CN110354254A - 鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途，其中，所述鹿茸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。鹿茸多肽可以显著抑制骨肉瘤细胞EMT的发生，并且降低骨肉瘤的侵袭能力和转移能力，可以作为骨肉瘤转移治疗的潜在药物，降低骨肉瘤转移，使骨肉瘤患者更好的被治愈，进而降低治疗难度。

Description

鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途。
背景技术
鹿茸是我国最重要的传统中药材之一，在中医药领域的应用已有二千多年历史。鹿茸含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白质及钙、磷、镁、钠等成分，其中氨基酸成分占总成分的一半以上，可以用作滋补强壮剂，对虚弱、神经衰弱等有疗效。近年来鹿茸及其提取物在抑制恶性肿瘤细胞增殖、促进骨损伤修复、预防骨质疏松症、修复受损神经等方面取得了很大的进展，但是某些机制并未研究清楚，临床应用和鹿茸制剂仍然十分少，随着分子生物学、细胞生物学等实验技术的不断革新，对其有效成分和作用机制的探究也逐步深入(Y.S.Huo,H.Huo,J.Zhang.The contribution of deer velvet antlerresearch to the modern biological medicine[J].Chin J Integr Med.2014；20(10):723-8.)。
张郑瑶等(张郑瑶,段冷昕,周秋丽,等.梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性[J].高等学校化学学报.2012；33(9):2000-4)公开了一种鹿茸多肽，其是利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的一种新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15。一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。
骨肉瘤是一种出现在骨头上的原发性恶性肿瘤，该疾病主要发生于儿童和青少年时期，且男性发病率高于女性，但是这种疾病仍然比较罕见，只占肿瘤患者的不到1％，骨肉瘤的病征为骨和软组织的破坏，还极大可能性地伴随着癌细胞向远端器官如肺的转移(M.E.Anderson.Update on Survival in Osteosarcoma[J].Orthopedic Clinics ofNorth America.2016；47(1):283-92)。
上皮细胞-间充质转化(EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。原发性上皮组织肿瘤细胞通过EMT形成具有迁移能力的间充质细胞，随血流转移至不同部位，进而通过EMT过程形成上皮细胞的肿瘤转移灶并获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。因此对于骨肉瘤的治疗抑制EMT过程至关重要(Shibue T,Weinberg R A.EMT,CSCs,and drug resistance:the mechanistic link andclinical implications[J].Nature Reviews Clinical Oncology,2017.)。
并且，局部骨肉瘤患者的5年无瘤生存率(EFS)约为34.8％-69.7％，而转移或复发性疾病患者的总生存率低于20％，因此为转移或复发性骨肉瘤患者探索一种新的更加精准的诊断方法和更加有效低副作用的治疗方法十分重要(D.J.Harrison,D.S.Geller,J.D.Gill,et.al.Current and future therapeutic approaches for osteosarcoma[J].Expert Rev Anticancer Ther.2018；18(1):39-50.)。
发明内容
本发明的目的是提供鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途，以解决现有技术中存在的问题。
本发明的技术方案为：
鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途，其中，所述鹿茸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体地，鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM；即，张郑瑶,段冷昕,周秋丽,等.梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性[J].高等学校化学学报.2012；33(9):2000-4中公开的鹿茸多肽。
在一个具体的实施方案中，所述的药物通过抑制骨肉瘤细胞的上皮细胞-间充质转化和/或抑制骨肉瘤细胞迁移治疗骨肉瘤转移。
在一个具体的实施方案中，所述的药物上调骨肉瘤细胞中E-cadherin的表达，下调骨肉瘤细胞中TGF-β1、p-smad2/3、Snail、runx2、MMP-2和Twist的表达。
在一个具体的实施方案中，所述的表达为基因水平的表达和/或蛋白水平的表达。
在一个具体的实施方案中，所述的骨肉瘤转移是哺乳动物中的骨肉瘤转移。
在一个具体的实施方案中，所述的哺乳动物是人。
在一个具体的实施方案中，骨肉瘤细胞为U2OS和/或MG-63细胞系。
本发明的效果和益处是：
本发明公开了鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途。鹿茸多肽可以显著抑制骨肉瘤细胞EMT的发生，尤其是在浓度为80μg/ml时效果最为显著。鹿茸多肽可以降低骨肉瘤的侵袭能力和转移能力，可以作为骨肉瘤转移治疗的潜在药物，降低骨肉瘤转移，使骨肉瘤患者更好的被治愈，进而降低治疗难度。
附图说明
图1表示鹿茸多肽对MG-63细胞迁移的影响。
图2表示鹿茸多肽对U2OS细胞迁移的影响。
图3表示鹿茸多肽抑制MG-63细胞迁移。
图4表示鹿茸多肽抑制U2OS细胞迁移。
图5表示鹿茸多肽调控骨肉瘤细胞EMT过程相关蛋白的表达。
图6表示鹿茸多肽促进MG-63中TGF-β1的表达。
图7表示鹿茸多肽抑制MG-63中E-cadherin的表达。
图8表示鹿茸多肽抑制MG-63中Snail的表达。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：检测鹿茸多肽对骨肉瘤细胞迁移过程的影响
(1)细胞复苏：将细胞间内水浴锅温度调整到37℃，将冻存细胞(MG-63和U2OS细胞，均购自中科院上海细胞库)从液氮罐中取出后，立即放入37℃水浴锅中，轻轻摇动冻存管，使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟)。细胞冻存液融化后转入离心管中，进行1000rpm 5min的离心，离心后弃去上清液，用含10％FBS细胞培养液重悬，将细胞混匀后移入25cm2细胞培养瓶，放入5％CO2，37℃恒温培养箱进行培养。
(2)细胞培养：骨肉瘤细胞MG-63采用MEM培养液，U2OS采用1640培养液，加入10％胎牛血清，2％双抗(青霉素-链霉素)放入恒温培养箱进行培养，细胞培养液变色后，弃去原来的培养液，并用PBS溶液清洗两次，加入新的培养液，在细胞长到占据细胞培养瓶80％面积时进行传代或铺板操作。
(3)细胞传代：取对数生长期的生长状况良好的骨肉瘤细胞弃去培养液，先加入2ml PBS对细胞进行清洗，清洗两次后，加入1ml胰蛋白酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化，显微镜下观察直到细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，移入离心管中离心1000rpm 5min，离心结束后，弃去上清液，加入1ml培养液重悬细胞，用移液枪吹打细胞沉淀使细胞分散均匀，将细胞分别放入两个培养瓶中加入4ml培养液，放入恒温细胞培养箱中培养。
(4)细胞冻存：取对数生长期的骨肉瘤细胞，弃去原来的细胞培养液，加入PBS溶液清洗，清洗结束后用胰蛋白酶把贴壁生长的骨肉瘤细胞消化下来，移入离心管中离心1000rpm 5min，离心结束后，用900μl培养液重悬细胞沉淀，转移至冻存管内，加入100μlDMSO，并在冻存管中标记好细胞名称、日期及姓名，放入冻存盒中-80℃24小时后，移至液氮罐中长时间保存。
(5)用Marker笔在六孔板背面笔直均匀的划线三条，用来定位选取测量的位置，划线结束后，取对数生长期骨肉瘤细胞进行消化，重悬细胞后进行细胞计数，调整细胞个数为2.5×105/ml，每孔加2ml细胞液，放入CO2细胞培养箱进行培养，待细胞长满后，用200μl的移液枪枪头笔直的划线，划线后用PBS清洗两次，去除划下的细胞，加入2ml无血清培养基，显微镜下拍照，记录此时(0h)划痕距离和位置。然后分别加入含20、80μg/ml用相应细胞培养液溶解的鹿茸多肽(上海德翅生物科技有限公司合成)的无血清培养基，对照组加入等量培养基，将六孔板放置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。24h后在倒置显微镜下观察细胞向划痕区迁移的情况并摄片记录，计算细胞迁移率。
计算公式：
细胞迁移率(％)＝[试验组划痕距离(0h)-试验组划痕距离(24h)]/[对照组划痕距离(0h)-对照组划痕距离(24h)]×100％
实验结果如图1至图4所示，通过对细胞划痕宽度的测量及计算发现鹿茸多肽在20μg/ml和80μg/ml浓度时能够显著的抑制骨肉瘤细胞MG-63的迁移(P<0.01)，同时也能抑制U2OS的迁移(P<0.05)，从而可以降低骨肉瘤迁移速度，降低治疗难度。
实施例2：鹿茸多肽对人骨肉瘤细胞MG-63的EMT过程的抑制情况，及相关蛋白的表达变化
1、选取对数期生长状态良好的骨肉瘤细胞进行消化，将骨肉瘤细胞MG-63转移到6孔板中培养，细胞培养液同实施例1。在进行铺板之前进行计数，使每个孔细胞数相同，每孔细胞数为2-5×105个。六孔板中骨肉瘤细胞生长到70％-80％时，将骨肉瘤细胞MG-63分为三组，弃去原来的细胞培养液，用PBS溶液清洗两次后，加入新的培养液和鹿茸多肽，每组按照0μg/ml、20μg/ml、80μg/ml三个浓度分别进行药物干扰，每组两孔，加入不同浓度鹿茸多肽后在六孔板盖子上做好标记，放入恒温CO2细胞培养箱，培养48h。
2、用移液器吸出六孔板中培养液，加入PBS清洗一次，每个孔加入500μl胰蛋白酶消化，待细胞皱缩变圆后加等量含10％(v/v)FBS的完全培养液终止消化，用1ml移液器反复吹打贴壁细胞，使细胞完全悬浮起来，然后转移到离心管中，1000rpm离心5min，离心结束后弃去上清液，加入1m l PBS溶液重悬细胞沉淀，重悬后再次离心，2000rpm离心5min，弃去离心管内PBS溶液，尽量将剩余PBS清除，按照100：1的比例加入RIPA裂解液(P0013B，Beyotime)和蛋白酶抑制剂PMSF(ST506，Beyotime)，放入4℃冰箱裂解1小时，裂解结束后，将离心管放入高速冷冻离心机12000rpm离心15min，离心结束后将上清移入新的离心管中，弃去沉淀。根据BCA定量(P0012，Beyotime)计算蛋白浓度，将剩余的蛋白混合5×loadingbuffer煮沸10min后放于-20℃储存。
3、SDS-Page电泳
(1)安装蛋白电泳装置按照表1配制浓缩胶和分离胶，待胶凝固后将提取的MG-63蛋白进行电泳，调整好电泳的电压和电流，当溴酚蓝迁移至分离胶底部停止电泳。
表1：SDS-PAGE的分离胶和浓缩胶的配方
(2)转膜：准备十张滤纸、两块海绵和一张PVDF膜(膜的大小与分离胶大小相同，使用前在甲醇中浸泡5min)，以上物品使用前用转膜液浸泡约10min。电泳结束后，依据预染色标记的位置将包含目标蛋白质的凝胶切下，放入1×转膜液浸泡。在白色板上依次放海绵，三层滤纸，PVDF膜，分离胶，三层滤纸，海绵，然后盖上黑色板稍作挤压，将组装好的转膜板放入转膜电泳槽中，胶面向着阴极，膜面向阳极。恒流200mA，转膜100min。其中PVDF膜与分离胶要紧密贴合避免出现气泡。
(3)封闭
转膜结束后将PVDF膜放入封闭液，在室温摇床上封闭3h。
(4)一抗孵育
将封闭结束的PVDF膜用封闭液稀释的单克隆抗体进行孵育，4℃条件下孵育过夜，孵育结束后回收一抗。
(5)洗膜
将抗体孵育结束的PVDF膜在摇床上用TBST溶液清洗，清洗5次，每次5min。
(6)二抗孵育
洗膜结束后将TBST洗好的PVDF膜用稀释好的二抗(羊抗兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育1h。
(7)洗膜同步骤(5)
(8)发光显影
按ECL试剂盒(P0018,Beyotime)说明书将发光液A、B进行混合(1:1)，用镊子将PVDF膜放置到检测板上，滴加发光液，在凝胶成像仪中进行曝光检测。
实验结果如图5所示，鹿茸多肽在20μg/ml、80μg/ml时能够下调MG-63细胞中TGF-β1和p-smad2/3的表达，会上调骨肉瘤细胞上皮标志物E-cadherin，并下调Snail、Twist和runx2的表达，对于三者的抑制效应可以进一步证实鹿茸多肽抑制EMT的作用，同时鹿茸多肽也能通过抑制MMP-2进而抑制骨肉瘤的转移和侵袭，由此可知鹿茸多肽能够通过调控TGF-β信号通路抑制骨肉瘤细胞MG-63EMT过程的发生。
实施例3：基因水平检测鹿茸多肽对人骨肉瘤细胞MG-63EMT过程的抑制情况
实施例2中第一步经0、20、80ug/ml不同浓度鹿茸多肽处理后的细胞，通过以下步骤提取总RNA并测定：
1、在六孔板中MG-63细胞样品用PBS溶液润洗两次后，使用移液器将PBS吸干净，加入500μl胰蛋白酶消化，消化结束后转移到离心管中进行1000rpm离心5min，离心结束后用PBS溶液重悬细胞沉淀，混匀沉淀后再次离心，离心结束弃去上清液，加入1ml Trizol(Invitrogen)用移液器反复吹打至无明显细胞沉淀，室温静置5min(15-30℃)。
2、加入200μl氯仿(天津市大茂化学试剂厂)，盖紧离心管盖子振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触溶液变为乳白色，室温静置5min。
3、将离心管配平后放入冷冻高速离心机中4℃下，12000rpm离心15min离心结束后取出离心管，溶液可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free离心管(用200μl的枪吸取上清，吸上清时，枪头应在液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层)。
4、沉淀RNA：加入等体积异丙醇(天津市大茂化学试剂厂)，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10min。
5、将离心管放入高速离心机中4℃下，12000rpm离心10min，离心结束后弃去上清液，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，12000g离心10min，收集RNA沉淀)。
6、用等量75％乙醇(用DEPC水配置)轻轻上下颠倒洗涤RNA沉淀，洗涤结束后放入高速离心机中4℃7500rpm离心5min，离心结束后弃去上清液。打开离心管盖室温干燥沉淀。
7、视沉淀量加入适量DEPC水(至少15μl)溶解沉淀。
8、反转录：通过反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)按照表2和表3所示加入相关试剂进行反转录实验37℃15min，85℃5s，获得cDNA放置于4℃冰箱中保存。
表2：qPCR引物列表
表3：反转录PCR体系
9、按照表4所示向八连管中加入qPCR相关试剂，每组三个重复，将八连管放入qPCR仪器中，设置相应条件进行实验。
表4：qPCR反应体系
实验结果如图6至图8所示鹿茸多肽能够抑制骨肉瘤细胞MG-63的TGF-β1表达水平，并且上调E-cadherin的表达，抑制Snail的表达，说明鹿茸多肽能够抑制MG-63细胞EMT过程。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

Claims (7)

1.鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途，其中，所述鹿茸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的药物通过抑制骨肉瘤细胞的上皮细胞-间充质转化和/或抑制骨肉瘤细胞迁移治疗骨肉瘤转移。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述的药物上调骨肉瘤细胞中E-cadherin的表达，下调骨肉瘤细胞中TGF-β1、p-smad2/3、Snail、runx2、MMP-2和Twist的表达。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述的表达为基因水平的表达和/或蛋白水平的表达。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述的骨肉瘤转移是哺乳动物中的骨肉瘤转移。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述的哺乳动物是人。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，骨肉瘤细胞为U2OS和/或MG-63细胞系。
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