CN102321149B

CN102321149B - 红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法

Info

Publication number: CN102321149B
Application number: CN 201110275526
Authority: CN
Inventors: 郑春芳; 于冯; 陈少波; 施梦茄; 刘伟成; 艾为明; 谢起浪; 李尚鲁; 陈骁; 仇建标; 周志明; 黄丽; 马小伟
Original assignee: Zhejiang Mariculture Research Institute
Current assignee: Zhejiang Mariculture Research Institute
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-09-16
Also published as: CN102321149A

Abstract

本发明提供经济、简便、易行、快速的适用于红树植物的总蛋白的提取以及双向电泳方法，经反复实验证明该方法样品制备的重复性好且图谱清晰，其技术方案可专门适用于红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法。本发明使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白质，20%的TCA可以更好的去除盐离子，其中80%浓度的丙酮则对蛋白质与缩合单宁的复合物的分离作用效果显著，可较好分离该复合物，去除单宁，提高蛋白质浓度，用20%TCA-丙酮所提取的红树植物蛋白质含量较高，2-DE电泳图谱清晰，且操作简单，重复性好，试剂毒性较低。

Description

红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法

技术领域

本发明涉及关于红树植物的蛋白组学，尤其涉及其总蛋白的提取以及双向电泳方法。

背景技术

红树林（mangrove）是一种稀有的木本胎生植物。它生长于热带和亚热带陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。红树林肩负优化环境和促进经济社会发展的双重使命，有着无可比拟的生态价值，在防风消灾、提高生物多样性、净化大气和水体环境等方面具有重要的生态意义和巨大经济价值，也是中国南部沿海区域生态平衡最重要的生态安全保障体系之一。尤其红树林生态系统产生的生态、经济、社会、文化、再造功能及其他价值，已在中国和世界受到广泛重视。随着全球气候的变暖，产生了应对气候变化红树林北移现象。随着科技的进步，人们发现基因表达产物——蛋白质的变化，是导致生命功能失常的直接因素。因此对红树植物耐寒性蛋白的研究对于应对气候变化红树林北移的研究具有重要意义。

双向电泳是研究蛋白质表达变化最有效的工具之一。它利用等电点和分子量两个性质对蛋白质进行分离,可以使样品中的数千种蛋白质得到很好的分离。而蛋白质的样品制备是双向电泳的关键步骤，但是由于植物组织由于富含色素、多酚、多糖、有机酸等次生代谢物质和蛋白酶,其蛋白样品制备一直较为困难。红树植物又生长在陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，因其特殊的生长环境，在其化学成分和生理活性方面都具有很多特殊性，其体内除含有多种次生代谢物质外还含有大量盐分和单宁,盐离子的存在严重干扰等电聚焦的进行，单宁根据结构的不同可分为：水解单宁和缩合单宁，缩合单宁能与蛋白质结合并形成复合物，严重影响蛋白质的提取分离。因此，红树植物蛋白质提取较其他植物更为困难，具有其特殊性和复杂性。而双向电泳技术在植物中的应用主要集中在水稻、小麦或其他一些草本植物上，在红树植物中的应用报道较少。

发明内容

为方便对红树植物蛋白质做进一步的研究和分析，本发明提供经济、简便、易行、快速的适用于红树植物的总蛋白的提取以及双向电泳方法，经反复实验证明该方法样品制备的重复性好且图谱清晰。

本发明提供的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，技术方案是依次进行下列步骤：

a、将定量的红树植物叶片置于液氮中研磨充分，将粉末转至离心管中，加入4倍体积20%的TCA-丙酮溶液，涡旋混匀后，置于低温下沉淀；

b、离心后收集沉淀，将该沉淀用预冷的丙酮洗涤，于低温高速涡旋离心后收集沉淀，再将沉淀置于室温晾干；

c、向步骤b得到的沉淀加入裂解缓冲液，低温下溶解后离心，取上清液为蛋白提取样品；

d、用Bradford法测定步骤c得到的蛋白提取样品的蛋白质含量；

e、进行第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：将步骤c得到的蛋白提取样品以及含电泳指示剂的上样缓冲液加入聚焦盘中，将IPG胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油，设置好等电聚焦程序；

f、进行胶条平衡：等电聚焦后的IPG胶条依次在第一平衡缓冲液和第二平衡缓冲液中平衡，然后转移至SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶；

g、进行第二向SDS-PAGE电泳：先用低电流的恒流电泳，再加大电流直至电泳指示剂到达胶的底端即可停止电泳。

h、取步骤g电泳后得到的凝胶进行高灵敏度染色。

本发明所提供的技术方案可专门适用于红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法。因为TCA和丙酮可用于沉淀蛋白质和双向电泳样品制备过程中去除单宁和盐分，但是过高的TCA浓度在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，且TCA可能渗入高丰度蛋白质分子内部而难以完全除去，也会影响高分子蛋白的提取，不易被丙酮彻底抽提，因此TCA的浓度是影响红树植物蛋白质提取的主要因素，过高或过低的TCA浓度都将影响到蛋白质的提取及其后续电泳的效果。本发明步骤a使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白质，20%的TCA可以更好的去除盐离子，其中80%浓度的丙酮则对蛋白质与缩合单宁的复合物的分离作用效果显著，可较好分离该复合物，去除单宁，提高蛋白质浓度，用20% TCA-丙酮所提取的红树植物蛋白质含量较高，2-DE电泳图谱清晰，且操作简单，重复性好，试剂毒性较低。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，在上述技术方案的基础上，步骤e的等点聚焦程序包括依次进行下列步骤：无电压慢速水化4小时，250伏电压慢速水化0.5小时，500伏电压慢速除盐0.5小时，1000伏电压快速除盐1.5小时，1000伏电压线性升高至10000伏电压3小时，10000伏电压聚焦65000总电压时间积，500伏电压保持18小时。此改进方案是对第一向固定pH梯度等电聚焦电泳的优化，专门适用于红树植物的双向电泳方法：第一步无电压泡胀即被动水化4小时，目的使大部分蛋白进入IPG胶条。但高分子蛋白很难进入IPG胶条，故选用低电压250V主动水化0.5小时，使大分子蛋白进入胶内。由于蛋白质样品含盐量较高，故选用除盐500伏 0.5小时和除盐1000 伏 1.5小时，减少盐离子对样品聚焦的影响。因为IPG的导电性较弱，需要使用2000伏以上的高电压才能使蛋白聚焦，故我们设定1000伏线性上升3小时，使电压缓慢升高至10000伏，避免电压过高烧胶胶条。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，步骤c中的裂解缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS，40mmol/L Tris，2mmol/L TBP，0.2% Bio-lyte。该配方提供了专用于红树植物的蛋白质提取的裂解缓冲液，其中各试剂作用分别是：尿素用于破坏蛋白高级结构，打断非共价连接的离解剂；硫脲不仅对膜蛋白有极为明显的增溶效果，而且对核蛋白等微溶性蛋白质以及对等电点附近蛋白沉积都有改善，还可抑制蛋白酶活性，但其水中溶解度低，只在高浓度尿素中才溶解，因此浓度为2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素；CHAPS用于两性离子型去污剂，可打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白溶解性，CHAPS与尿素、硫脲同时使用，对膜蛋白的增溶作用突出；TBP是非离子型还原剂，打开二硫键，保持蛋白处于还原状态，较低浓度既可提高蛋白溶解性，而且不会电场中迁移。在等电聚焦过程中保持蛋白还原状态，同时简化了两向转移间的平衡操作；Bio-Lyte是两性电解质，具有在聚焦过程中不改变pH梯度前提下提供稳定导电的能力。因两性电解质会在电场中迁移聚焦，故浓度不应过高。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，步骤e中的上样缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝，上样缓冲液中的溴酚蓝在电泳里起指示作用，其余试剂与前述裂解缓冲液保持一致，使蛋白质提取以及电泳环境一致，提高蛋白质电泳效果得到清晰电泳图谱。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，其步骤f中的第一平衡缓冲液包括1%DTT，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油，步骤f中的第二平衡缓冲液包括2.5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油。该第一和第二平衡缓冲液是针对红树植物特性所做出的试剂配方，能提高蛋白质电泳效果并得到清晰电泳图谱。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，步骤c得到蛋白提取样品后用clean-up试剂盒纯化。经clean-up试剂盒纯化后的蛋白样品中所含杂质大幅减少，其电泳图谱背景清晰，蛋白点分离较好。

本发明提供改进的红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法，步骤e使用的IPG胶条规格为pH3-10NL，红树植物蛋白质pH大都分布在4-7左右，其酸性端和碱性端蛋白分布较少，为了保证大部分蛋白得到很好的分离且不丢失酸碱两端的少量蛋白，采用pH 3-10 NL的IPG胶条。此种胶条的pH非线性分布，在pH 4-7范围分布较宽，在pH 3-4和7-10范围分布较窄，这样既保证了红树植物大多数蛋白点的较好分离，又不会丢失酸碱两端蛋白，真正做到蛋白质的完全分离。

本发明所称的红树植物包括木榄、秋茄、桐花等品种。

下面结合附图、具体实施例以及对比例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为实施例一红树植物秋茄蛋白质提取以及双向电泳方法所获的图谱。

图2为实施例二红树植物秋茄蛋白质提取以及双向电泳方法所获的图谱。

图3为实施例三红树植物桐花蛋白质提取以及双向电泳方法所获的图谱。

具体实施方式

实施例一

采用Eppendorf超速离心机、双向电泳PROTEANIIXi/XL Cell（美国 BIO-RAD公司）

（1）采集秋茄新鲜叶片（倒二对嫩叶）；

（2）称取1g叶肉，置于液氮中研磨充分；将粉末转至离心管中，加入4倍体积20%的TCA-丙酮中溶液中，涡旋，4℃沉淀过夜；

（3）4℃，12000r/min离心30min后收集沉淀，将该沉淀用4℃预冷的丙酮（含2 %β-巯基乙醇）洗涤，涡旋，4℃，12000r/min离心10min后收集沉淀，重复三次，沉淀置室温晾干；

（4）向步骤（3）得到的红树植物秋茄叶片全蛋白粗提物中加入裂解缓冲液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte）后，4℃溶解过夜，4℃，12000r/min离心30min，取上清即为秋茄叶片蛋白溶液；

（5）用clean-up试剂盒纯化蛋白，得到红树植物秋茄叶片全蛋白双向电泳样品液；

（6）蛋白质定量：用Bradford法测定蛋白质含量，用吸光光度计测量波长595nm，做标准曲线，测定蛋白浓度；

（7）测得蛋白浓度为11.5μg/μL，样品进行双向电泳试验；

（8）第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：采用低电压胶内泡涨法，将400ug蛋白样品与上样缓冲液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝）共300ul混合后加入聚焦盘中，选用pH3-10 NL、17cm胶条，IPG胶条胶面朝下放入水化液，加盖3mL矿物油。聚焦参数见下列表1：

表1 IEF电泳参数

Table 1 IEF electrophoresis parameters

（9）胶条平衡：等点聚焦后的IPG胶条依次在含1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液（6mol/L尿素，2%SDS,50mol/L Tris-HCl Ph 8.8,20%甘油）中各平衡15min，转移至8%-16%线性梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封顶；

（10）第二向SDS-PAGE电泳：使用垂直电泳，胶浓度为12%，以恒流10mA/gel电泳15min，再加大电流至30mA/gel直至溴酚蓝达到胶的底端，温度控制在15-20℃；

（11）银染：按照下列表2方法进行高灵敏度银染；

表2 硝酸银染色流程

（12）凝胶图像的采集：凝胶用GS-800图像扫描仪投射扫描，分辨率为：63.5×63.5 microns，获得图1所示的电泳图谱。

实施例二

（1）采集秋茄新鲜叶片（倒二对嫩叶）；

（7）测得蛋白浓度为9.4μg/μL，样品进行双向电泳试验；

（8）第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：采用低电压胶内泡涨法，将400ug蛋白样品与上样缓冲液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝）共300ul混合后加入聚焦盘中，选用pH3-10 NL、17cm胶条，IPG胶条胶面朝下放入水化液，加盖3mL矿物油。聚焦参数见下列表3；

表3 IEF电泳参数

Table 1 IEF electrophoresis parameters

（11）银染：按照下列表4方法进行高灵敏度银染；

表4 硝酸银染色流程

（12）凝胶图像的采集：凝胶用GS-800图像扫描仪投射扫描，分辨率为：63.5×63.5 microns，获得图2所示的电泳图谱。

实施例三

（1）采集红树植物桐花新鲜叶片（倒二对嫩叶）；

（4）向步骤（3）得到的红树植物桐花叶片全蛋白粗提物中加入裂解缓冲液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte）后，4℃溶解过夜，4℃，12000r/min离心30min，取上清即为桐花叶片蛋白溶液；

（5）用clean-up试剂盒纯化蛋白，得到红树植物桐花叶片全蛋白双向电泳样品液；

（7）测得蛋白浓度为14.1μg/μL，样品进行双向电泳试验；

（8）第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：采用低电压胶内泡涨法，将400ug蛋白样品与上样缓冲液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝）共300ul混合后加入聚焦盘中，选用pH3-10 NL、17cm胶条，IPG胶条胶面朝下放入水化液，加盖3mL矿物油。聚焦参数见下列表5：

表5 IEF电泳参数

Table 1 IEF electrophoresis parameters

（11）银染：按照下列表6方法进行高灵敏度银染；

表6 硝酸银染色流程

（12）凝胶图像的采集:凝胶用GS-800图像扫描仪投射扫描，分辨率为：63.5×63.5 microns，获得图3所示的电泳图谱。

总结：综上所述，如图1、图2、图3所示，本发明的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法最终所获得电泳图谱图像较为清晰，分辨率较高，图中蛋白点容易辨认且清楚，试验的重复性好，可适用于红树植物叶片蛋白质组学研究。

对比例一

使用酚抽提法

采用Eppendorf超速离心机

（1）采集红树植物秋茄新鲜叶片（倒二对嫩叶）；

（2）称取1g叶肉，置于液氮中研磨充分；将粉末转至离心管中，加入4倍体积提取液（100 mmol/L Tris，50 mmol/L抗坏血酸，50 mmol/L 硼砂，1% Triton X100，2 % β-巯基乙醇，1% PVPP，9 mol/L Urea，1 mmol/L PMSF），待其融化后，继续研磨数分钟，转至离心管中；

（3）加入等体积pH为8.0的Tris饱和酚，涡漩，离心（10000 r/min，4 ℃） 10 min；

（4）取酚层于50 mL离心管中，加入等体积提取液抽提，离心（11000 r/min，4 ℃，20 min）；

（5）加入5倍体积0.1 mol/L 乙酸铵甲醇溶液，-20 ℃沉淀过夜；

（6）离心（14000 r/min ,4 ℃）30 min，弃上清液；

（7）沉淀用-20 ℃预冷甲醇洗涤1 次，再以-20 ℃含2% β-巯基乙醇的丙酮洗涤2次，室温干燥，得蛋白质粉末；

（8）向蛋白质干粉中加裂解液（2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte）后，4℃溶解过夜；

（9）4℃，12000r/min离心30min，取上清即为秋茄叶片蛋白溶液；

（10）用clean-up试剂盒纯化蛋白，得到红树植物秋茄叶片全蛋白双向电泳样品液；

（11）蛋白质定量：用Bradford法测定蛋白质含量，用吸光光度计测量波长595nm，做标准曲线，测定蛋白浓度；

（12）试验重复6次，测得蛋白浓度平均值为1.7μg/μL，浓度过低，不能进行双向电泳试验，试验失败。

对比例二

使用10 %TCA 丙酮溶液抽提法

采用Eppendorf超速离心机

（1）采集秋茄新鲜叶片（倒二对嫩叶），

（2）称取1g叶肉，置于液氮中研磨充分；加4ml - 20 ℃预冷的10 %TCA 丙酮溶液，涡漩，- 20 ℃沉淀2h以上；

（3）4℃，15000r/min离心20min，弃上清液,沉淀用丙酮(含2 %β2巯基乙醇, - 20 ℃预冷) 洗涤3 次,室温干燥；

（7）试验重复6次，测得蛋白浓度平均值为2.3μg/μL，浓度过低，不能进行双向电泳试验，试验失败。

总结：综上所述，由对比例一可知，酚抽提法提取的秋茄叶片蛋白样品含量较低，这可能是因为酚抽提法不能克服单宁对秋茄叶片中蛋白的结合作用，导致蛋白浓度过低，且酚抽提过程中，大多数水溶性化合物，如多糖、核酸等留在了水相中，而多酚和脂质等化合物则与蛋白质共提取和共沉淀。而20%TCA-丙酮沉淀法很好地解决了这个问题，提取的蛋白质产量高，是传统酚抽提法的产量的数倍。改良的20% TCA-丙酮沉淀法对红树植物叶片全蛋白的提取效果明显优于酚抽提法。由对比例二可知，本发明改良后的TCA-丙酮沉淀法中TCA的浓度加倍，可以更好的去除盐离子，但是TCA在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，且TCA可能渗入高丰度蛋白质分子内部而难以完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解，因此若TCA浓度过高，也会影响高分子蛋白的提取，且不易被丙酮彻底抽提，因此TCA的浓度对秋茄叶片蛋白质的提取有重要影响。用本发明提供的20% TCA-丙酮提取红树植物叶片的蛋白质含量较高，2-DE电泳图谱清晰。

Claims

1.一种红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于依次进行下列步骤：

d、用Bradford法测定步骤c得到的蛋白提取样品的蛋白质含量；

g、进行第二向SDS-PAGE电泳：先用低电流的恒流电泳，再加大电流直至电泳指示剂到达胶的底端即可停止电泳；

h、取步骤g电泳后得到的凝胶进行高灵敏度染色。

2.根据权利要求1所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于所述步骤e的等电聚焦程序包括依次进行下列步骤：无电压慢速水化4小时，250伏电压慢速水化0.5小时，500伏电压慢速除盐0.5小时，1000伏电压快速除盐1.5小时，1000伏电压线性升高至10000伏电压3小时，10000伏电压聚焦65000总电压时间积，500伏电压保持18小时。

3.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤c中的裂解缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS，40mmol/L Tris，2mmol/L TBP，0.2% Bio-lyte。

4.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e中的上样缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝。

5.根据权利要求3所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e中的上样缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝。

6.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤f中的第一平衡缓冲液包括1%DTT，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油，所述步骤f中的第二平衡缓冲液包括2.5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油。

7.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤c得到蛋白提取样品后用clean-up试剂盒纯化。

8.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e使用的IPG胶条规格为pH3-10NL。