CN102925522A - 一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，属于针对鹿茸中蛋白质提取的方法领域。首先以经过乙醇萃取新鲜鹿茸有效成分后剩余残渣为原料，然后采用一种碱性蛋白酶酶解剩余鹿茸残渣中的鹿茸多肽物质，并进一步转化成低分子量的鹿茸多肽混合物。通过酶解法制备鹿茸残渣中鹿茸多肽物质通过实验检测鹿茸残渣中鹿茸多肽的理化性质，确定鹿茸多肽是分子量范围在500Da～700Da的混合物。我们发现酶解鹿茸残渣中鹿茸多肽粗提取物蛋白质含量比乙醇萃取物蛋白含量提高5倍，本发明不仅为鹿茸的综合利用提供了新的途径，提高了鹿茸生物利用率，而且为进一步开发能促进骨质生长以及预防和治疗治疗骨质疏松等的临床鹿茸多肽药物奠定了必要的基础。

Description

一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法

技术领域

本发明属于针对鹿茸中蛋白质提取的方法领域，特别是涉及到以经过乙醇萃取新鲜鹿茸有效成分后剩余残渣为原料，采用一种碱性蛋白酶酶解剩余鹿茸残渣中鹿茸多肽，并进一步转化成低分子量的鹿茸多肽混合物。

背景技术

鹿茸(Cornu cervi pantotrichum)系雄性鹿科动物梅花鹿(Cervus nipponTemminch)或者马鹿(Cervus elaphus Linaeus)的密生茸毛未骨化幼角,鹿茸的药理功效主要是“壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任和托疮毒等。对阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛”等均有良好的疗效。鹿茸含有多种氨基酸、蛋白质、维生素、胶质、脂类、粘多糖、微量元素及其它无机物等，具有广泛的药理作用。

多种鹿茸品系的化学成分研究表明，鹿茸中粗蛋白含量都占干重的50%以上。在已有的报道中我们得知：梅花鹿茸中粗蛋白含量高达61.24%(干重)；采用冻干、冷冻和传统热加工工艺制备鹿茸药材中蛋白成分和活性差异研究发现，冻干鹿茸中可能最大限度地保存鹿茸含有的活性蛋白,从而提高鹿茸的药物疗效，实验证实鹿茸水溶性总蛋白、鹿托盘水溶性总蛋白、鹿骨水溶性总蛋白的相对含量及组成差异极其明显。研究人员从鲜梅花鹿茸成分分离实验中获得了具有强的促进骨和软骨细胞增殖的低分子量活性物质的有效部位。马鹿鲜鹿茸提取物中的有效活性物质通过凝胶过滤层析、离子交换层析以及高效液相纯化，分离得到分子量在3216Da的纯多肽。本文采用40%EtOH萃取新鲜梅花鹿茸多肽，丙酮溶液分级沉淀，Sephadex G-25柱层析纯化，得到了梅花鹿鹿茸多肽Ⅰ和Ⅱ组分，剩余鹿茸残渣保留待酶解。测定萃取鹿茸多肽Ⅰ和Ⅱ的UV、lR光谱，生物效应实验表明，鹿茸多肽Ⅰ和Ⅱ均具有抗炎、促进生长的作用。采用Folin－酚试剂法测定鹿茸含有的水溶性蛋白含量，表明其含量范围为14.72％～15.71％。鹿茸中含有多种氨基酸成分，占干重50.13％，其中包括人体内不能合成的必需氨基酸包括：苏氨酸、缬氨酸，以及组氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等约有19种以上，其中甘氨酸含量最高，其次是谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸，蛋氨酸的含量最低。分析梅花鹿茸和马鹿茸不同部位的氨基酸含量，其中氨基酸含量从基部到顶端逐渐增加。

我们的研究结果表明，酶解鹿茸残渣制备的活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ）的蛋白含量比乙醇提取物的蛋白含量提高了5倍，将酶解产物进行分离纯化后，得到了分子量范围为500Da～700Da的多肽类混合物质，利用MTT法和细胞周期分析证实酶解鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）具有明显促进人成骨肉瘤细胞（OS-732细胞）的生物活性作用、明显提高G2+S期细胞指数生长的效果，细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性明显提高。通过p38MAPK抑制剂阻断细胞通路后，加入活性鹿茸多肽作用细胞后发现，与对照组比较，多肽组人成骨肉瘤细胞无明显的细胞活性及周期变化。进一步通过SYBR GreenⅠ嵌合荧光法Real-time PCR实验，成功检测到人成骨肉瘤细胞中的BMP、P21及（Cyclin）D1逆转录水平的mRNA相对含量差异，与对照组相比，加入鹿茸多肽作用的细胞中BMP、P21mRNA相对含量明显提高7倍，进一步阐述了酶解鹿茸残渣多肽能够促进人成骨肉瘤细胞的分化、增殖的可能机理，并且提高了鹿茸的生物利用率，提高了鹿茸更为广泛的合理利用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：首先采用乙醇萃取新鲜鹿茸制备鹿茸多肽，然后以萃取新鲜鹿茸后的鹿茸残渣为原料，通过酶解法制备活性鹿茸多肽物质，通过分离纯化，检测鹿茸多肽理化性质，并测定该鹿茸多肽是分子量范围在500Da～700Da的混合物。酶解法制备鹿茸多肽粗提取物蛋白质含量比乙醇萃取物蛋白含量提高5倍。

一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是：该鹿茸多肽干粉为淡黄色粉末状，能溶解于水，在4℃保存；该鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量为57.6%；该鹿茸多肽干粉为寡肽混合物，70%～80%寡肽的分子量分布在500Da～700Da；该鹿茸多肽干粉的氨基酸组成为：天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸；

采用酶解法制取鹿茸多肽干粉包括以下步骤:

①制备鹿茸多肽的原料为鹿茸残渣，即利用乙醇萃取新鲜鹿茸后剩余的鹿茸残渣为原料；

②酶水解

取鹿茸残渣10g溶于100ml蒸馏水中，该蒸馏水的温度为50℃，调节为碱性，然后加入0.5ml碱性蛋白酶即枯草杆菌蛋白酶Alcalase，仍保持温度在50℃，碱性条件，酶解1小时后滴加0.05mol/L的氢氧化钠NaOH，维持体系碱性调节；

③酶灭活

向步骤②中添加氯化氢HCl调节pH值为4.0，保持温度为50℃,经过20分钟酶解结束，采用800rpm~1000rpm×20min离心操作，然后过滤该液体并保存滤液，将滤液冻干后即得到鹿茸残渣酶解的粗提物；

④精制

将步骤③中所得到的粗提取物依次通过截止分子量为10k、3k，其中k为1000单位的超滤膜，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱柱及高效液相分离，得到精制的鹿茸多肽产品；

⑤干燥

将精制鹿茸多肽产品通过冷冻浓缩后，经冷冻干燥制成干粉。

所述的鹿茸多肽干粉药理功效是促进人成骨肉瘤细胞的增殖、分化，有抗氧化的能力。

所述的鹿茸多肽干粉制备成预防、治疗骨质疏松疾病的药物。

有益效果：目前认为碱性蛋白酶更适合蛋白质的酶水解反应，水解能力高于中性蛋白酶，更具有应用价值；蛋白水解物溶解性好、水解效率高、蛋白回收率高，具有良好的营养成分和功能性。Alcalase的主要成分是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，这是一种专一性广泛的内切蛋白酶，碱性蛋白酶水解蛋白质具有较多的切割位点，而达到较高的水解度。因此本发明中选用Alcalase酶来进行酶解。

可以看出酶解鹿茸残渣粗提取物中蛋白含量较乙醇萃取方法高出5倍。由此可见酶法水解提取鹿茸残渣中多肽类物质的提取率大幅提高，有效提高了鹿茸的生物利用率。凯氏定氮法测定含氮量，比较乙醇直接萃取鹿茸与酶解所剩鹿茸残渣的提取物的蛋白含量。鹿茸萃取液中鹿茸蛋白含量11%，鹿茸残渣蛋白含量71.2%，鹿茸残渣酶解液提取物蛋白含量57.6%。酶解乙醇萃取后的鹿茸残渣得到的活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）分子量范围与乙醇提取物中所得的多肽分子量范围接近；含鹿茸多肽血清培养基作用细胞后细胞活性明显提高，表明酶解得到的多肽成分能够促进OS-732细胞的分化与增殖，进而为酶解鹿茸多肽的临床应用提供了理论依据。

总之，本技术发明，不仅为鹿茸的综合利用提供了新的途径，提高了鹿茸生物利用率，而且为进一步开发能促进骨质生长以及预防和治疗治疗骨质疏松等的临床鹿茸多肽药物奠定了必要的基础。

具体实施方式

该鹿茸多肽干粉为淡黄色干粉末状，能溶解于水，放置于4℃保存。该鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量为57.6%，其为寡肽混合物，70%-80%寡肽的分子量分布在500-700Da。鹿茸多肽的氨基酸组成：天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸。本鹿茸多肽干粉的药理作用是能够促进人成骨肉瘤细胞的增殖、分化、提高抗氧化能力，可以制成预防或治疗骨质疏松等临床疾病的口服药物，也可以将该鹿茸多肽制备成医疗保健品等。

鹿茸多肽的提取：

鹿茸残渣含水量的测定采用真空干燥法。乙醇萃取新鲜鹿茸中有效物质后的剩余残渣在高温下真空干燥除去其中的水分，测定残渣含水量。具体操作如下：称取残渣2.3g高温下干燥，定时称重，待重量恒定后计算其含水量。依照公式：水分（%）=G/W×100%，其中G为样品干燥后的失重（g）；W为样品重量（g）。

测定某一固体样品中的蛋白质含量，都是以按100克该物质的干重中所含蛋白质克数来表示（%）。定氮前将固体样品中的水分除掉：首先将样品磨细，在已称重的称量瓶中加入样品，于105℃的烘箱内干燥，每烘干1小时后称量一次，直至两次称量数值恒定不变，即达到恒重为止。分别称取鹿茸残渣干燥粉、鹿茸萃取液粗提物干燥粉、鹿茸残渣酶解粗提物进行蛋白含量测定。

实验方法：称取鹿茸残渣10g溶于100ml蒸馏水中（水浴50℃，20min，调节碱性恒定）加0.5ml碱性蛋白酶（水浴50℃，碱性恒定）酶解1h后，添加HCl，调节酸性恒定(50℃,20min)酶解结束，冷却至室温后800rpm×20min~1000rpm×20min离心，纸浆过滤（三次）保存滤液，冻干后即得鹿茸残渣酶解粗提物。

准备层析柱及凝胶干粉，凝胶干粉溶胀过夜，平衡液洗脱层析柱。

操作方法：鹿茸残渣酶解得到的鹿茸粗提取物依次经截止分子量为10k、3k（k：1000单位）超滤膜，蠕动泵过滤后样品冻干。取样品冻干粉约20mg，用1ml蒸馏水溶解，采用Sephadex G-25（16mm×1000mm）凝胶过滤色谱柱进行分离，流动相：蒸馏水，流速：8.1ml/10min，采用紫外可见分光过度计检测，检测波长：220nm，收集各洗脱峰样品，冷冻干燥备用。

上述冻干品用流动相溶解，进样纯化，收集样品冷冻干燥。高效液相色谱仪：岛津LC-8A；层析柱：反相柱Ｃ18（250mm×4.6mm）柱；流速：0.6ml/min；柱温：20℃；流动相：10%（乙腈：水=1：10）；进样量：5ul；检测波长：220nm。

蛋白含量的测定：三种样品的蛋白质含量测定结果列于表1中，其中，鹿茸乙醇萃取粗提物蛋白含量：11.0%，酶解鹿茸残渣粗提物蛋白含量：57.6%；鹿茸残渣蛋白含量：71.2%。可以看出酶解鹿茸残渣粗提取物中蛋白含量较乙醇萃取方法高出5倍。由此可见酶法水解提取鹿茸残渣中多肽类物质的提取率大幅提高，有效提高了鹿茸的生物利用率。

表1凯氏定氮蛋白含量

鹿茸多肽的分离、纯化鹿茸残渣酶解粗提物呈黄白色粉末状，极易溶于水。经3k蠕动泵过滤后的冻干粉上样于Sephadex G-25层析柱分离，收集流出峰样品冻干呈淡黄色且极易溶于水。

提取物的定性鉴定

酶解鹿茸残渣粗提物、乙醇萃取粗提物冻干样品与经过Sephadex G-25层析柱分离的冻干样品经双缩脲试剂反应呈紫色，证明两种物质均为蛋白类物质。

Claims (3)

1.一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是：该鹿茸多肽干粉为淡黄色粉末状，能溶解于水，在4℃保存；该鹿茸多肽干粉的粗蛋白含量为57.6%；该鹿茸多肽干粉为寡肽混合物，70%～80%寡肽的分子量分布在500Da～700Da；该鹿茸多肽干粉的氨基酸组成为：天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸；

采用酶解法制取鹿茸多肽干粉包括以下步骤:

①制备鹿茸多肽的原料为鹿茸残渣，即利用乙醇萃取新鲜鹿茸后剩余的鹿茸残渣为原料；

②酶水解

取鹿茸残渣10g溶于100ml蒸馏水中，该蒸馏水的温度为50℃，调节为碱性，然后加入0.5ml碱性蛋白酶即枯草杆菌蛋白酶Alcalase，仍保持温度在50℃，碱性条件，酶解1小时后滴加0.05mol/L的氢氧化钠NaOH，维持体系碱性调节；

③酶灭活

向步骤②中添加氯化氢HCl调节为酸性条件，保持温度为50℃，20分钟酶解结束，采用800rpm~1000rpm×20min离心操作，然后过滤该液体并保存滤液，将滤液冻干后即得到鹿茸残渣酶解的粗提物；

④精制

将步骤③中所得到的粗提取物依次通过截止分子量为10k、3k，其中k为1000单位的超滤膜，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱柱及高效液相分离，得到精制的鹿茸多肽产品；

⑤干燥

将精制鹿茸多肽产品通过冷冻浓缩后，经冷冻干燥制成干粉。

2.根据权利要求1所述的一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是：所述的鹿茸多肽干粉药理功效是促进人成骨肉瘤细胞的增殖、分化，有抗氧化的能力。

3.根据权利要求1所述的一种采用酶解法制取鹿茸多肽干粉的方法，其特征是：所述的鹿茸多肽干粉制备成预防、治疗骨质疏松疾病的药物。