粗提物加入Percoll母液和氯化钠溶液构成的密度梯度体系中，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，收集密度梯度分界面的绿色条带，再用1～3倍于其体积且预冷后的纯化缓冲液重悬，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，所得沉淀即为纯化后的叶绿体材料。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述木本植物为茶树。

7.一种从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，包括以下步骤：

（a）按照权利要求1～6中任一项所述的方法先提取得到所述叶绿体总RNA；

（b）沉淀DNA：向所述抽提液分层后保留的中间层和下层有机相中加入无水乙醇，无水乙醇按每1ml Trizol试剂加入1.0 mL～1.5mL无水乙醇的添加量添加，室温孵育，离心后弃沉淀；

（c）沉淀蛋白质：将上述步骤（b）后的上清液加入-20℃～-80℃预冷后含醋酸铵的甲醇溶液中，-20℃～-80℃条件下沉淀，1h～5h，再经高速离心后弃上清液；得到的沉淀分别用甲醇溶液、丙酮溶液洗涤，得到所述木本植物材料的叶绿体总蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤（b）中，离心的条件为1000～3000×g、0～10℃条件下离心3 min～10min；所述步骤（c）中，高速离心的条件为10000～20000×g、0～10℃条件下离心15min～30min；所述含醋酸铵的甲醇溶液中含有0.05 mol/L～0.25 mol/L醋酸铵、10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂；所述甲醇溶液和丙酮溶液中均含10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。

9.一种用权利要求7或8所述方法获得的叶绿体总蛋白质制备双向电泳分析样品的方法，其特征在于：该方法所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将所述叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加5μL～20μL的蛋白质裂解液，混合均匀后冰浴上裂解1h～3h，高速离心后的上清液即为双向电泳分析的蛋白质样品；

所述蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

6mol/L～8mol/L尿素、1mol/L～2 mol/L硫脲、30mmol/L～65mmol/L三羟甲基氨基甲烷、2%～5%质量分数的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、2mmol/L～5mmol/L 三丁基膦、0.1%～0.2%体积分数的两性电解质和2%～4%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。

10.一种用权利要求7或8所述方法获得的叶绿体总蛋白质制备二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳分析或蛋白质免疫印迹分析样品的方法，其特征在于：该方法所用的蛋白质样品主要通过以下步骤制备得到：将所述叶绿体总蛋白质加入到蛋白质裂解液中，每1 mg叶绿体总蛋白质添加10μL～30μL的蛋白质裂解液，所述蛋白质裂解液中包含以下浓度的组分：

30mmol/L～80mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH6.8）、50mmol/L～150mmol/L二硫苏糖醇、1.0%～5.0%质量分数的十二烷基硫酸钠、0.05%～0.30%质量分数的溴酚蓝和5%～15%体积分数的甘油。

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