CN110384715A - 一种鹿茸脂质体及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹿茸脂质体的制备方法及应用。本发明建立鹿茸脂质体的制备方法，所制备的鹿茸脂质体能够改善记忆再现障碍小鼠的记忆再现能力，具有潜在的抗阿尔茨海默症的活性，可应用于阿尔茨海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鹿茸脂质体，具体地说是一种鹿茸脂质体的制备方法及应用。
背景技术
鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科的动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角。鹿茸入药已有2000多年的历史，《本草纲目》记载鹿茸“生精补髓，养血益阳，强筋健骨，治一切虚损、耳聋、目暗、眩晕虚痢”。近年来研究发现，鹿茸具有促进神经生长、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗衰老等多种生物学功能。鹿茸含有蛋白质、糖胺聚糖、磷脂、脂肪酸、激素样物质、核酸、多胺及各种无机物质，其中鹿茸蛋白是最主要的化学成分，占干重的53.9％～76.4％。
脂质体是由磷脂及其类似物分散于水相，自发形成的具有双分子层结构的封闭囊泡。脂质体能提高被包埋物的稳定性，保护其活性的发挥，并可定向传输至某些器官或组织中，提高被包埋物的有效作用浓度。为提高鹿茸提取物的利用率，赋予其长效、缓释性能，将鹿茸提取-酶解后采用薄膜-超声法包裹在脂质体中，制备鹿茸脂质体。
一次过量饮入乙醇会引起中枢神经系统由兴奋转为抑制，导致记忆力下降、注意力不能集中等症状。且乙醇可剂量依赖性的引起记忆认知功能等损害，这些损害与GABA能突触传递功能改变有关(Li Z,L RL,Cheng XZ.Journal of International Neurologyand Neurosurgery,2007,34(4):343-346)。因此，通过给予小鼠乙醇可建立记忆再现障碍模型，可考察鹿茸脂质体对于阿尔茨海默症的潜在治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种鹿茸脂质体的制备方法及应用，本发明通过酶解将鹿茸中蛋白质降解，经纯化后制备成鹿茸脂质体，所制备的鹿茸脂质体能够改善记忆再现障碍模型小鼠的记忆再现功能。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
将鹿茸酶解、经纯化制备成鹿茸脂质体。
(1)将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量10～50倍(最优范围为10～30倍)的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5％(W/W)(最优范围为0.2～1％)的蛋白酶A，在20～70℃(最优范围为35～60℃)温度下酶解0.5～12小时(最优范围为2～4小时)；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量0.1～3％的蛋白酶B，在20～70℃(最优范围为35～60℃)温度下酶解0.5～12小时，反应结束后合并提取液，将温度升至90～100℃并保温10～30分钟；
(2)酶解液降温至室温，以离心力2000～20000g离心10～20分钟，收集上清液；将上清液经200～500目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物；
(3)向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入25～100mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为3.5～15.0mg/mL和0.6～3.0mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜；向烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入25～100mL水使鹿茸提取物浓度为1～4mg/mL，摇匀水化，冰浴超声5～10min，得鹿茸脂质体混悬液，冷冻干燥得到鹿茸脂质体。另取0.5-2.0mL脂质体混悬液经1000～5000g离心10～20分钟，取上清液经Nanodrop Onec测定肽含量，计算包埋率(包埋率＝(1-上清液肽含量/鹿茸提取物质量)×100％)。
所述蛋白酶A为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等蛋白酶中的一种或几种组合；蛋白水解酶B为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种组合。蛋白酶A和蛋白酶B组成种类不能相同。
本发明建立鹿茸脂质体的制备方法，所制备的鹿茸脂质体能够改善记忆再现障碍模型小鼠的记忆再现能力，具有潜在的抗阿尔茨海默症的作用，可应用于阿尔茨海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
本发明具有如下优点：
1.使用本方法所制备的鹿茸脂质体提取率高、条件温和，对鹿茸中原有的活性组分保留较好。该方法简便可行，溶剂可回收且对环境友好。
2.通过建立小鼠记忆再现障碍模型，考察与验证鹿茸脂质体的活性，为其治疗认知障碍性疾病的潜在作用奠定药理学基础。
3.具有良好的应用前景。本发明作为认知障碍疾病药物或保健食品研发的潜在来源具有广泛的应用前景。
附图说明
图1小鼠水迷宫示意图；
具体实施方式
实施例1
将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量20倍的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(W/W)的菠萝蛋白酶，在50℃温度下酶解3小时；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量0.5％的中性蛋白酶，在50℃温度下酶解2小时，反应结束后合并提取液，将温度升至90℃并保温15分钟。
酶解液降温至室温，以离心力5000g离心10分钟，收集上清液。将上清液经300目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入50mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为10mg/mL和2mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜。烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入50mL水使鹿茸提取物浓度为3mg/mL，摇匀水化，冰浴超声10min，得鹿茸脂质体混悬液，冷冻干燥得到鹿茸脂质体。另取1.0mL脂质体混悬液经3000g离心10分钟，取上清液经Nanodrop Onec测定肽含量，包埋率为55％。
附：改善记忆再现障碍模型小鼠记忆再现能力的动物实验方法与结果1.实验方法
1.1动物分组、给药剂量
实验动物：30只20±2g SPF雄性昆明小鼠，10只/组，不限饮水饮食。
动物分组与给药剂量情况如表一所示。分组后适应性饲养2日，随后连续灌胃给药28天，每天给药1次。至饲养第23、25天时各组进行被动行为学实验；第23-27天进行水迷宫的训练。
表一动物分组与给药剂量
饲养第31日时建立记忆再现障碍模型：除正常组给予等体积生理盐水外，其余组灌胃35％乙醇(V/V)，剂量10mL/kg，并于30分钟后进行跳台实验。同样地，于次日即饲养第32日，除正常组给予等体积生理盐水外，其余各组灌胃35％乙醇(V/V)，剂量10mL/kg，并于30分钟后进行水迷宫实验。
1.2跳台实验
跳台仪底部有一可通36V电压的铁栅，铁栅上置有一块绝缘橡胶平台。实验前先将小鼠放入跳台仪中适应约2分钟，随后将铁栅通电，小鼠会爬上绝缘橡胶平台以避免被电击，个别小鼠会多次重复跳下-跳上平台动作。记录每只小鼠5分钟内被电击的时刻，计算5分钟内小鼠被电击的总次数、发生错误反应(电击次数≥2)的动物数以及第二次和第一次被电击的时间差(即潜伏期)，并计算5分钟内发生错误反应的动物占总数的比例。
样品组与模型组相比，若潜伏期延长、被电击的总次数或发生错误反应的动物数少于模型组且差异有显著性，可判定为该项指标阳性。
1.3水迷宫实验
水迷宫长68cm，宽42cm，高25cm，泳道宽8cm，水深9cm，走向示意图如图1所示。第一次训练前将小鼠放在梯子附近，使其自动爬上3次。以后每次训练前将小鼠放在梯子附近，背朝楼梯，使其自动爬上1次。第一次训练时从A处开始训练，记录各鼠从A点到达终点的时间、发生错误的次数(进入任何一个盲端一次均算一次错误)。此后的训练从B、C、起点处开始，训练至80％以上动物在90s内达到终点后方可再延长路程。停止水迷宫训练5日，灌胃乙醇以建立记忆再现障碍模型并进行末次测试，末次测试需将小鼠放在起点。
每次测试需要记录从起点到达终点所需的时间和进入盲端的次数，对于末次测试，还需计算完成迷宫频次占总频次的比例，即90s内小鼠达到终点的次数占总次数的百分比。图1为小鼠水迷宫示意图。
注意：从A、B、C处开始训练时每鼠训练1次，从起点开始训练时每鼠训练2次，末次测试时每只小鼠测试3次。对90s内未达到终点的小鼠，应引导其到达终点并从楼梯上来以达到训练目的。每次训练或测验时均将头朝起始点。
样品组与模型组相比，样品组到达终点所用的时间或到达终点前的错误次数明显少于模型组，或90s内到达终点的动物数明显多于模型组，且经统计学检验差异有显著性，可判定为该项指标阳性。
1.4统计学分析
所得结果用平均值±标准误(mean±standard error of mean)表示。将各组被动实验的潜伏期与电击次数、水迷宫实验的完成时间先进行方差齐性检验，若方差齐，则进行单因素方差分析(ANOVA)，以正常组和实验组均与模型组两两比较方法进行统计；若方差不齐，需要计算数据的自然对数值后再进行ANOVA。如果其自然对数值的方差仍然为非齐性，或数据不能进行对数变换则改用秩和检验(Wilcoxon two sample test)进行统计。出错比例和到达终点的动物频次两指标均为计数资料，若总样本数<40使用Fisher确切概率法进行统计，否则进行χ2检验。
2.实验结果
跳台实验的潜伏期、电击次数、未出错小鼠比例与水迷宫实验的游泳时长、进入盲端次数、完成迷宫频次占总频次比例如表2所示。
表二动物实验结果
(**：秩和检验，P<0.01；*：秩和检验，0.01<P<0.05)
(++：单因素方差分析，P<0.01；+：单因素方差分析，0.01<P<0.05)
(××：卡方检验或fisher确切概率法，P<0.01；×：fisher确切概率法0.05<P<0.1)
跳台实验和水迷宫实验数据证明，鹿茸脂质体可显著改善记忆再现障碍模型小鼠的记忆再现能力。
实施例2
将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量20倍的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量1％(W/W)的胃蛋白酶，在37℃温度下酶解2小时；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量1％的胰蛋白酶，在55℃温度下酶解4小时，反应结束后合并提取液，将温度升至90℃并保温10分钟。
酶解液降温至室温，以离心力3000g离心20分钟，收集上清液。将上清液经300目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入75mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为8mg/mL和1.4mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜。烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入50mL水使鹿茸提取物浓度为2mg/mL，摇匀水化，冰浴超声8min，得鹿茸脂质体混悬液。冷冻干燥得到鹿茸脂质体。另取1.0mL脂质体混悬液经3000g离心10分钟，取上清液经Nanodrop Onec测定肽含量，包埋率为40％。
实施例3
新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量25倍的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量2％(W/W)的胃蛋白酶，在37℃温度下酶解3小时；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量0.5％的风味蛋白酶，在60℃温度下酶解2小时，反应结束后合并提取液，将温度升至98℃并保温10分钟。
酶解液降温至室温，以离心力10000g离心10分钟，收集上清液。将上清液经500目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入75mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为10mg/mL和2mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜。烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入50mL水使鹿茸提取物浓度为3mg/mL，摇匀水化，冰浴超声5min，得鹿茸脂质体混悬液。冷冻干燥得到鹿茸脂质体。另取1.0mL脂质体混悬液经3000g离心10分钟，取上清液经Nanodrop Onec测定肽含量，包埋率为61％。
实施例4
将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量20倍的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.5％(W/W)的胰凝乳蛋白酶，在50℃温度下酶解3小时；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量0.5％的中性蛋白酶，在50℃温度下酶解2小时，反应结束后合并提取液，将温度升至90℃并保温15分钟。
酶解液降温至室温，以离心力5000g离心10分钟，收集上清液。将上清液经300目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物。
向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入50mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为10mg/mL和2mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜。烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入50mL水使鹿茸提取物浓度为3mg/mL，摇匀水化，冰浴超声10min，得鹿茸脂质体混悬液。冷冻干燥得到鹿茸脂质体。另取1.0mL脂质体混悬液经3000g离心10分钟，取上清液经Nanodrop Onec测定肽含量，包埋率为52％。
Claims (7)
1.一种鹿茸脂质体的制备方法，其特征在于：将鹿茸酶解、纯化，经薄膜-超声分散得到鹿茸脂质体。
2.按照权利要求1所述的鹿茸脂质体的制备方法，其特征在于：
(1)将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量10～50倍(最优范围为10～30倍)的去离子水，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5％(W/W)(最优范围为0.2～1％)的蛋白酶A，在20～70℃(最优范围为35～60℃)温度下酶解0.5～12小时(最优范围为2～4小时)；酶解结束后倾倒提取液，残渣再加入等体积去离子水和鹿茸质量0.1～3％的蛋白酶B，在20～70℃(最优范围为35～60℃)温度下酶解0.5～12小时，反应结束后合并提取液，将温度升至90～100℃并保温10～30分钟；
(2)酶解液降温至室温，以离心力2000～20000g离心10～20分钟，收集上清液；将上清液经200～500目的硅藻土抽滤，滤液冷冻干燥，得到鹿茸提取物；
(3)向圆底烧瓶中加入一定量的卵磷脂、胆固醇，加入25～100mL甲醇使卵磷脂、胆固醇的浓度分别为3.5～15.0mg/mL和0.6～3.0mg/mL，经旋转蒸发除去有机溶剂，脂质在烧瓶内壁形成干膜，氮气吹干后密封过夜；向烧瓶内加入一定量的鹿茸提取物，加入25～100mL水使鹿茸提取物浓度为1～4mg/mL，摇匀水化，冰浴超声5～10min，得鹿茸脂质体混悬液；冷冻干燥得到鹿茸脂质体。
3.按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶A为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等蛋白酶中的一种或几种组合；蛋白水解酶B为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种组合；蛋白酶A和蛋白酶B组成种类不能相同。
4.一种权利要求1～3任一所述制备方法制备获得具有改善记忆再现障碍模型小鼠记忆再现功能的鹿茸脂质体，其具有改善记忆再现障碍模型小鼠记忆再现功能的作用。
5.一种权利要求4所述鹿茸脂质体的应用，其特征在于：所述具有改善记忆再现障碍模型小鼠记忆再现功能的鹿茸脂质体，可作为活性成份用于制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物或保健食品中。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：所述神经系统疾病为神经性退化性疾病。
7.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述疾病为阿尔茨海默症或帕金森症等认知障碍疾病。
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