CN106367384A - 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用 - Google Patents

一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106367384A
CN106367384A CN201610826091.3A CN201610826091A CN106367384A CN 106367384 A CN106367384 A CN 106367384A CN 201610826091 A CN201610826091 A CN 201610826091A CN 106367384 A CN106367384 A CN 106367384A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
stem cell
antler polypeptide
mescenchymal stem
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610826091.3A
Other languages
English (en)
Inventor
张郑瑶
王晓龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN201610826091.3A priority Critical patent/CN106367384A/zh
Publication of CN106367384A publication Critical patent/CN106367384A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用。本发明得到含有32个氨基酸的鹿茸多肽对脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有增值的作用。所述鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。鹿茸多肽在浓度为20ug/ml，作用时间为48h时效果最为显著，有助于促进肾损伤修复、促进皮肤伤口愈合及骨修复。

Description

一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及鹿茸多肽(VAPs)在促进间充质干细胞(ADSCs)增殖中的应用。
背景技术
鹿茸——归肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨。属于传统中药之一。中华人民共和国药典(2005年版一部)将鹿茸功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。用于阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛。
鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出：―鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:―龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗―痹症”的方剂中使用频率占到39.3％。
鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高)、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。
本发明所用鹿茸多肽为利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的1个新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15.一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(张郑瑶等."梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性."高等学校化学学报33.9(2012):2000-2004.)
脂肪间充质干细胞(ADSCs)是经过抽提脂肪组织并且经过分离培养所获得的一种纤维样细胞，是一种成体干细胞，与骨髓基质干细胞一样来自于中胚层，表面抗原与骨髓基质干细胞相似，且在在体外的培养条件、生长状态和表达标志物也与骨髓基质干细胞基本相同(ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissue is asourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13:4279一4295.)。具有来源广、丰富度高、损伤小、易于培养等优点。脂肪间充质干细胞具有多方面的作用，已经证明在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，可以诱导为神经元样细胞，治疗I型糖尿病、促进皮肤伤口愈合、减小急性及慢性肾损伤等。Marina Burgos-Silva1等人的研究表明，脂肪间充质干细胞移植可以减少血清尿素，使肾衰竭小鼠的肾功能得到明显的改善(Burgos-Silva M,Semedo-Kuriki P,Donizetti-Oliveira C,Costa PB,Cenedeze MA,Hiyane MI,et al.(2015)Adipose Tissue-DerivedStem Cells Reduce Acute and Chronic Kidney Damage in Mice.PLoS ONE 10(11):e0142183.doi:10.1371/journal.pone.0142183)，4周治疗后，可以减轻肾纤维化，减轻慢性炎症。脂肪间充质干细胞(ADSCs)在肾毒性损伤的治疗中起到积极的保护作用，可以通过调控细胞周期来抑制炎症，减轻肾脏损害，改进肾功能，抑制器官纤维化并长期提高免疫调节作用。通过在肾损伤的啮齿类动物中进行脂肪间充质干细胞治疗，证明可以用来减少组织炎症及肾损伤(Morigi M,Introna M,Imberti B,Corna D,Abbate M,Rota C,et al.(2008)Human bone marrow mesenchymal stem cells accelerate recovery of acuterenal injury and prolong survival in mice.Stem Cells 26:2075–2082.doi:10.1634/stemcells.2007-0795PMID:18499895；Furuichi K,Shintani H,Sakai Y,OchiyaT,Matsushima K,Kaneko S,et al.(2012)Effects of adiposederived mesenchymalcells on ischemia-reperfusion injury in kidney.Clin Exp Nephrol 16:679–689.doi:10.1007/s10157-012-0614-6PMID:22398959)。大量的实验已经证明，不同类型的干细胞在治疗肾损伤方面都具有明显的作用(Fang TC,Pang CY,Chiu SC,Ding DC,TsaiRK(2012)Renoprotective effect of human umbilical cordderivedmesenchymal stemcells in immunodeficient mice suffering from acute kidney injury.PLoS One7:e46504.doi：10.1371/journal.pone.0046504PMID:23029541；Fang TC,Alison MR,CookHT,Jeffery R,Wright NA,Poulsom R.(2005)Proliferation of bonemarrowderivedcells contributes to regeneration after folic acid-induced acutetubular injury.J Am Soc Nephrol16:1723–1732.PMID:15814835)。而且，大多数的实验数据表明，干细胞治疗的主要机制是控制损伤发生过程中的炎症进程(Stagg J(2007)Immune regulation by mesenchymal stem cells:two sides to the coin.TissueAntigens 69:1–9.PMID:17212702)。
自体骨移植是治疗骨损伤最有效的方式，但是，在治疗过程中，经常会出现因为软骨移植而导致的软骨损伤和缺损。而软骨内由于不存在血管、淋巴管及神经组织，导致软骨细胞增值能力有限。组织工程学的发展，使开发生物替代品来修复和替代受损的软骨组织成为了可能。而获得组织工程学软骨的首要条件是如何获得种子细胞。目前应用于临床的种子细胞主要为自体软骨细胞，但自体软骨细胞存在供区范围小、分离培养困难、体外培养时增值能力有限等缺点，使其应用受到了极大的限制。而多潜能干细胞、胚胎干细胞的应用则存在安全性及伦理等方面的问题，所以距离临床应用还有一定的距离。脂肪来源的间充质干细胞在体内分布广泛，来源较多，分离及获取相对简单，是组织工程学理想的种子细胞。如何让脂肪来源的间充质干细胞在体外大量增殖，是亟待解决的一个问题。实验室常采用细胞因子来促进细胞的增值，但是细胞因子价格昂贵，很难广泛应用。随着对天然药物研究的深入，其促进细胞增值的作用也受到了广泛的关注。促进细胞增值药物的发现，对于治疗骨损伤以及组织工程学的发展，具有重要的意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用。
本发明的技术方案为：
一种鹿茸多肽的氨基酸序列，其序列
VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。
上述的鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，包括如下步骤：
第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液。
第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步，细胞计数；调节细胞个数为5×104～10×104/ml。
第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板；孔板每列设置3～6个复孔；在37℃，5％CO2培养箱中培养。
第六步，加入该氨基酸序列的鹿茸多肽；当间充质干细胞处于对数生长期时，向孔板中加入0～500ug/ml的鹿茸多肽；在37℃，5％CO2培养箱中培养24～72h。
第七步：采用MTT法检测细胞增值情况。
上述的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
上述的培养基为DMEM培养基。
上述第五步在接种细胞的周围孔中加入含有双抗的PBS溶液。
本发明的有益效果为，具有该种氨基酸结构的鹿茸多肽具有促进ADSCs细胞增值的作用，在浓度为20ug/ml，作用时间为48h时效果最为显著，有助于促进肾损伤修复、促进皮肤伤口愈合及骨修复。
附图说明
图1表示不同浓度鹿茸多肽作用于ADSCs细胞24h后，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
图2表示不同浓度鹿茸多肽作用于ADSCs细胞48h后，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
图3表示不同浓度鹿茸多肽作用于ADSCs细胞72h后，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
图4表示浓度为20ug/ml的鹿茸多肽作用于ADSCs细胞，不同时间时，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
图5表示浓度为100ug/ml的鹿茸多肽作用于ADSCs细胞，不同时间时，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
图6表示浓度为500ug/ml的鹿茸多肽作用于ADSCs细胞，不同时间时，通过MTT法检测细胞增值的实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
通过MTT法检测不同浓度鹿茸多肽作用于细胞24h后，对细胞增值的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为10×104/ml(每孔加100ul，相当于每孔10000个细胞)。
第五步：种板。将分散均匀的细胞接种于96孔板，每孔加100ul，脂肪间充质干细胞(ADSCs)每列加4个孔，共需2ml，考虑到种板过程中细胞液的损失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有双抗的无菌PBS。在第二列至第六列加入脂肪间充质干细胞(ADSCs)，每列设置4个复孔。37℃CO2培养箱中培养24小时。
操作过程中需要注意的是：1.每次加入细胞都使枪头贴着孔壁(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。2.孔加入顺序：可从上到下，从右到左依次加入。3.为了保证细胞密度均匀，最好每加1列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。4.每块96孔板加完细胞后，静置30min，使细胞贴壁。
第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分别加入不同浓度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培养基。第二列至第四列中鹿茸多肽浓度分别为20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培养基。37℃CO2培养箱中培养24h。
第七步：MTT法检测细胞增值情况。24h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液现用现配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中长期冻存)，继续孵育4h后终止。快速、轻轻翻转培养板，弃上清，注意不能把结晶移走。每孔加入150ul DMSO，震荡10分钟，使MTT蓝紫色结晶逐渐溶解。用酶标仪检测490nm处各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培养基孔的OD值为对照。最后，以时间为横轴，以OD值为纵轴绘制柱状图。此实验重复三次。
所得结果如图1所示，24h后实验组与对照组相比，OD值没有明显的差别，说明鹿茸多肽作用24h后没有促进细胞增值。
实施例2
通过MTT法检测不同浓度鹿茸多肽作用于细胞48h后，对细胞增值的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为10×104/ml(每孔加100ul，相当于每孔10000个细胞)。
第五步：种板。将分散均匀的细胞接种于96孔板，每孔加100ul，脂肪间充质干细胞(ADSCs)每列加4个孔，共需2ml，考虑到种板过程中细胞液的损失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有双抗的无菌PBS。在第二列至第六列加入脂肪间充质干细胞(ADSCs)，每列设置4个复孔。37℃CO2培养箱中培养24小时。
操作过程中需要注意的是：1.每次加入细胞都使枪头贴着孔壁(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。2.孔加入顺序：可从上到下，从右到左依次加入。3.为了保证细胞密度均匀，最好每加1列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。4.每块96孔板加完细胞后，静置30min，使细胞贴壁。
第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分别加入不同浓度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培养基。第二列至第四列中鹿茸多肽浓度分别为20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培养基。37℃CO2培养箱中培养48h。
第七步：MTT法检测细胞增值情况。48h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液现用现配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中长期冻存)，继续孵育4h后终止。快速、轻轻翻转培养板，弃上清，注意不能把结晶移走。每孔加入150ul DMSO，震荡10分钟，使MTT蓝紫色结晶逐渐溶解。用酶标仪检测490nm处各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培养基孔的OD值为对照。最后，以时间为横轴，以OD值为纵轴绘制柱状图。此实验重复三次。
所得结果如图2所示，48h后实验组与对照组相比，OD值具有明显的差别，说明鹿茸多肽作用48h后可以明显促进细胞增值，并且鹿茸多肽浓度为20ug/ml时促增值作用最为显著。
实施例3
通过MTT法检测不同浓度鹿茸多肽作用于细胞72h后，对细胞增值的影响。
第一步：细胞培养。细胞培养使用低糖型DMEM培养基，血清含量为10％，使用75cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
第二步：细胞消化。取处于对数生长期的生长状况良好的脂肪间充质干细胞(ADSCs)，常规消化。消化时，先加入4ml PBS对脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行清洗，清洗两次，洗去残留的培养基，防止残留培养基与胰酶发生中和作用。然后加入4ml胰酶，放入37℃、5％CO2培养箱中消化1min。细胞皱缩时加入等量培养基终止消化。用一次性无菌塑料管吹打细胞瓶壁，将细胞从细胞培养瓶壁上吹打下来，制成单细胞悬液。
第三步：离心。将单细胞悬液放入离心管中进行离心，1000rpm/min离心5分钟。吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀。
第四步：细胞计数。使用细胞计数板计数，调节细胞个数为10×104/ml(每孔加100ul，相当于每孔10000个细胞)。
第五步：种板。将分散均匀的细胞接种于96孔板，每孔加100ul，脂肪间充质干细胞(ADSCs)每列加4个孔，共需2ml，考虑到种板过程中细胞液的损失，需要配置3ml。四周孔中加入200ul含有双抗的无菌PBS。在第二列至第六列加入脂肪间充质干细胞(ADSCs)，每列设置4个复孔。37℃CO2培养箱中培养24小时。
操作过程中需要注意的是：1.每次加入细胞都使枪头贴着孔壁(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。2.孔加入顺序：可从上到下，从右到左依次加入。3.为了保证细胞密度均匀，最好每加1列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。4.每块96孔板加完细胞后，静置30min，使细胞贴壁。
第六步：加入鹿茸多肽。向孔板中分别加入不同浓度的鹿茸多肽、地塞米松及DMEM培养基。第二列至第四列中鹿茸多肽浓度分别为20ug/ml、100ug/ml、500ug/ml，第五列加入1mg/ml地塞米松，第六列加入等量的培养基。37℃CO2培养箱中培养72h。
第七步：MTT法检测细胞增值情况。72h后取出孔板，每孔加入20ulMTT溶液(MTT溶液现用现配，也可以一次性配好后放于-20℃冰箱中长期冻存)，继续孵育4h后终止。快速、轻轻翻转培养板，弃上清，注意不能把结晶移走。每孔加入150ul DMSO，震荡10分钟，使MTT蓝紫色结晶逐渐溶解。用酶标仪检测490nm处各孔OD值(吸光值)，求每列平均值，只加入培养基孔的OD值为对照。最后，以时间为横轴，以OD值为纵轴绘制柱状图。此实验重复三次。
所得结果如图3所示，72h后实验组与对照组相比，OD值具有明显的差别，说明鹿茸多肽作用72h后可以明显促进细胞增值。
通过分析分析实验所测得的OD值，可以发现同一鹿茸多肽浓度作用不同时间，对细胞增值的影响。如图4所示，鹿茸多肽浓度为20ug/ml，48h时作用效果最为显著，如图5所示，鹿茸多肽浓度为100ug/ml，48h时作用效果最为显著，如图6所示，鹿茸多肽浓度为500ug/ml，48h时作用效果最为显著。
鹿茸多肽的氨基酸序列为：
VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM

Claims (8)

1.一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；
第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；
第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；
第四步，细胞计数；调节细胞个数为5×104～10×104个/ml；
第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板；孔板每列设置3～6个复孔；在37℃，5％CO2培养箱中培养；
第六步，加入氨基酸序列VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM的鹿茸多肽；当间充质干细胞处于对数生长期时，向孔板中加入0～500ug/ml的鹿茸多肽；在37℃，5％CO2培养箱中培养24～72h；
第七步：采用MTT法检测细胞增值情况。
2.根据权利要求1所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，所述的间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，第六步加入鹿茸多肽的浓度为20ug/ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
4.根据权利要求1或2所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，所述的培养基为DMEM培养基。
5.根据权利要求3所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，所述的培养基为DMEM培养基。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，第五步在接种细胞的周围孔中加入含有双抗的PBS溶液。
7.根据权利要求3所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，第五步在接种细胞的周围孔中加入含有双抗的PBS溶液。
8.根据权利要求4所述的一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用，其特征在于，第五步在接种细胞的周围孔中加入含有双抗的PBS溶液。
CN201610826091.3A 2016-09-14 2016-09-14 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用 Pending CN106367384A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610826091.3A CN106367384A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610826091.3A CN106367384A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106367384A true CN106367384A (zh) 2017-02-01

Family

ID=57896843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610826091.3A Pending CN106367384A (zh) 2016-09-14 2016-09-14 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106367384A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834411A (zh) * 2017-03-24 2017-06-13 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法
CN107354128A (zh) * 2017-07-14 2017-11-17 大连理工大学 一种鹿茸多肽的促成骨转化用途
CN111671772A (zh) * 2020-05-28 2020-09-18 中国农业科学院特产研究所 一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用
CN114306386A (zh) * 2022-01-04 2022-04-12 中国农业科学院特产研究所 鹿茸干细胞条件培养基的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087983A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087983A (zh) * 2011-10-27 2013-05-08 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张洪长等: "鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响", 《吉林大学学报（医学版）》 *
张郑瑶等: "梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性", 《高等学校化学学报》 *
张郑瑶等: "梅花鹿鹿茸多肽对小鼠ADSCs迁移、黏附活性及增殖的影响", 《农业生物技术学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834411A (zh) * 2017-03-24 2017-06-13 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法
CN107354128A (zh) * 2017-07-14 2017-11-17 大连理工大学 一种鹿茸多肽的促成骨转化用途
CN111671772A (zh) * 2020-05-28 2020-09-18 中国农业科学院特产研究所 一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用
CN114306386A (zh) * 2022-01-04 2022-04-12 中国农业科学院特产研究所 鹿茸干细胞条件培养基的用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Qi et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells repair critical-sized bone defects through enhanced angiogenesis and osteogenesis in osteoporotic rats
CN106367384A (zh) 一种鹿茸多肽在促间充质干细胞增殖中的应用
CN107223153A (zh) 包含源于正分化成软骨细胞之干细胞的外排体的用于软骨细胞分化诱导或软骨组织再生的组合物
CN101878297A (zh) 用于间质干细胞优化扩增和移植的方法与组合物
CN101748096A (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
CN103396990A (zh) 一种制备间充质干细胞的方法
CN1860222A (zh) 用于临床和商业用途的干细胞
CN105779383A (zh) 一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用
ES2550456T3 (es) Uso de una composición que contiene células madre mesenquimatosas derivadas de sangre de cordón umbilical humano para inducir diferenciación y proliferación de células precursoras neurales o células madre neurales a células neurales
CN106163572A (zh) 用于诱导体细胞直接转分化为血管祖细胞的组合物及其用途
CN108728410A (zh) 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法
CN109988746A (zh) 一种间充质干细胞成脂诱导分化方法
CN103881973A (zh) 一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法
CN106349357B (zh) 一种鹿茸多肽在影响间充质干细胞迁移中的应用
CN109718251A (zh) 利用干细胞重建毛囊的生发方法及应用
CN105505856B (zh) 藁本内酯的应用
CN109852581A (zh) 一种促进干细胞成脂分化的方法及其所用试剂或试剂盒
CN106366174B (zh) 一种鹿茸多肽在降低间充质干细胞黏附力中的应用
CN106148276A (zh) 间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用
Carvalho et al. Could the coculture of skeletal myoblasts and mesenchymal stem cells be a solution for postinfarction myocardial scar?
CN107142243A (zh) 一种增强人脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养方法
CN102703380B (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
CN106190963A (zh) 一种采用线粒体移植促进损伤神经元存活的方法
ES2764199T3 (es) Procedimiento para producir células madre multipotentes y progenitores
CN101974485A (zh) 具有最佳迁移能力的间充质干细胞的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication