CN106349357A - 一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用。该发明使用鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。浓度为0～1ug/ml的鹿茸多肽，为促进间充质干细胞的迁移；浓度为5～50ug/ml的鹿茸多肽，为抑制间充质干细胞的迁移；该应用对提高脂肪间充质干细胞向受损缺血心肌组织中的迁移能力，治疗心肌梗塞及对移植后心肌的修复至关重要。

Description

一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及鹿茸多肽(VAPs)在影响间充质干细胞(ADSCs)迁移中的应用。
背景技术
鹿茸——归肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨。属于传统中药之一。中华人民共和国药典(2005年版一部)将鹿茸功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。用于阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛。
鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出:“鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:“龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗“痹症”的方剂中使用频率占到39.3％。
鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高)、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。
本发明所用鹿茸多肽为利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的1个新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15.一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(张郑瑶等."梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性."高等学校化学学报33.9(2012):2000-2004.)
脂肪间充质干细胞(ADSCs)是经过抽提脂肪组织并且经过分离培养所获得的一种纤维样细胞，是一种成体干细胞，与骨髓基质干细胞一样来自于中胚层，表面抗原与骨髓基质干细胞相似，且在在体外的培养条件、生长状态和表达标志物也与骨髓基质干细胞基本相同(ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissue is asourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13:4279一4295.)。具有来源广、丰富度高、损伤小、易于培养等优点。脂肪间充质干细胞具有多方面的作用，已经证明在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，可以诱导为神经元样细胞，治疗I型糖尿病、促进皮肤伤口愈合、减小急性及慢性肾损伤等。Marina Burgos-Silva1等人的研究表明，脂肪间充质干细胞移植可以减少血清尿素，使肾衰竭小鼠的肾功能得到明显的改善(Burgos-Silva M,Semedo-Kuriki P,Donizetti-Oliveira C,Costa PB,Cenedeze MA,Hiyane MI,et al.(2015)Adipose Tissue-DerivedStem Cells Reduce Acute and Chronic Kidney Damage in Mice.PLoS ONE 10(11):e0142183.doi:10.1371/journal.pone.0142183)。4周治疗后，可以减轻肾纤维化，减轻慢性炎症。脂肪间充质干细胞(ADSCs)在肾毒性损伤的治疗中起到积极的保护作用，可以通过调控细胞周期来抑制炎症，减轻肾脏损害，改进肾功能，抑制器官纤维化并长期提高免疫调节作用。通过在肾损伤的啮齿类动物中进行脂肪间充质干细胞治疗，证明可以用来减少组织炎症及肾损(Morigi M,Introna M,Imberti B,Corna D,Abbate M,Rota C,et al.(2008)Human bone marrow mesenchymal stem cells accelerate recovery of acuterenal injury and prolong survival in mice.Stem Cells 26:2075–2082.doi:10.1634/stemcells.2007-0795PMID:18499895；Furuichi K,Shintani H,Sakai Y,OchiyaT,Matsushima K,Kaneko S,et al.(2012)Effects of adiposederived mesenchymalcells on ischemia-reperfusion injury in kidney.Clin Exp Nephrol 16:679–689.doi:10.1007/s10157-012-0614-6PMID:22398959)。大量的实验已经证明，不同类型的干细胞在治疗肾损伤方面都具有明显的作用(Fang TC,Pang CY,Chiu SC,Ding DC,TsaiRK(2012)Renoprotective effect of human umbilical cordderivedmesenchymal stemcells in immunodeficient mice suffering from acute kidney injury.PLoS One 7：e46504.doi：10.1371/journal.pone.0046504PMID:23029541；Fang TC,Alison MR,CookHT,Jeffery R,Wright NA,Poulsom R.(2005)Proliferation of bonemarrowderivedcells contributes to regeneration after folic acid-induced acutetubular injury.J Am Soc Nephrol16:1723–1732.PMID:15814835)。而且，大多数的实验数据表明，干细胞治疗的主要机制是控制损伤发生过程中的炎症进程(Stagg J(2007)Immune regulation by mesenchymal stem cells:two sides to the coin.TissueAntigens 69:1–9.PMID:17212702)。
迄今为止，冠状动脉疾病的相关治疗手段已经取得了长足的进展，但是，急性心肌梗塞导致的死亡在世界范围内仍广泛存在(Wallentin L,Kristensen SD,Anderson JL,etal:How can we optimize the processes of care for acute coronary syndromes toimprove outcomes？Am Heart J 168:622-631,2014.)。急性心肌梗塞发生时的特点为，心脏内的血液和氧气供应量会急剧减少，产生不可逆的肌肉损伤及心肌细胞死亡。在梗塞区域包含大量无功能的心肌细胞，形成疤痕组织(Segers VF and Lee RT:Stem-celltherapy for cardiac disease.Nature 451:937-942,2008.)。受损的心脏有限的再生能力以及替代材料的缺乏导致心脏的衰竭。基于细胞水平的治疗方法主要集中于修复受损的血管及心肌组织(Segers VF and Lee RT:Stem-cell therapy for cardiacdisease.Nature 451:937-942,2008.)。脂肪间充质干细胞由于其来源广、低免疫抑制的特点而成为了治疗心肌梗塞的理想材料(Bai X,Yan Y,Song YH,et al:Both cultured andfreshly isolated adipose tissue-derived stem cells enhance cardiac functionafter acute myocardial infarction.Eur Heart J 31:489-501,2010.Strioga M,Viswanathan S,Darinskas A,Slaby O and Michalek J:Same or not the same？Comparison of adipose tissue-derived versus bone marrow-derived mesenchymalstem and stromal cells.Stem Cells Dev 21:2724-2752,2012.)。虽然大多数采用脂肪间充质干细胞移植来改善心脏功能的动物和人类实验收到了良好的效果，但是主要的几个问题依然存在，主要表现为受损心肌组织中较低的细胞迁移力、低黏附力以及存活力，这些都限制了脂肪间充质干细胞在治疗心肌梗塞方面的应用。提高脂肪间充质干细胞向受损缺血心肌组织中的迁移能力是治疗心肌梗塞首要及先决的条件，对移植后心肌的修复至关重要(Chavakis E and Dimmeler S:Homing of progenitor cells to ischemictissues.Antioxid Redox Signal 15:967-980,2011.)。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用。
本发明的技术方案为：
一种鹿茸多肽的氨基酸序列，其序列
VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。
上述的鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，包括如下步骤：
第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液。
第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml。
第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
第六步，划痕并加入鹿茸多肽；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，进行细胞划痕，加入浓度为0～50ug/ml的鹿茸多肽，在37℃，5％CO2培养箱中培养12h。
第七步，观察细胞迁移情况。
上述的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
上述的第六步加入浓度为0～1ug/ml的鹿茸多肽，用于促进间充质干细胞的迁移；加入浓度为5～50ug/ml的鹿茸多肽，用于抑制间充质干细胞的迁移。
上述的培养基为DMEM培养基。
本发明的积极效果在于：本发明开发了一种具有特定氨基酸序列的鹿茸多肽影响脂肪间充质干细胞(ADSCs)迁移的应用；浓度为0～1ug/ml的鹿茸多肽，为促进间充质干细胞的迁移；浓度为5～50ug/ml的鹿茸多肽，为抑制间充质干细胞的迁移；该应用对提高脂肪间充质干细胞向受损缺血心肌组织中的迁移能力，治疗心肌梗塞及对移植后心肌的修复至关重要。
附图说明
图1表示不同浓度鹿茸多肽作用于ADSCs细胞12h后，对划痕宽度进行统计分析的结果
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
细胞划痕实验检测鹿茸多肽浓度为50ug/ml，作用12h后对细胞迁移能力的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为每1.5ml细胞液含有5×105个细胞。
第五步：种板。将细胞接种于6孔板上，每孔接种1.5ml，细胞个数为每孔5×105个，共加2个孔。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养12h。
第六步：划痕并加入鹿茸多肽。12h后，吸出原有培养基，用200μl移液枪枪头划“一”字形划痕，用PBS漂洗2次除去划下的悬浮细胞，向两个孔中分别加入1.5ml培养基，再向其中一个孔加入鹿茸多肽浓度为80ug/100ul的培养基100ul，另一个孔为空白对照，加入等量培养基。标注细胞名称，鹿茸多肽浓度，铺板时间、划痕及加药时间。并照相(100×)。继续培养12h。
第七步：观察细胞迁移情况。12h后在倒置显微镜下观察细胞向划痕区迁移的情况并摄片记录，实验重复3次。通过分析软件分析鹿茸多肽对细胞迁移情况的影响。
所得结果如图1所示，鹿茸多肽浓度为50ug/ml时，可以抑制细胞迁移。
实施例2
细胞划痕实验检测鹿茸多肽浓度为5ug/ml，作用12h后对细胞迁移能力的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为每1.5ml细胞液含有5×105个细胞。
第五步：种板。将细胞接种于6孔板上，每孔接种1.5ml，细胞个数为每孔5×105个，共加2个孔。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养12h。
第六步：划痕并加入鹿茸多肽。12h后，吸出原有培养基，用200μl移液枪枪头划“一”字形划痕，用PBS漂洗2次除去划下的悬浮细胞，向两个孔中分别加入1.5ml培养基，再向其中一个孔加入鹿茸多肽浓度为8ug/100ul的培养基100ul，另一个孔为空白对照，加入等量培养基。标注细胞名称，鹿茸多肽浓度，铺板时间、划痕及加药时间。并照相(100×)。继续培养12h。
第七步：观察细胞迁移情况。12h后在倒置显微镜下观察细胞向划痕区迁移的情况并摄片记录，实验重复3次。通过分析软件分析鹿茸多肽对细胞迁移情况的影响。
所得结果如图1所示，鹿茸多肽浓度为5ug/ml时，可以抑制细胞迁移。
实施例3
细胞划痕实验检测鹿茸多肽浓度为1ug/ml，作用12h后对细胞迁移能力的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为每1.5ml细胞液含有5×105个细胞。
第五步：种板。将细胞接种于6孔板上，每孔接种1.5ml，细胞个数为每孔5×105个，共加2个孔。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养12h。
第六步：划痕并加入鹿茸多肽。12h后，吸出原有培养基，用200μl移液枪枪头划“一”字形划痕，用PBS漂洗2次除去划下的悬浮细胞，向两个孔中分别加入1.5ml培养基，再向其中一个孔加入鹿茸多肽浓度为1.6ug/100ul的培养基100ul，另一个孔为空白对照，加入等量培养基。标注细胞名称，鹿茸多肽浓度，铺板时间、划痕及加药时间。并照相(100×)。继续培养12h。
第七步：观察细胞迁移情况。12h后在倒置显微镜下观察细胞向划痕区迁移的情况并摄片记录，实验重复3次。通过分析软件分析鹿茸多肽对细胞迁移情况的影响。
所得结果如图1所示，鹿茸多肽浓度为1ug/ml时，可以显著促进细胞迁移。
鹿茸多肽的氨基酸序列为：
VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM

Claims (5)

1.一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；
第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；
第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；
第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml；
第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养；
第六步，划痕并加入鹿茸多肽；所述鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，进行细胞划痕，加入浓度为0～50ug/ml的鹿茸多肽，在37℃，5％CO2培养箱中培养12h；
第七步，观察细胞迁移情况。
2.根据权利要求1所述的一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，所述的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，第六步加入浓度为0～1ug/ml的鹿茸多肽，用于促进间充质干细胞的迁移；加入浓度为5～50ug/ml的鹿茸多肽，用于抑制间充质干细胞的迁移。
4.根据权利要求1或2所述的一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，所述的培养基为DMEM培养基。
5.根据权利要求3所述的一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用，其特征在于，所述的培养基为DMEM培养基。
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