CN111671772A - 一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，属于皮肤治疗技术领域。针对如何解决皮肤损伤的问题，本发明从原代鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经体外扩大培养，收集细胞培养液，经分离提取获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够通过NLRP3炎症小体信号通路抑制LPS诱导的HaCat细胞的炎症反应，能够加快皮肤损伤小鼠模型的创面修复、减轻炎症反应。本发明可用于制备治疗皮肤损伤修复药物或化妆品。

Description

一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用
技术领域
本发明属于皮肤治疗技术领域，具体涉及一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用。
背景技术
皮肤是人体第一大器官，作为人体的保护屏障，具有防护外来机械损伤、防止病原微生物和化学性物质入侵机体的重要作用。皮肤损伤有外力导致的机械损伤和病理损伤，例如：日常生活中皮肤损伤，糖尿病患者并发症导致的慢性难愈合病理损伤。研究表明，在皮肤损伤修复过程中抑制炎症是促进皮肤损伤修复愈合的关键。炎症是指先天免疫系统被激活，入侵的病原体攻击皮肤组织产生的反应。目前相关研究报道表明，在治疗皮肤损伤修复中的外泌体，主要来源于脐带、骨髓、脂肪间充质干细胞，在细胞培养过程中质量不易控制。
发明内容
针对如何解决皮肤损伤修复的相关问题，本发明提供一种快速便捷的制备鹿茸间充质干细胞外泌体的技术方法及其在皮肤损伤修复过程中的应用。具体技术方案如下：
一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，所述外泌体提取自鹿茸间充质干细胞。
进一步地限定，所述皮肤损伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。
进一步地限定，所述鹿茸外泌体通过如下方法制备获得：
1)鹿茸间充质干细胞的原代分离：将鹿茸组织经预处理后，取其间充质区，分离获得间充质干细胞；
2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。
进一步地限定，步骤1)所述鹿茸组织为新鲜鹿茸的组织，位于鹿茸尖部区域。
进一步地限定，步骤1)所述预处理是指剥去鹿茸真皮层，将鹿茸组织经含有双抗的PBS清洗后，再用高糖培养基清洗，然后离心弃上清，得到间充质区；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，所述PBS是指磷酸盐缓冲液。
进一步地限定，步骤1)所述间充质干细胞通过如下方法获得：将预处理后的间充质区切块，置于含有双抗的低糖培养基中混匀，加入PBS混匀后离心，弃上清，获取间充质干细胞团，然后经胶原酶I消化，得到间充质干细胞；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素。
进一步地限定，步骤2)所述培养是指将间充质干细胞置于10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，37℃和5％CO2条件培养36h。
进一步地限定，步骤2)所述分离提取是指将收集的细胞培养液离心，收取上清液后进行离心处理，获得的上清液过滤后再次离心，弃上清，向沉淀中加入PBS混匀得到悬液，将悬液离心后弃上清，加入PSB溶液后静置，然后过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。
进一步地限定，所述胶原酶I用量为细胞体积的4-5倍，所述胶原酶的浓度为0.075g/mL。
进一步地限定，步骤2)所述收取上清液后进行离心处理中，离心处理是指将细胞上清液经1,500×g离心15min，收取上清；再经10，000×g离心30min；所述悬液离心条件为120,000×g离心60min。
进一步地限定，所述过滤均为经过0.22μm滤器进行过滤；所述静置时间为15min。
有益效果
鹿茸间充质区来源细胞由于具有很强的分化(成骨、软骨、脂肪)能力，因此被称为鹿茸间充质干细胞。本发明制备的外泌体是一种细胞旁分泌物质，通过实验证明鹿茸间充质干细胞的外泌体具有如下活性：
1)抑制皮肤炎症；
2)促进皮肤损伤小鼠模型创面愈合；
鹿茸间充质干细胞来源的外泌体具有无成瘤性以及低免疫原性的特点，在细胞来源上，鹿茸与脐带、骨髓、脂肪组织相比，具有来源广泛，质量可控等优点，可作为干细胞治疗替代物。本研究发现在皮肤损伤修复过程中，给予鹿茸间充质干细胞来源外泌体能够快速的抑制炎症，修复皮肤组织、促进皮肤细胞增殖、高效促进皮肤损伤愈合和修复，相较于其他来源的外泌体，鹿茸间充质干细胞外泌体的细胞来源广泛、质量可控并且可体外大量收集。可用于制备改善或治疗皮肤损伤修复的化妆品及药物。
附图说明
图1鹿茸间充质干细胞的培养及外泌体的鉴定，其中，A：鹿茸间充质细胞经传代至P2(100倍放大图片)；鹿茸间充质干细胞传代至P5(100倍放大图片)；B：流式细胞术检测鹿茸间充质细胞表达情况；C：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成脂肪能力检测；D：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成骨能力检测，；E：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成软骨能力检测，control代表阴性对照组(未诱导分化)，Induced Group代表实验组，分别经过诱导分化实验；
图2外泌体提取及鉴定，A：外泌体电镜结果；B：外泌体表面标记(蛋白鉴定)，其中cell为鹿茸间充质干细胞，Exo为外泌体；C：外泌体粒径分布情况，横坐标为粒径大小；
图3鹿茸间充质干细胞来源外泌体对LPS诱导的HaCat细胞炎症反应的抑制作用；其中，A：ELISA检测炎症因子TNF-α；B：ELISA检测炎症因子IL-17；C：ELISA检测炎症因子IL-18；
图4鹿茸间充质干细胞来源的外泌体对LPS诱导的haCat细胞的炎症的抑制作用；其中，A：Western blot检测炎症小体相关蛋白NLRP3(1:1000，Abcam)，IL-18(1:1000，Abcam)，pro-Caspase-1(1:1000，Abcam)，IL-1β(1:1000，Abcam)和β-actin(1:1000，Abcam)的表达情况，B为以上炎症小体蛋白水平灰度值统计分析是由使用Image J软件，*表示(P＜0.05)，LPS：脂多糖；Deprived Exos：不含外泌体的细胞培养液；AMSC-Exo：鹿茸间充质干细胞来源的外泌体；
图5鹿茸间充质干细胞来源的外泌体对皮肤损伤小鼠模型的修复作用；其中，A：经肉眼观察在3day，14day经不同分组治疗(鹿茸间充质干细胞外泌体治疗组、PBS组及空白对照组)后各组小鼠背部伤口愈合情况；B：从形态学上计算皮肤损伤小鼠的愈合率，*代表P＜0.05。
具体实施方式
本发明所使用的试剂、试剂盒、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。本发明中所涉及的Westernblot等实验或检测方法如无特殊说明均为本领域常规的实验方法，或参照相应的试剂盒或产品说明书进行。
其中：
75％酒精溶液是指体积分数为75％的酒精溶液。
10％胎牛血清是指胎牛血清在相应培养基中的体积分数为10％。
高糖培养基：购买自康宁，10-017-CVR。
低糖培养基：购买自GIBCO，11885-084。
无外泌体胎牛血清：购买自Viva Cell Biocsiences Y181113。
DMEM/F12培养液:购买自康宁，10-092-CVR
1％盐酸酒精：75％酒精99mL加浓盐酸1mL。
5％CO2是指培养箱中CO2体积分数为5％.
SPF级雄性C57BL/6J：购买自辽宁长生生物有限公司。
LPS：脂多糖购买自Sigma
PBS：磷酸缓冲盐溶液，购买自康宁，R21-031-CVD。
实施例1.鹿茸间充质干细胞来源的外泌体制备方法。
1)鹿茸间充质干细胞的原代分离和培养：将鹿茸组织经预处理后，获取间充质区，于无菌环境中分离获得间充质干细胞；具体操作方法如下：
在春季末和夏季初始时采取新鲜鹿茸，鹿茸间充质区为新鲜鹿茸的组织，位于鹿茸尖部区域。
预处理操作：首先，锯下整块鹿茸，挤出多余血液，装于锡箔纸中密封包装，置于含有冰袋的泡沫箱中，及时送回实验室。于无菌超净台内将鹿茸组织尖部分离，取鹿茸组织尖部约为3cm长度，皮肤组织外绒毛用灭菌手术刀片刮除，剥去鹿茸表面覆盖的真皮层，依次经含有二倍双抗的无菌PBS洗三次，一倍双抗的无菌PBS液清洗三次，高糖培养基清洗一次，离心1000rpm，5min，弃上清，得到间充质区。所述PBS是指磷酸缓冲盐溶液；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
随后，分离间充质干细胞的具体方法如下：
鹿茸间充质干细胞的原代分离：将预处理后的间充质组织切成细小块状，将其置于含有一倍双抗的低糖培养基中混匀，加入20ml磷酸盐缓冲液后离心1000rpm，5min，弃上清，重复离心一次，获取间充质干细胞团，所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。向鹿茸间充质干细胞团加入终浓度为0.075g/mL胶原酶I 30ml左右，将其置于37℃培养箱，消化3-7h，间隔40分钟摇晃一次，得到间充质干细胞。
铺板：将终止消化后悬液过滤，收集至50ml离心管中，离心1500rpm/10min，将A培养基悬浮沉淀，A培养基(gibico)(DMEM/F12培养基Gibco+2％FBS+1％双抗)，铺板，待细胞汇合度长至约90％时传代。
2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养上清，经分离提取得到外泌体。方法如下：
①鹿茸间充质干细胞(AMSCs)培养
应用胰酶消化法培养原代鹿茸间充质干细胞：将培养的间充质干细胞用磷酸缓冲盐溶液PBS轻柔洗3次，弃去PBS，加入含有0.02％EDTA浓度为0.25％的胰酶，置于培养箱(37℃)中消化2-3分钟，应用含有10％胎牛血清的培养液终止消化。
经显微镜形态学观察，间充质干细胞体外扩增至P2代，细胞呈长梭形，生长状况良好(如图1中A所示)。鉴定鹿茸间充质干细胞的表型：利用流式细胞术分析间充质干细胞表达干细胞表面阳性(CD44、CD90、CD105)和阴性标志物(CD34)的情况，结果显示，鹿茸间充质细胞表达CD44、CD90、CD105而不表达CD34分别用油红O、茜素红和阿利新蓝染色检测鹿茸间充质干细胞向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞的分化情况，结果显示油红O染色，可见脂滴；茜素红染色，可见钙结节生成；阿利新蓝染色，上述染色结果显示阳性，表明鹿茸间充质干细胞可以向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化。
通过对干细胞表面标志物的鉴定及其多向潜能分化能力的评估结果分析，我们成功获取鹿茸间充质干细胞，并能够在体外大量扩增培养。该技术方法为鹿茸间充质干细胞的外泌体开发和应用提供了前期基础。
②外泌体的提取
使用含10％无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养液培养鹿茸间充质干细胞，放置于37℃和浓度为5％CO2条件下培养36h。收取200mL细胞培养上清，将细胞培养液上清液经300×g离心10min，收取细胞上清；再经1,500×g离心15min，收取上清；然后经10，000×g离心30min，收取上清，将上清经过0.22μm滤器过滤处理；获得的滤液经120,000×g离心60min，然后将离心获得的上清缓慢弃去，加入2mLPBS混匀悬液，悬液再次经120,000×g离心60min，弃去上清，向管中加入50mLPBS，静置15min，将悬液再次经过0.22μm滤器过滤处理，所得滤液即为鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。
鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体形态和表型的鉴定：
应用Flow NanoAnalyzer model type N30仪器测定外泌体的粒径，经检测外泌体的颗粒平均粒径为81nm(如图2中C)。应用透射电镜观察外泌体形态，电镜下可见外泌体含有双分子层结构形态大小各异(如图2中A)。通过Westernblotting方法检测间充质干细胞外泌体标志物Alix、CD81、TSG101和CD63(如图2中B)。
实施例2.鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体(Exo)在治疗皮肤损伤中的作用。
以小鼠为实验对象，探索实施例1制备的鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体在治疗小鼠皮肤损伤愈合中的作用。
一、实验动物与分组：
(1)构建皮肤创面动物模型
实验用小鼠(C57BL/6J,6周龄)，体重约为25g，雄性36只，随机分配为三组，分别为：模型组(n＝12)，PBS组(n＝12)，AMSC-Exos组(n＝12)，创面观察时期为0天、3天、7天、14天。处理取材前使用10％水合氯醛对实验小鼠腹腔注射进行麻醉，利用无菌手术器械造面积为1×1cm背部创伤口，按照分组进行外泌体点注射治疗，外泌体浓度为1μg/μl经点注射至小鼠损伤部位，实验组将试剂对创口四周实行点注射，空白组无需处理直接包扎，外用油纱和无菌纱布包扎，最外层则使用弹力绷带包扎伤口。
(2)伤口愈合分析
将各组实验小鼠伤口拍照，分析伤口愈合效率。伤口愈合率计算采用公式：伤口愈合率(％)＝(AO-At)/AO×100％，其中AO为初始伤口面积，At为受伤后第3、7、14、21天的伤口面积，经过统计分析，并计算平均伤口愈合效率。
二、实验内容：
下述数据统计分析使用SPSS 19.0，以均数±标准差(x±s)表示计量资料，正态资料应用两组对比t检验方法，P<0.05表示为差异显著有统计学意义。
(一)ELISA检测
应用ELISA试剂盒检测人HaCat细胞炎症因子IL-17(博士得)、TNF-α(博士得)、IL-18(博士得)的表达，具体操作步骤依据说明书：取出反应板和各种试剂组分平衡放至室温，在反应板中先加入梯度稀释的标准品以及样品(经稀释后)，放置于室温条件，洗去多余液体，随后加入100μl各组细胞上清样本，轻轻晃匀，置于37℃孵育2h；用洗涤液洗板5次后，每个孔中加入l00μL HRP标记二抗，置于37℃孵育0.5h；用洗涤液洗板5次后加50μL显色液A和50μL显色液B，15min避光显色；最后加入终止液50μL，洗板，利用酶标仪读取450nm OD值；绘制标准曲线，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制出曲线方程并计算r值(相关系数)，根据曲线方程求出样品所对应的浓度值。
(二)Western blot法
将外泌体和细胞匀浆后，加入预冷的RIPA(Thermo，89900)裂解液，冰上裂解30min，收集上清液，使用BCA(Thermo，23225)蛋白定量试剂盒对收集的蛋白液进行浓度测定，SDS-PAGE电泳后转膜，结束后使用5％的脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，使用稀释后的CD9(Abcam)、CD63(Abcam)抗体4℃孵育PVDF膜过夜，TBST洗三次后，加入二抗，室温孵育1小时后，ECL发光试剂盒显色，凝胶成像系统成像，ImageJ软件读取灰度值。
三、实验结果
1.AMSC-Exo与LPS诱导的HaCat炎症信号通路的检测
外泌体能够调控炎性小体，炎性小体可被多种因素激活，LPS刺激可激活炎性小体。为了进一步验证AMSC-Exo是否通过抑制NLRP3炎症小体信号通路，进而抑制炎症反应。在本发明中，我们证明了LPS预处理HaCat细胞上调了NLRP3、IL-18、IL-1β和Pro-Caspase1的表达水平，说明HaCat细胞炎症反应被激活(图4中A和B)。然而，经AMSC-Exos处显著下调LPS诱导的NLRP3表达水平(P<0.05)。同时，与LPS诱导的细胞相比，在AMSC-Exos终浓度为5μg/ml时，显著下调了炎症小体相关蛋白IL-18、IL-1β以及Pro-Caspase1水平(P<0.05)(图4中A和B)说明鹿茸间充质干细胞来源的外泌体可通过NLRP3炎症小体信号通路抑制LPS诱导的haCat细胞的炎症反应。
2.AMSC-Exos对LPS诱导的HaCat炎症的影响
我们采用ELISA法检测了经LPS诱导的HaCat细胞上清液中的炎症因子。经检验，外泌体能够显著抑制IL-17，IL-18，TNF-α炎症因子的表达水平，与LPS组相比差异显著；*表示P＜0.05；与空白对照组(Control组)相比，LPS刺激后AMSC-Exos组TNF-a(图3中A)、IL-17(图3中B)和IL18(图3中C)水平显著升高，而AMSC-Exos成功降低了TNF-a、IL-17和IL-18水平。可见AMSC-Exos可以抑制LPS诱导的haCat细胞炎症反应。
AMSC-Exos对糖尿病小鼠伤口愈合影响：
为了进一步探索AMSC-Exos对创面的修复作用。我们将其点注射到小鼠全层切除创面的皮肤损伤模型中(图5中A)，并检测创面愈合率(图5中B)。统计结果显示，在经处理3天、7天、14天后，鹿茸间充质干细胞外泌体组与PBS组比较具有统计学差异。与空白处理和PBS点注射组相比，AMSC-Exos治疗组的伤口愈合速度明显更快(图5中B)。经计算，术后第三天AMSC-Exos组伤口愈合率是50.59±5.04％，PBS点注射组伤口愈合率是34.38±2.06％，空白组伤口愈合率是31.76±2.26％；术后第7天AMSC-Exos组伤口愈合率是68.84±2.01％，PBS点注射组伤口愈合率是47.44±2.30％，空白组伤口愈合率是27.18±2.60％；术后第14天AMSC-Exos组伤口愈合率是93.66±0.33％，PBS点注射组伤口愈合率是76.77±0.90％，空白组伤口愈合率是73.61±0.87％(图5中B)。

Claims (10)

1.一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，其特征在于，所述外泌体提取自鹿茸间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鹿茸外泌体通过如下方法制备获得：
1)鹿茸间充质干细胞的原代分离：将鹿茸组织经预处理后，取其间充质区，分离获得间充质干细胞；
2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述预处理是指剥去鹿茸真皮层，将鹿茸组织经含有双抗的PBS清洗后，再用高糖培养基清洗，然后离心弃上清，得到间充质区；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，所述PBS是指磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述间充质干细胞通过如下方法获得：将预处理后的间充质区切块，置于含有双抗的低糖培养基中混匀，加入PBS混匀后离心，弃上清，获取间充质干细胞团，然后经胶原酶I消化，得到间充质干细胞；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)所述培养是指将间充质干细胞置于10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，37℃和5％CO2条件培养36h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)所述分离提取是指将收集的细胞培养液离心，收取上清液后进行离心处理，获得的上清液过滤后再次离心，弃上清，向沉淀中加入PBS混匀得到悬液，将悬液离心后弃上清，加入PSB溶液后静置，然后过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胶原酶I用量为细胞体积的4-5倍，所述胶原酶的浓度为0.075g/mL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)所述收取上清液后进行离心处理中，离心处理是指将细胞上清液经1,500×g离心15min，收取上清；再经10，000×g离心30min；所述悬液离心条件为120,000×g离心60min。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述过滤均为经过0.22μm滤器进行过滤；所述静置时间为15min。
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