CN104087640A

CN104087640A - 一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法

Info

Publication number: CN104087640A
Application number: CN201410323399.7A
Authority: CN
Inventors: 郝林琳; 李思明; 刘松财; 陆超; 焦安龙; 张鑫; 丁克祥
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2014-10-08

Abstract

本发明提供一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，采用弱酸溶液浸提鹿茸天然多肽，剩余的副产物采用中性蛋白酶酶解，结合超滤精制制得，获得更高的溶解度；本发明提取的鹿茸多肽接近于人的皮肤耐受pH值，在配置产品时易于获得较大的溶解度，并且本工艺提取的多肽pH值对皮肤的刺激小。采取了酸解和酶解两步法提取鹿茸多肽，大大提高了鹿茸多肽的提取率，对原材料的利用效率更高，1000Da以下的多肽提取率由0.44%提高至2.64%，并且其副产物酶解制得的多肽具有生物学活性。采用分级超滤精制，制得的多肽90%为分子量低于1000Da的多肽，利于人的皮肤和粘膜的吸收。为鹿茸多肽在化妆品或在皮肤外用制剂中的应用提供了广泛范围用途。

Description

一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法

技术领域

本发明提供一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，属于生物技术提取技术领域。

背景技术

鹿茸生长迅速(生长速度为1～2 cm/d），并且具有再生特点，是天然的细胞生长因子库。随着对鹿茸研究的深入，人们已开始重视对鹿茸中具有生物活性的多肽、蛋白质即生长因子的开发利用。中国专利CN 100339387C公布了采用pH3.5酸解后40-60%乙醇浸提多肽的工艺，获得了4%提取率的500 000 Da以下的提取物，但在实际应用中，发现该提取物在pH3.5酸性溶液中易于溶解，却不易溶解于中性或碱性溶液中。皮肤可承受的pH范围为5.5-7.5，而以上制备方法获得的产物在此pH范围内多为难溶或溶解后易于产生沉淀，同时，高浓度的乙醇不仅大大增加了处理体积，还引入了有机溶剂污染，增加了对皮肤的刺激，极大的限制了该制品作为化妆品原料或应用于皮肤外用制剂。中国专利CN 101068556 B采用水浸提鹿茸，制得了提取率为4.42%的500-500 000 Da的水溶性提取物，虽然该技术解决了溶解性的问题，但以上两个专利制备的多肽中绝大部分为不易被皮肤吸收的分子量大于1 000 Da的分子，而其中易于被皮肤吸收的1 000 Da以下的多肽仅占其中的1%以下。2011年，广州皇莎化妆品有限公司（申请号：102225967 A）提出了采用pH7.2缓冲液粗提后50-75%乙醇浸提的策略，文内未提及制备的多肽分子量范围、提取率及溶解性，经过实验检测，发现乙醇醇沉获得的多肽仍然存在难稳定溶解于中性溶剂和分子量分布广泛等限制于其应用于皮肤的弊端。霍玉书（CN 1104095 A）采用pH5-9的条件浸提鹿茸多肽，超滤精制获得分子量5 000-50 000Da的鹿茸生长因子，该制品溶解性好，广泛应用于医药领域，但其制品的分子量范围却严重限制了其在皮肤外用中的有效利用率。此外，专利CN 1481814A公布了酸溶性冻干鹿茸提取物的提取方法，专利CN 1425387A 公布了pH1-3的酸解提取方法，专利CN101554473A经强电场萃取制得含IGF-1的鹿茸多肽，存在在中性溶液中溶解性不好，有机溶剂污染等弊端。

鹿茸多肽的酶解制品，新近才见报道，中国专利CN 102286561 A采用碱性蛋白酶在pH9-12 65℃条件下降解6 h，之后95℃ 15 min灭酶，该酶解条件剧烈，极大的损失了不耐热的成分。在后续的精制中，将该制品溶解于pH2-5的溶液中，强酸性阳离子交换树脂浸泡18-20 h，溶剂pH的反差巨大，损失了大部分鹿茸多肽的酶解产物。中国专利 CN 103169942 A公布了一种制备鹿茸胶原蛋白的酶解方法，pH6-8，20-35℃条件下，采用复合生物催化剂水解获得了澄清金黄色鹿茸水解液，但未进行制品的超滤精制，制品中仍存留有未水解充分的大分子物质，严重影响了其透皮吸收的有效利用。

以上等专利技术所用的方法均为一次性提取，未能充分利用原料，剩余原料残渣中仍然含有大量多肽类生长因子，造成资源的极度浪费。关于鹿茸活性成分的系列提取，仅见专利CN 1771993 A，采用的是超临界CO₂萃取鹿茸中脂溶性成分，该技术重点解决的是鹿茸蛋白质和肽类以外的活性成分的制备。

发明内容

本发明公开一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，采用弱酸溶液浸提鹿茸多肽，鹿茸粉碎的残渣及酸提取多肽的全部副产物利用中性蛋白酶酶解，分级超滤制备分子量低于1 000 Da的酸解多肽和酶解多肽，制品有利于皮肤或粘膜的吸收，并避免了残留的强酸或醇对皮肤的刺激。

本发明所述的一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，其技术解决方案如下：

1）材料预处理：

新鲜或冰鲜鹿茸称重、切片；

2）提取：

加入预冷的10~30倍体积pH 4.2~4.8的醋酸—醋酸钠水溶液，置于4 ℃环境下搅拌提取4~8h，100~1 000目滤布粗滤，取上清液即为酸解多肽粗提取液，滤渣用于后续的酶解提取；

3）将步骤2）制得的酸解多肽粗提取液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤（浓缩液用于后续的酶解提取），滤液经10 000Da滤膜超滤（浓缩液用于后续的酶解提取），滤液进行300 Da纳滤浓缩；

4）合并步骤2）的滤渣，步骤3的1 μm滤膜和10 000Da滤膜超滤浓缩液，测得体积和浓度，计算质量；

5）加入2倍体积的蒸馏水，搅拌均匀，用1 M的NaOH溶液调pH至5.5-7.5，加入中性蛋白酶（1000~2000）Μ/g，在水浴温度45-65℃下酶解提取2-4 h；

6）滤布粗滤后，步骤5）制得的酶解多肽提取液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤，透过液经10 000Da滤膜超滤，透过液进行300Da滤膜纳滤浓缩，取浓缩液即为酶解多肽提取液；

7）酸解多肽和酶解多肽的纳滤浓缩液加2-4%甘氨酸冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12~24 h至成粉末状），得酸解多肽和酶解多肽。

鹿茸中绝大多数的蛋白质或多肽是与结合蛋白或受体结合的方式存在于体内的，已知解离蛋白质和其partner的方法有酸性凝胶层析和酸醇抽提法，可以去除85-90% 的结合蛋白。传统的提取技术一般采用pH 1.0-3.5的强酸进行蛋白质和其partner的解离，本发明采用弱酸溶液进行解离，在获得理想的提取效率的同时，有效的解决了制品在中性溶液中的溶解度低问题。在实验中发现，鹿茸多肽制品往往能够较好的溶解于提取的pH值或其临近pH条件下，在其他的pH值条件下，即使暂时溶解也会出现久置后出现沉淀的现象，成为制约鹿茸多肽制品产品质量和皮肤外用的一个严重限制因素。采用pH4.2以上的弱酸解离与partner结合着的鹿茸多肽，适当延长解离时间，既可以有效制得鹿茸多肽，又使得制品在皮肤耐受pH （5.5-7.5）条件下获得良好的溶解度，同时，会避免酸解过度而破坏最重要的天然多肽的活性；醋酸-醋酸钠溶液无毒无副，易挥发去除；没有采用酸醇抽提法，避免了有机溶剂的污染，减少了处理体积和冻干之前除醇的步骤。

在生物制品技术领域，超滤的透过液分子量范围一般为滤膜提示分子量的1/3或以下，皮肤吸收物质的分子量范围一般为1000 Da以下；本发明采用选用10 000Da的滤膜超滤，在滤过液中可以有效收集分子量低于1000 Da的天然肽类因子，又去除了制品中分子量较大的成分，使得制品的分子量较小，易于皮肤和粘膜的吸收，有效提高多肽的利用率。

中性蛋白酶消化蛋白质的原理为切断蛋白质内部肽键，可以有效的将大分子蛋白水解为肽。此外，该酶反应条件温和，一般在pH5.5-7.5范围内可以有效水解，使得制备的多肽易于溶解于中性溶剂也是选用该酶的重要原因。

本发明的积极效果在于：

采用弱酸溶液浸提鹿茸天然多肽，剩余的副产物采用中性蛋白酶酶解，结合超滤精制制得，获得在中性pH溶液中更高的溶解度；本发明提取的鹿茸多肽采用的pH值接近于人的皮肤耐受pH值，在配置产品时易于获得较大的溶解度，并且本工艺提取的多肽对皮肤的刺激小。采取了酸解和酶解两步法提取鹿茸多肽，大大提高了鹿茸多肽的提取率，对原材料的利用效率更高，1 000Da以下的多肽制得率由0.44%提高至2.64%，并且其副产物酶解制得的多肽具有生物学活性。采用分级超滤精制，制得的酸解多肽99.1%以上为分子量低于1 000Da的多肽，而酶解多肽88.03%以上为分子量低于1 000Da的多肽，利于皮肤和粘膜的吸收。为鹿茸多肽在化妆品或在皮肤外用制剂中的应用提供了广泛范围用途。

本发明制备工艺简便，分别制得酸解多肽和酶解多肽，提高了鹿茸多肽提取率的同时有效的解决了鹿茸多肽在中性pH溶剂中难溶解的问题，避免了残留的强酸或醇对皮肤的刺激。对仪器设备要求低，易于实现大规模生产。

附图说明

图1为MTS法检测鹿茸酸解多肽作用于HaCaT细胞并且促进细胞增殖柱形图；

图2为流式细胞技术检测鹿茸酸解多肽作用于HaCaT细胞并抑制细胞凋亡柱形图；

图3为MTS法检测鹿茸酶解多肽作用于HaCaT细胞并且促进细胞增殖柱形图；

图4为流式细胞技术检测鹿茸酶解多肽作用于HaCaT细胞并抑制细胞凋亡柱形图；

图5为鹿茸酶解多肽对于增强HaCaT细胞CAT活力的作用；

图6为鹿茸酶解多肽对于提高HaCaT细胞hyp含量的作用；

图7为鹿茸酶解多肽标准品；

图8为本发明鹿茸酸解多肽分子量范围；

图9为本发明鹿茸酶解多肽分子量范围。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

购置冰鲜鹿茸，将鹿茸切片，粉碎后称重，共1089g，加入20倍的预冷的pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液，制成匀浆，置于4 ℃环境下用增速搅拌器匀速搅拌提取4 h，500目滤布过滤（收集此步滤渣用于后续的酶解提取），滤出液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），滤液经10 000Da滤膜超滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），滤液进行300 Da纳滤浓缩至1 000 mL。纳滤浓缩液加4%冻干保护剂（40 g）冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酸解多肽冻干粉末2.7 g，酸解多肽得率为0.24%。

合并以上步骤的滤布滤渣，1 μm滤膜和10 000Da滤膜超滤浓缩液，测得体积和浓度，计算质量为440 g，加入2倍体积的蒸馏水，搅拌均匀，用1 M的NaOH溶液调pH至6.5，加入中性蛋白酶1 000 Μ/g，在水浴温度65℃下酶解提取2 h。滤布粗滤后，分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤，滤液经10 000Da滤膜超滤，透过液进行300 Da纳滤浓缩至1 000 mL，取浓缩液即为酶解多肽提取液。加4%甘氨酸（40 g）作为冻干保护剂冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酶解多肽冻干粉27 g，酶解多肽得率为2.4%。

实施例2

购置冰鲜鹿茸，将鹿茸切片，粉碎后称重，共1013g，加入20倍的预冷的pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，制成匀浆，置于4 ℃环境下用增速搅拌器匀速搅拌提取6h，100目滤布过滤（收集此步滤渣用于后续的酶解提取），滤出液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），滤液经10 000Da滤膜超滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），滤液进行300 Da纳滤浓缩至1 000 mL。纳滤浓缩液加4%冻干保护剂（40 g）冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酸解多肽冻干粉末2.9 g，酸解多肽得率为0.28%。

合并以上步骤的滤布滤渣，1 μm滤膜和10 000Da滤膜超滤浓缩液，测得体积和浓度，计算质量为510 g，加入2倍体积的蒸馏水，搅拌均匀，用1 M的NaOH溶液调pH至6.5，加入中性蛋白酶1500 Μ/g，在水浴温度55℃下酶解提取3h。滤布粗滤后，分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤，滤液经10 000Da滤膜超滤，滤液进行300Da纳滤浓缩至1 000 mL，取浓缩液即为酶解多肽提取液。加4%甘氨酸（40 g）作为冻干保护剂冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酶解多肽冻干粉22 g，酶解多肽得率为2.1%。

实施例3

购置新鲜鹿茸，将鹿茸切片，粉碎后称重，共998 g，加入30倍的预冷的pH4.8 的醋酸-醋酸钠缓冲液，制成匀浆，置于4 ℃环境下用增速搅拌器匀速搅拌提取8 h，1000目滤布过滤（收集此步滤渣用于后续的酶解提取），滤出液滤布粗滤，分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），滤液经10 000Da滤膜超滤（收集此步浓缩液用于后续的酶解提取），透过液进行300 Da纳滤浓缩至1000 mL。纳滤浓缩液加4%冻干保护剂（40 g）冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酸解多肽冻干粉末3.1g，酸解多肽得率为0.31%。

合并以上步骤的滤布滤渣，1 μm滤膜和10 000Da滤膜超滤浓缩液，测得体积和浓度，计算质量为497 g，加入2倍体积的蒸馏水，搅拌均匀，用1 M的NaOH溶液调pH至6.5，加入中性蛋白酶2000 Μ/g，在水浴温度45℃下酶解提取2 h。滤布粗滤后，分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤，滤液经10 000Da滤膜超滤，滤液进行300Da纳滤浓缩至1000 mL，取浓缩液即为酶解多肽提取液。加4%甘氨酸（40 g）作为冻干保护剂冷冻干燥（-45 ℃预冻1 h，-80 ℃，4.5 Pa冷冻干燥约12 h至成粉末状），至此制得酶解多肽冻干粉20 g，酶解多肽得率为2.0%。

通过以下实验表明本发明提取的鹿茸酸解多肽及酶解多肽的体外活性

试验例1

鹿茸酸解多肽和酶解多肽制品分子量分布范围见图7和表1，分子量低于1000Da的多肽分别占99.1%和88.03%以上。

表1 鹿茸酸解多肽和酶解多肽制品分子量分布范围

鹿茸酸解多肽用于细胞学实验结果如下：取对数生长期的人类永生化表皮细胞（

HaCaT细胞），分别按以下浓度加入鹿茸酸解多肽溶液：对照组（0μg/mL）、10 μg/mL（实施例1制得）、50 μg/mL（实施例2制得）、100 μg/mL（实施例3制得）、500 μg/mL（实施例1制得）、1000 μg/mL（实施例2制得）、5000 μg/mL（实施例3制得）、10000μg/mL（实施例1制得），采用MTS法检测多肽对于细胞增殖的促进情况。结果表明不同浓度的多肽对于细胞增殖均有促进作用，并且在1000 μg/mL时促进作用最为显著（P<0.01，图1）。以MTS法检测结果（1000 μg/mL）为基础，加入三个浓度的多肽溶液（500 μg/mL（实施例1制得）、1000 μg/mL（实施例2制得）、5000 μg/mL（实施例3制得），采用双染法结合流式细胞仪检测多肽对于细胞凋亡的抑制作用。结果显示三组实验组均能抑制细胞凋亡，并且在1 000μg/mL时抑制作用最显著（P<0.05，图2）。

鹿茸酶解多肽用于细胞学实验结果如下：取对数生长期的HaCaT细胞，分别按以下浓度加入鹿茸酶解多肽溶液：对照组（0μg/mL）、10 μg/mL（实施例1制得）、50 μg/mL（实施例2制得）、100 μg/mL（实施例3制得）、500 μg/mL（实施例1制得）、1000 μg/mL（实施例2制得）、5000 μg/mL（实施例3制得）、10000μg/mL（实施例1制得），采用MTS法检测多肽对于细胞增殖的促进情况。结果表明不同浓度的多肽对于细胞增殖均有促进作用，并且在100 μg/mL时促进作用最为显著（P<0.05，图3）。以MTS法检测结果（100 μg/mL）为基础，加入三个浓度的多肽溶液（50 μg/mL（实施例2制得）、100 μg/mL（实施例3制得）、500 μg/mL（实施例1制得），采用双染法结合流式细胞仪检测多肽对于细胞凋亡的抑制作用，结果显示三组实验组均能抑制细胞凋亡，并且在100μg/mL时抑制作用最显著（P<0.01，图4）；检测多肽对细胞过氧化氢酶（CAT）活力以及羟脯氨酸（hyp）含量的影响，结果显示：加入多肽后，细胞的CAT活力升高（500 μg/mL组，P<0.05，图5），hyp含量升高（100 μg/mL组，P<0.05，图6），表明鹿茸酶解多肽能够提高细胞的抗氧化能力及胶原蛋白合成情况。

Claims

1.一种利于皮肤或粘膜吸收的鹿茸多肽系列提取方法，包括以下步骤：

1）材料预处理：

新鲜或冰鲜鹿茸称重、切片；

2）提取：

加入预冷的10~30倍体积pH 4.2~4.8的醋酸—醋酸钠水溶液，置于4℃环境下搅拌提取4~8h，100~1 000目滤布粗滤，取上清液即为酸解多肽粗提取液，滤渣用于后续的酶解提取；

3）步骤2）制得的酸解多肽粗提取液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤（浓缩液用于后续的酶解提取），滤液经10 000Da滤膜超滤（浓缩液用于后续的酶解提取），滤液采用截留分子量300 Da的纳滤膜纳滤浓缩；

4）合并步骤2）的滤渣，步骤3）的1 μm滤膜和10 000Da滤膜超滤浓缩液，测得体积和浓度，计算质量；

5）加入2倍体积的蒸馏水，搅拌均匀，用1 M的NaOH溶液调pH至5.5-7.5，加入中性蛋白酶（1 000~2 000）Μ/g，在水浴温度45-65℃下酶解提取2-4 h；

6）滤布粗滤后，步骤5）制得的酶解多肽提取液分级超滤精制：1 μm滤膜粗滤，滤液经10 000Da滤膜超滤，滤液进行300Da滤膜纳滤浓缩，取浓缩液即为酶解多肽提取液；

7）将步骤3）制备的酸解多肽和步骤6）制备的酶解多肽的纳滤浓缩液加2-4%甘氨酸冷冻干燥，得酸解多肽和酶解多肽。