CN105241720B - 一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。本发明通过联合传统蛋白提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同时引入助溶剂SDS溶液，并优化提取过程，建立了一种适合红树植物秋茄叶片总蛋白提取的Phe‑B方法。本发明有效地提高了蛋白质的提取效率和质量，其技术方案可专门适合于双向电泳的秋茄叶片蛋白的提取。本发明方法具有操作简单、蛋白提取效率高、干扰物质少的特点，适合于蛋白提取困难、蛋白提取效率低、干扰物质多的材料。本发明所提取的秋茄叶片蛋白完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱，且实验重复性和稳定性好。

Description

一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法

技术领域：

本发明涉及蛋白组学研究领域的一种红树植物蛋白提取与分离方法，具体涉及一种稳定、高效的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。

背景技术：

红树林是生长在热带、亚热带海湾、河口泥滩上特有的以红树植物为主体的常绿灌木或乔木组成的海洋湿地生物群落，是重要的海洋湿地生态系统。红树林在防风消浪、护堤固岸、促淤固滩、净化水体和维持沿海湿地生物多样性等方面具有重要作用和巨大的社会经济效益。目前，全球极端天气气候对红树林的生存和发展产生了直接的影响，秋茄，作为红树植物的常见物种，是抗寒性最强、分布最广的红树物种之一，如何从蛋白质水平上研究红树植物秋茄对逆境的响应与适应机制对应对全球变化具有重要科学意义。

双向电泳是在蛋白水平上研究复杂基因表达非常有效的方法，为了获得好的结果，高质量的蛋白样品制备是蛋白组学研究中最重要的步骤之一。然而，蛋白样品提取过程中经常会发生共沉淀或其他非蛋白物质的污染。由于红树植物中常含有大量的其他物质，如单宁、盐分、色素、多糖、多酚、脂类、淀粉、蛋白酶、细胞壁、液泡和其他刺激代谢产物等，严重地影响了蛋白质的提取分离，并且红树植物中蛋白的含量相对较低，使蛋白的提取变得更加困难。秋茄叶片组织中的这些干扰物质含量非常高，使得秋茄叶片蛋白的提取尤其困难，如何获得高质量的蛋白对于秋茄蛋白组学的研究显得至关重要。

三氯乙酸-丙酮沉淀法(简称TCA-A法)是开展绝大多数植物蛋白组学研究最基本的方法。TCA-A法已经成功用于不同的植物组织蛋白提取，如木材组织、玉米叶片等。尽管TCA-A法可以增强蛋白的共沉淀作用，并有助于去除杂质，然而一些聚合物杂质也常常一起被共沉淀；此外，TCA-A法的另外一个缺点就是蛋白被TCA-A沉淀后，蛋白不能完全再溶解。在秋茄叶片蛋白组学研究中，TCA-A法提取的蛋白在双向电泳图上显示出了明显的纵条纹和拖尾现象。蛋白提取的另一个常用基本方法就是苯酚提取法(简称Phe法)。Phe法可以追溯到19世纪50年代。在一些植物蛋白提取中，苯酚被发现是一个能将蛋白从水溶液中提取的有效试剂。然而，以往的研究表明，Phe法仍然不能很好地将干扰物质从红树植物中去除，如秋茄(Kandelia candel)(Wang,L.G.,Liu,X.,Liang,M.,et al.Proteomic analysis ofsalt-responsive proteins in the leaves of mangrove Kandelia candel duringshort-term stress.Plos One,2014b,9(1):e83141.DOI:10.1371/journal.pone.0083141)、木榄(Zhu,Z.,Chen,J.,Zheng,H.L.Physiological andproteomic characterization of salt tolerance in a mangrove plant,Bruguieragymnorrhiza(L.)Lam.Tree Physiology,2012,32(11):1378-1388.)和红海榄(吉星,邓用川,黄惜等.红海榄根部盐胁迫反应的比较蛋白质组学分析.中国生物化学与分子生物学报,2009,25(1):72-77.)等。以往研究中用Phe法获得的蛋白进行的双向电泳图谱中，存在着高背景值，这表明还是有很多干扰杂质的存在。目前，有关双向电泳在红树植物中的应用报道还较少，尤其在红树植物蛋白组学研究中还没有很好的蛋白提取方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种稳定、高效适用于双向电泳的秋茄叶片总蛋白的提取方法，本方法操作简便、蛋白提取效率高、分离蛋白点多、杂质少、重复性好、图谱清晰、不干扰第一向等电聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一套适用于秋茄叶片总蛋白的提取的有效方法。

本发明的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每1g样品加入0.1g的PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)，于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；

(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，每1g样品加入5ml预冷的含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清；

(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7以上，离心后去除上清；

(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后去除上清；

(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；

(6)、提取并沉淀蛋白：每1g样品加入8ml体积比为1:1的苯酚/SDS(十二烷基磺酸钠)缓冲液，其中，苯酚的pH值大于(或等于)7.8，充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉淀；

(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀；

(8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；

(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白。

步骤(6)所述的SDS缓冲液，优选，其配方为：30％(w/v)蔗糖，2％(w/v)SDS，0.1MTris-HCl(pH 8.0)，5％(v/v)β-巯基乙醇，1mM PMSF(苯甲基磺酞氟)。

步骤(6)所述的沉淀过夜，优选，温度为-20℃。

步骤(9)所述的样品裂解液，优选，其配方为：7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS(3一[(3一胆酞胺丙基)一二乙胺]一丙磺酸)，0.2％(v/v)pH值为4-7的两性电解液，50mM DTT(二硫苏糖醇)，2mM TBP(磷酸三丁酯)，0.1mM PMSF。

步骤(9)所述的孵育，优选在35℃下孵育2h。

所述的两性电解液，优选为IPG buffer。

通过以上步骤制备得到的红树植物秋茄叶片总蛋白可直接用于蛋白质定量(Bradford法)或双向电泳分析或分装后存于-80℃备用。

本发明的技术效果：

(1)、在研磨样品的过程中加入适量的PVPP，有效增强了植物组织中多酚的去除；

(2)、用含10％TCA的丙酮快速洗涤研磨后的植物粉末，有效增强了蛋白的沉淀作用和杂质的去除(主要是脂类或类脂多聚物、酚类物)，同时避免了蛋白长时间暴露低pH环境(含TCA)下，减少了由此而引起的蛋白降解和修饰；

(3)、用含10％TCA的丙酮洗完后增加了用含0.1M醋酸铵的80％甲醇洗涤步骤，这一步骤能有效地中和残余的TCA，使pH值增加至7以上，从而增强了后续苯酚对蛋白分离提取的效率；

(4)、苯酚与SDS溶液混合后作为提取蛋白的溶剂，不仅能有效去除蛋白中的盐类、酸性杂质，还有效地增强了蛋白的溶解性，其中SDS是膜结合蛋白恢复非常有效的助溶剂；

(5)、本发明通过联合传统提取蛋白的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同时引入助溶剂SDS溶液，并优化提取过程，建立了一种适合红树植物秋茄叶片总蛋白提取的Phe-B方法；本发明有效地提高了蛋白质的提取效率和质量，其技术方案可专门适合于双向电泳的秋茄叶片蛋白的提取。本发明方法具有操作简单、蛋白提取效率高、干扰物质少的特点，适合于蛋白提取困难、蛋白提取效率低、干扰物质多的材料；本发明所提取的秋茄叶片蛋白完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱，且实验重复性和稳定性好。

本发明适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法(Phe-B法)可以适用于红树植物(如秋茄、桐花树、老鼠簕等)。将本发明的Phe-B法与其它两种方法，Isaacson等人(Isaacson,T.,Damasceno,C.M.B.,Saravanan,R.S.,et al.Sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues.Nature Protocols,2006,1(2):769-774.)和于冯等人(于冯，郑春芳，施孟如等.红树植物秋茄叶片双向电泳技术体系的建立及优化.热带亚热带植物学报2011,19(6):519-523.)采用的三氯乙酸/丙酮沉淀法(简称TCA-A法)和Wang等人采用的苯酚抽提法(简称Phe法)(Wang,L.X.,Pan,DZ.,Li,J.,et al.Proteomic analysis of changes in the Kandelia candel chloroplastproteins reveals pathways associated with salt tolerance.Plant Science,2015,231:159-172.)得到的秋茄叶片蛋白，通过双向电泳检测提取效果，结果显示本发明的Phe-B法提取的蛋白等电聚焦效果最好，且能够得到更多的蛋白点。与TCA-A法相比，本发明的Phe-B法方法可以得到更多的蛋白条带，说明本发明可以更充分地提取高纯度的秋茄蛋白，而与Phe法相比，本发明Phe-B法对杂质的去除效果较好，蛋白条带的背景较Phe法更干净。进一步用Phe-B法提取秋茄的总蛋白，并进行了双向电泳，都得到了分辨率高，重复性好的秋茄总蛋白双向电泳图。因此，本发明的Phe-B法可以作为秋茄叶片总蛋白的提取方法，应用于秋茄蛋白组学的研究中，对其它红树植物蛋白的提取具有借鉴意义，应用前景广阔。

附图说明：

图1为TCA-A法提取秋茄叶片蛋白的双向电泳检测结果；

图2为Phe法提取秋茄叶片蛋白的双向电泳检测结果；

图3为本发明的Phe-B法提取秋茄叶片蛋白的双向电泳检测结果；

图4为TCA-A法、Phe法及本发明的Phe-B法提取秋茄叶片蛋白的得率比较；

图5为TCA-A法、Phe法及本发明的Phe-B法提取秋茄叶片蛋白的SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

目前常用的植物蛋白质提取方法主要有TCA-A法、Phe法。现以红树植物秋茄(Kandelia obovata)为材料，利用SDS-PAGE单向电泳和双向电泳比较TCA-A法、Phe法及本发明的Phe-B法的提取效果，其中本发明的Phe-B法包括以下步骤：

1、用Phe-B法提取秋茄叶片蛋白：

(1)、取2g新鲜秋茄叶片剪碎后，加入10％PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)(即每1g样品加入0.1g PVPP)于研钵中用液氮充分研磨，将研磨好的粉末转移至预冷的离心管中；

(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，加入10ml预冷的含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋1min，充分震荡后，于4℃，12,000rpm离心5min，弃上清；

(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7，于4℃，12,000rpm离心5min，小心去除上清；

(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，于4℃，12,000rpm离心5min，小心去除上清；

(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；

(6)、提取并沉淀蛋白：加入16ml体积比为1:1的苯酚/SDS缓冲液，其中，苯酚的pH值大于(或等于)7.8，充分混匀并孵育5min，12,000rpm离心5min，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，-20℃沉淀过夜，于4℃，12,000rpm离心20min，弃上清液，留沉淀；所述的SDS缓冲液，其配方为：30％(w/v)蔗糖，2％(w/v)SDS，0.1MTris-HCl(pH 8.0)，5％(v/v)β-巯基乙醇，1mM PMSF；

(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％的丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后并于4℃，12,000rpm离心5min，弃上清，留沉淀；

(8)、用枪头尽可能吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；

(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉-80℃保存备用或进行下一步的蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，在35℃下孵育2h，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，于4℃，12,000rpm离心30min后所得的上清即为适合双向电泳的秋茄叶片总蛋白；所述的样品裂解液，其配方为：7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS，0.2％(v/v)pH值为4-7的两性电解液(IPG buffer)(购自GE Healthcare公司)，50mM DTT，2mM TBP，0.1mM PMSF。

将TCA-A法、Phe法及本发明的Phe-B法提取的蛋白干粉分别按照以下步骤进行裂解及双向电泳过程。

2、蛋白裂解

(1)、向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉尽可能充分浸润、混匀，然后于35℃中水浴锅中孵育2h，期间不时地颠倒混匀，使蛋白质充分地溶解；

(2)、于4℃，12,000rpm离心30min；

(3)、上清即为适合双向电泳的秋茄叶片总蛋白。可直接用于蛋白质定量(考马斯亮蓝定量法)和双向电泳分析或分装后存于-80℃备用。

3、第一向等电聚焦(IEF)

(1)、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(含7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS，0.002％溴酚蓝，0.2％IPG buffer)一小管(1mL/管)，置室温溶解；

(2)、在小管中加入32.5μl 2M DTT(终浓度65mM DTT)，2μl IPG buffer(pH 4-7)(终浓度0.2％IPG buffer)，0.5μl 200mM PMSF(终浓度0.1mM PMSF)，充分混匀；

(3)、取2.5mg蛋白样品，加入适量上述小管中已准备好的水化上样缓冲液，终体积为340μl，充分混匀；

(4)、从冰箱中取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm，pH 4-7，购自Bio-Rad公司)，于室温放置10min；

(5)、沿着水化盘中槽(购自Bio-Rad公司)的边缘从左至右线性加入样品，在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液须连贯(注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布)；

(6)、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘(购自Bio-Rad公司)中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条(Bio-Rad)上的保护层；

(7)、将IPG胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上，不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，不要使胶条下面的溶液产生气泡；

(8)、于20℃下被动水化1h后，再在每根胶条上缓慢加入2-3mL矿物油覆盖，于20℃下继续被动水化14h(主动水化时间总计15h)；

(9)、分清胶条的正负极，将溶胀好的胶条胶面朝下置于等电聚焦仪(PROTEANⅠ12TM IEF Cell，购自Bio-Rad公司)的聚焦盘中，使胶条的正极对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触，对好正负极，并在每根胶条上重新缓慢加入2-3mL矿物油覆盖；

(10)、盖好盖子，设置等电聚焦程序，打开电源运行程序：

温度：20℃

(11)、聚焦结束的胶条，立即进行平衡和第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

4、第二向SDS-PAGE电泳

(1)、配制12％的SDS-PAGE凝胶(见表1)，厚度为1.5mm充分摇匀后注入固定好的玻璃板夹层中，上部留出大约0.5-1cm的空间，用超纯水压平液面(约1.5h)，待凝胶完全聚合后，倒掉上层水，并用超纯水冲洗，最后用SDS-PAGE电泳缓冲液(20mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS，pH 8.3)润洗，用滤纸吸干聚丙烯酰胺凝胶表层的液体；

表1. 12％SDS-PAGE凝胶的配方

(2)、从-20℃冰箱取出聚焦好的胶条，先于室温放置10min，使其溶解，将胶条胶面朝上放置在干的滤纸上，用超纯水浸湿过的滤纸轻轻吸去胶面上的矿物油；

(3)、将已配制好的存于-20℃冰箱的胶条平衡液母液(6M尿素，2％SDS(w/v)，0.375M Tris-HCL(pH 8.8)，20％(v/v)甘油)取出室温溶解，现加入2％(w/v)DTT配成胶条平衡缓冲液Ⅰ，将聚焦结束的胶条胶面朝上置胶条平衡缓冲液Ⅰ缓慢摇动14min；

(4)、另取一管已溶解的胶条平衡母液，现加2.5％(w/v)碘乙酰胺配成胶条平衡缓冲液Ⅱ，将第一次平衡结束的胶条放进胶条平衡缓冲液Ⅱ中，摇床缓慢摇动14min；

(5)、从平衡液中取出的胶条，用滤纸小心吸去胶条表面多余的平衡缓冲液Ⅱ，用镊子夹起胶条的一端，使其完全浸入SDS-PAGE电泳缓冲液工作液中，然后将胶条胶面朝上放置在长玻璃板上；

(6)、将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移至灌胶架上，短玻璃板一面朝着自己，在凝胶上方加入已溶解的低熔点琼脂糖封胶液，用镊子小心由一端慢慢压向另一端将胶条向下推入，注意胶条下方不能留有任何气泡，使胶条与凝胶面紧密接触，注意不要碰到胶面，滤纸条上加入蛋白maker，并小心插入胶条的酸性端或碱性端，静置10min至低熔点琼脂糖彻底凝固；

(7)、琼脂糖封胶液完全凝固后，将固定的凝胶玻璃板，固定在电泳槽(ProteanⅡ，购自Bio-Rad公司)中，加入一定量的电泳缓冲液工作液，接通电源后，第二向蛋白电泳开始进行，初始电压50v/gel，1h(17cm)，等到蛋白完全转移出胶条，进入凝胶且压平至一条线，加大电压至200V/gel，5.5h(17cm)，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时即可停止电泳。

5、考马斯亮蓝染色

电泳结束后，取出玻璃板，轻轻撬开短玻璃板，取出凝胶，并切角作标记(戴手套，防止污染胶面)进行考染。染色步骤如下：

染色：将胶放入考染液(0.2％考马斯亮蓝R-250，甲醇：乙酸：水＝40：10：50)轻轻晃动染色30min。

脱色：弃去染色液，在脱色液(甲醇：乙酸：水＝40：10：50)脱色1.5h，中间每隔0.5h换一次脱色液。然后置超纯水中脱色1天，间隔换水，去底色。

6、凝胶图像扫描及分析

经过考染的凝胶用扫描仪(GS-800calibrated Densitometer，购自Bio-Rad公司)扫描，图像转化成TIFF格式，用ImageMaster 2D Platinum7.0软件对蛋白质凝胶图像进行分析处理。

本实施例中的双向电泳结果表明，本发明的Phe-B法和Phe法得到再溶解的蛋白点比TCA-A法多，而且条纹拖尾也比TCA-A法少。如图3所示，Phe-B法和Phe法的2-DE图谱上的蛋白点个数明显比点TCA-A法得到的点多。此外，2-DE图点与点的比较显示，Phe法中的几乎所有蛋白点都被包含在Phe-B法的2-DE蛋白谱图中。相比Phe法和TCA-A法而言，Phe-B法得到的蛋白点的数目是最多的，蛋白带清晰度和分辨率也是最好的，其次是Phe法的(如图2所示)，最差的是TCA-A法(如图1所示)。

为了更好地对本发明的方法进行评价，将两种常用的植物叶片蛋白的提取方法(TCA-A法和Phe法)与本发明方法(Phe-B法)的蛋白得率分别进行了比较。上述三种方法提取的秋茄叶片总蛋白的蛋白得率(如图4所示)结果显示，这三种方法提取秋茄叶片蛋白的产量明显有差别。本发明中优化建立的Phe-B法提取秋茄叶片蛋白的产量明显高于传统的Phe法和TCA-A法的产量。

此外，还对上述三种方法提取得到的秋茄叶片总蛋白分别进行了SDS-PAGE单向电泳。如图5所示，结果显示这三种蛋白提取方法获得的蛋白提取物在SDS-PAGE胶上的分离存在着很大的差异。Phe-B法和Phe法获得的蛋白提取物比TCA-A法中包含更多的蛋白多肽。Phe-B法获得的蛋白条带分布范围较宽，从6.5kDa到116kDa之间，且与TCA-A法和Phe法比较而言，Phe-B法具有更少的拖尾，背景值也更低。表明Phe-B法方法获得的蛋白得到很好的再溶解，且获得的蛋白提取物所包含的杂质也更少。此外，三种方法得到的蛋白提取物中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的丰度也存在着差异，如图5中的箭头所示。Phe-B法所得到的蛋白提取物中Rubisco的含量最低，这样就有利于植物中其它低丰度蛋白的分离与分析。

本发明的Phe-B法获得的蛋白产量最高、在2-DE图上得到的蛋白点最多，背景杂质、拖尾和条纹最少。本发明的方法更适合于秋茄叶片总蛋白的提取，对其它红树植物蛋白质的提取都有重要的借鉴意义，可广泛地应用于红树植物的蛋白组学研究中，应用前景广阔。

Claims (5)

1.一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每1g样品加入0.1g的PVPP，于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；

(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，每1g样品加入5ml预冷含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清；

(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7以上，离心后去除上清；

(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后去除上清；

(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；

(6)、提取并沉淀蛋白：每1g样品加入8ml体积比为1:1的苯酚/SDS缓冲液，其中，苯酚的pH值大于等于7.8，充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉淀；

(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀；

(8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；

(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白；所述的样品裂解液，其配方为：7M尿素，2M硫脲，质量体积比为4％CHAPS，体积比为0.2％pH值为4-7的两性电解液，50mM DTT，2mM TBP，0.1mM PMSF。

2.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的SDS缓冲液，其配方为：质量体积比为30％的蔗糖，质量体积比为2％SDS，0.1M pH值为8.0的Tris-HCl，体积比为5％的β-巯基乙醇，1mM PMSF。

3.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的沉淀过夜，其温度为-20℃。

4.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，步骤(9)所述的孵育，是在35℃下孵育2h。

5.根据权利要求1所述的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，所述的两性电解液为IPG buffer。