CN104130987B - 冬虫夏草酯酶/脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个来自冬虫夏草中国被毛孢L0106的酯酶/脂肪酶，编码这个酶的基因及其应用；包括具有SEQ？ID？No.2所示的蛋白氨基酸序列90％以上同源性，其编码基因对应为具有SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列90％以上同源性。包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中。该酯酶/脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌含有酯酶/脂肪酶，可以利用重组大肠杆菌或纯化的酯酶/脂肪酶为催化剂进行生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体，具有重大应用前景。

Description

冬虫夏草酯酶/脂肪酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一个来自冬虫夏草中国被毛孢中一种酯酶/脂肪酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，本发明还涉及所述的酯酶/脂肪酶基因及重组酯酶/脂肪酶在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(HepialusarmoricanusOberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)是一类能催化酯水解和合成的酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类,由于酯酶催化的酶促反应具有良好的底物专一性、区域选择性或对映选择性，酯酶被广泛用于手性拆分中，是合成手性酸、手性酯或手性醇等手性化合物的重要生物催化剂。

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常中有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要四霉菌和细菌。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同。

有研究表明，猪肝酯酶(PLE)在Pichiapastoris中成功得到过表达,因此可以很好地获取高纯度的重组PLE。而且PLE在水解乙酸仲醇酯时，显示出更好的对映选择性，在水解(R,S)-1-苯基-2-丁基乙酸酯时，利用商品化的PLE得到的对映选择率E<4，而用重组的PLE得到的E>100。

普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是γ-氨基丁酸的一种结构类似物。普瑞巴林作为一种钙离子通道调节剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，对癫痫、神经病理性疼痛有良好的疗效，与传统药物相比具有使用剂量低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强等特点。因此被国际疼痛学会(IASP)、欧洲神经病学学会联盟(EFNS)和英国NICE等多个国际指南推荐位一线治疗药物，具有广阔的市场应用前景。

(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的关键手性中间体，可由2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备，但其原子经济性较低，以外消旋3-氰基-5-甲基己酸乙酯位底物，通过酶法对其进行选择性水解合成普瑞巴林的关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸，建立绿色、高效的普瑞巴林合成工艺。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种从冬虫夏草中国被毛孢(Hirsutellasinensis)L0106(该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露)中获得的酯酶/脂肪酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌，及其在制备普瑞巴林的关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于冬虫夏草中国被毛孢(Hirsutellasinensis)L0106的酯酶/脂肪酶，所述酯酶/脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2(记为Lip8)所示。

所述SEQIDNO.2所示氨基酸序列为：

401R*

任何含有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还提供一种编码所述酯酶/脂肪酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

该酯酶/脂肪酶基因由如下方法得到：采用RT-PCR和5′-RACE技术从HirsutellasinensisL0106菌中分离酯酶/脂肪酶基因。采用TRIzol法提取HirsutellasinensisL0106总RNA，使用RT-PCRKit进行cDNA第一链的合成，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。然后利用HirsutellasinensisL0106基因组以及转录组全序列测序信息设计引物，PCR扩增得到了一个长为1206bp的开放阅读框(SEQIDNO.1)。

所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为：

所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明的要点在于提供了SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

本发明提供一种含有所述酯酶/脂肪酶编码基因的重组载体，及含有所述酯酶/脂肪酶编码基因的重组基因工程菌。根据酯酶/脂肪酶编码序列，设计并合成引物，以cDNA为模板PCR克隆酯酶/脂肪酶基因全长序列，然后用限制性酶EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切，切胶回收后与同样酶切处理回收的pET-28a连接，构建了含有酯酶/脂肪酶基因的重组质粒pET28a-Lip8。将重组质粒pET28a-Lip8转化至E.coliBL21(DE3)菌株中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-Lip8。

本发明提供一种所述酯酶/脂肪酶编码基因在制备酯酶/脂肪酶中的应用，所述方法为：构建含有所述酯酶/脂肪酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的基因工程菌进行诱导培养，从培养液分离得到含有重组酯酶/脂肪酶的菌体细胞，从菌体细胞中分离纯化得到重组酯酶/脂肪酶。

此外，本发明还提供一种所述酯酶/脂肪酶在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，所述的应用方法为：以含酯酶/脂肪酶基因的重组基因工程菌经诱导培养后获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后取上清液进行Ni-NTA柱分离后获得的酯酶/脂肪酶为催化剂，以外消旋3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，于pH5～10缓冲液(优选pH值为8)中，在20～65℃(优选40℃、150rpm条件下反应4h)下进行反应，反应结束后，获得的转化液即为含有(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化即可获得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。所述混合液分离纯化参照Martinezetal.方法进行(Org.ProcessRes.Dev.2008,12:392-398)。

所述反应体系中底物的初始浓度为10～200mM(终浓度)(优选100mM)，所述催化剂为含酯酶/脂肪酶的湿菌体时，湿菌体的用量为10～30g/L(终浓度)(优选20g/L)，若催化剂为酯酶/脂肪酶时，所述酯酶/脂肪酶的质量用量为0.1～1mg/L(终浓度)(优选0.68mg/L)(酯酶/脂肪酶比酶活为1.55U/mg，酶活定义为：在40℃、pH8.0条件下，在1min内催化3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(S)-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U)，所述底物初始浓度为10～200mM(优选100mM)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含酯酶/脂肪酶基因的基因工程菌接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，获得培养液，再将培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，向培养物中加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG(即异丙基硫代半乳糖苷)，于16～28℃诱导培养8～12h后，离心，弃上清，收集沉淀，即获得含有酯酶/脂肪酶的湿菌体。湿菌体超声破碎后离心，上清液经Ni-NTA柱亲和层析分离纯化，即获得酯酶/脂肪酶。

进一步，所述酯酶/脂肪酶的分离纯化方法为：将含有酯酶/脂肪酶的湿菌体重悬于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)中，振荡摇匀后在冰浴条件下超声破碎菌体30min(破碎功率300W，工作1s，停1s)，破碎液于4℃，12000rpm离心20min。收集上清液(粗酶液)以Ni-NTA为介质进行亲和层析，装柱体积为10ml，先用上样缓冲液(终浓度500mMNaCl和终浓度20mM咪唑，溶剂为pH8.0、50mMTris-HCl)平衡Ni-NTA柱10个柱体积，接着以1ml/min的速率上样粗酶液，然后用上样缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(终浓度500mMNaCl和终浓度500mM咪唑，溶剂为pH8.0、50mMTris-HCl)洗脱收集目标蛋白Lip8。目标蛋白Lip8在50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析过夜，收集透析液即为纯化后的酯酶/脂肪酶。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于HirsutellasinensisL0106的酯酶/脂肪酶及其编码基因；该酯酶/脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌含有酯酶/脂肪酶，可以利用重组大肠杆菌或纯化的酯酶/脂肪酶为催化剂进行生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体。

(四)附图说明

图1为冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；其中泳道1、2、3、4、5分别为5个总RNA样品。

图2为酯酶/脂肪酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000DNAMarker(从上到下条带大小分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，泳道2为利用引物Primer-F和Primer-R扩增得到的酯酶基因片段。

图3为重组表达质粒pET-28a/Lip8物理图谱；

图4为酯酶/脂肪酶蛋白SDS-PAGE图。泳道1为蛋白质分子量Marker(从上到下条带大小分别为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4KDa)，泳道2为未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28a-Lip8，泳道3为IPTG诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28a-Lip8，泳道4为经过镍柱亲和层析纯化的Lip8蛋白。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水，在12～16℃培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余量为水，置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：1)液氮研磨：取1g新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mLTRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。4)RNA洗涤：加入1mL75％(v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。

实施例3：冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(200～700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用IlluminaGAIIx进行测序。测序得到的原始图像数据经basecalling转化为序列数据，即rawdata或rawreads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续分析。

实施例4：冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhuetal.Denovoassemblyofhumangenomeswithmassivelyparallelshortreadsequencing[J].GenomeRes,2010,20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig，通过paired-endreads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-endreads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue<0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene用软件ESTScan(Iseli,Jongeneeletal.ESTScan:aprogramfordetecting,evaluating,andreconstructingpotentialcodingregionsinESTsequences[J].InProceedingsof9thInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AAAIPress,MenloPark,CA,pp.1999,138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5'到3'方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和GeneOntology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa,Gotzetal.Blast2GO:auniversaltoolforannotation,visualizationandanalysisinfunctionalgenomicsresearch[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.)得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye,Fangetal.WEGO:awebtoolforplottingGOannotations[J].NucleicAcidsResearch,2006,34:293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例6：冬虫夏草中国被毛孢酯酶/脂肪酶基因引物设计

运用Primer5.0引物设计软件根据预测得到的基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆中国被毛孢酯酶/脂肪酶基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下所列：

Lip8基因：正向引物Primer-F:5’GCGGAATTCATGGGCGAGTTGAAACGG3’

反向引物Primer-R：5’ATTGCGGCCGCTTACCTTGAGCTTCTCG3’

Lip8基因长度为1206bp。

实施例7：冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。

采用PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒(TaKaRa)从TotalRNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

1)在Microtube管中配制下列混合液。

2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下：

65℃，5min

3)退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃15～30min

70℃15min

一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列(PrimeScript1stStrandcDNASynthesisKit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

实施例8：冬虫夏草中国被毛孢酯酶/脂肪酶基因的克隆、表达、纯化以及蛋白活力的检测

1、酯酶/脂肪酶基因(Lip8)的PCR扩增

以实施例7中得到的cDNA第一链为模板，用实施例6中合成的Lip8基因引物：5’GCGGAATTCATGGGCGAGTTGAAACGG3’、5’ATTGCGGCCGCTTACCTTGAGCTTCTCG3’进行TaqDNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下：

TaqPCR扩增反应体系：

TaqDNAPloymerasePCR扩增条件：

2、酯酶/脂肪酶基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；2)取15mL凝胶，待凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Goldview，混合均匀后倒入电泳凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；3)凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；4)取5μL样品然后加入6×LoadingBuffer1.5μL和ddH2O4μL混合后用移液枪上样，上样量为10μL；5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；7)当样品跑过胶板的2/3时可终止电泳；8)切断电源后，将凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测酯酶/脂肪酶基因的大小为1206bp，琼脂糖凝胶电泳结果(图2)表明已成功扩增出了酯酶/脂肪酶基因Lip8。

3、酯酶/脂肪酶重组表达质粒pET-28a/Lip8的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a(Novagen)和酯酶/脂肪酶基因Lip8酶切位点比对情况，确定了EcoRⅠ和NotⅠ双酶切位点，对切胶回收并纯化该片段，利用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ(Fermentas)。对2中获得的扩增片段进行切胶回收处理，对回收片段和pET-28a进行酶切处理，回收酶切后的Lip8和pET-28a片段，并利用T4DNA连接酶(Promega)将该片段与商业化载体pET-28a进行连接，构建重组表达载体pET-28a/Lip8。

EcoRⅠ/NotⅠ双酶切体系：

连接体系：

4、工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8的构建

将步骤3中构建的重组表达载体pET-28a/Lip8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含终浓度50μg/mlKan的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pET-28a/Lip8成功转化进表达宿主E.coliBL21(DE3)中，且酯酶/脂肪酶基因已成功克隆至pET-28a的EcoRⅠ和NotⅠ位点。

5、酯酶/脂肪酶重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(终浓度50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan抗性(终浓度50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度(终浓度0.05mmol/L)的IPTG诱导培养8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

6、酯酶/脂肪酶重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8表达产物SDS-PAGE分析

以未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照，鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养一定时间(8h)后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，图4中的泳道lane3即为重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8诱导表达的酯酶/脂肪酶蛋白Lip8(经测序验证其氨基酸序列为SEQIDNo.2所示)的SDS-PAGE图，泳道lane2为未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET28a-Lip8，泳道lane1为蛋白Marker条带。

7、酯酶/脂肪酶的分离纯化

取步骤5中收集的菌体细胞重悬于20mlTris-HCl缓冲液(20mM，pH8.0)中，振荡摇匀后在冰浴条件下超声破碎菌体30min(破碎功率300W，工作1s，停1s)，破碎液于4℃，12000rpm离心20min。收集上清液(粗酶液)用于重组酯酶后续的分离纯化。纯化介质为Ni-NTA，装柱体积为10ml。先用上样缓冲液(50mMTris-HCl，500mMNaCl和20mM咪唑，pH8.0)平衡Ni-NTA柱10个柱体积，接着以1ml/min的速率上样粗酶液，然后用上样缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，500mMNaCl和500mM咪唑，pH8.0)洗脱收集目标蛋白Lip8。酶液(即目标蛋白Lip8)在50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中透析过夜，纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图4，泳道lane4为经过镍柱亲和层析纯化的Lip8蛋白。

8、酯酶/脂肪酶重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8的蛋白活性检测

以步骤4中获得的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-Lip8湿菌体作为生物催化剂(同时以步骤6中未诱导的E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8和宿主菌E.coliBL21(DE3)作为对照)，以外消旋3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，进行转化反应制备普瑞巴林中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸。转化体系组成及转化操作如下：在50mL转化瓶中加入0.2g的湿菌体(相对于干重0.02g)和10mLTris-HCl(100mM，pH8.0)，50μl底物(终浓度100mM)，构成10ml的转化体系(忽略菌体和底物的体积)，40℃、150r/min反应4h，定时取样200μl，并加50μl1M的HCl终止反应，乙酸乙酯萃取、离心取上层(有机相)经无水硫酸钠干燥处理后气相测定转化率和产物的对映体过量值(e.e.)。各成分的量用气相色谱岛津GC-14A测定，色谱柱类型：G-TA毛细管柱；色谱条件：柱温135℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦流量为100mL/min；分流比为30:1。酶活单位(U)定义为：在40℃、pH8.0条件下，在1min内催化3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成1μmol(S)-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。反应4h后，反应液经乙酸乙酯萃取后气相检测，(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯对映体过量值(ee)≧97％，转化率43.3％，根据体系中(S)-3-氰基-5-甲基己酸的生成量计算重组菌酶活。

称取1g湿菌体，于10mLTris-HCl(100mM，pH8.0)中重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎菌体30min(破碎功率300W，工作1s，停1s)，破碎液于4℃，12000rpm离心20min，取上清(即粗酶液)。利用考马斯亮蓝法测得酯酶/脂肪酶粗酶液中的蛋白含量为0.132mg/mL，通过Bandscan软件，对SDS-PAGE中的粗酶液条带含量进行分析，酯酶/脂肪酶占总蛋白的32.5％，故参与催化反应的酯酶/脂肪酶为0.132mg/mL×0.2mL×32.5％＝0.00858mg。故酶活为：43.3％×100μmol/mL×0.05mL÷240min＝0.009U，比酶活为：0.009U÷0.00858mg＝1.05U/mg，测定结果见表1。

表1酯酶/脂肪酶活力测定结果

菌株/质粒	比酶活(U/mg)
		E.coli BL21(DE3)	0
未诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a/Lip8	0
		IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a/Lip8	1.05

9、酯酶/脂肪酶在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用

称取方法7中纯化获得的重组酯酶/脂肪酶0.2mg，溶解于5mLTris-HCl(100mM，pH8.0)中，转化体为170μl酶液，10mLTris-HCl(100mM，pH8.0)，50μl底物(终浓度100mM)，构成10ml的转化体系(忽略酶液和底物的体积)，转化条件、检测方法同8。以水替代纯酶作为对照，反应4h，转化率达到47.3％，底物ee值≧97％根据体系中(S)-3-氰基-5-甲基己酸的生成量计算重组菌酶活，参与催化反应的酯酶/脂肪酶为0.2mg×0.17ml÷5ml＝0.0068mg。故酶活为：47.3％×100μmol/mL×0.05mL÷240min＝0.0099U，比酶活为：0.0099U÷0.0068mg＝1.46U/mg，测定结果见表2。

表2酯酶/脂肪酶活力测定结果

催化剂	比酶活(U/mg)
		H2O	0
Lip8酶	1.46

Claims (9)

1.一种冬虫夏草酯酶/脂肪酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。

2.如权利要求1所述冬虫夏草酯酶/脂肪酶在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含冬虫夏草酯酶/脂肪酶重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8经诱导培养后的湿菌体或湿菌体经超声破碎后离心得到的上清液进行Ni-NTA柱分离后获得的酯酶/脂肪酶为催化剂，以3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，于pH为5～10的缓冲溶液中，在20～65℃、150rpm条件下进行转化反应，反应结束后，获得的转化液即为含有(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含酯酶/脂肪酶基因的基因工程菌接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，获得培养液，再将培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，向培养物中加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG，于16～28℃诱导培养8～12h后，离心，弃上清，收集沉淀，即获得含有酯酶/脂肪酶的湿菌体；湿菌体超声破碎后离心，上清液经Ni-NTA柱亲和层析分离纯化，即获得酯酶/脂肪酶。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为10～200mM，所述催化剂为含酯酶/脂肪酶的湿菌体时，湿菌体的用量为10～30g/L，若催化剂为酯酶/脂肪酶时，酯酶/脂肪酶的质量用量为0.1～1mg/L。

6.一种编码权利要求1所述酶的基因。

7.如权利要求6所述基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。

8.如权利要求6～7之一所述基因在构建能够生物催化3-氰基-5-甲基己酸乙酯的基因工程菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述酯酶/脂肪酶基因的重组载体pET-28a/Lip8，将所述重组载体转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，获得的重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a/Lip8进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有酯酶/脂肪酶的菌体细胞。