CN112316104A - 鲟鱼骨肽在制备神经保护制剂中的应用及产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲟鱼骨肽的应用，所述鲟鱼骨肽应用于制备神经保护制剂，优选应用于制备针对酒精引起神经损伤的神经保护制剂。本发明通过动物模型和人群实验证实，本发明提供的鲟鱼骨肽具有加速酒精代谢，从而缓解醉酒症状、酒精更引起的中枢神经麻痹和精神抑郁的作用。

Description

鲟鱼骨肽在制备神经保护制剂中的应用及产品

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种鲟鱼骨肽的应用及产品。

背景技术

饮酒后，酒精通过胃肠到进入血液，在30至45分钟之内达到最大值，然后逐渐降低。乙醇主要在肝脏中氧化分解，分解过程如下：首先乙醇通过血液流到肝脏后，首先被乙醇脱氢酶氧化为乙醛，而乙醛脱氢酶则能将乙醛分解。缺少乙醛脱氢酶的人较多，这种缺失，使得究竟不能被完全分解为水和二氧化碳，而是以乙醛的形式继续留在体内。

饮酒对人体的不利影响是多方面的，首先其代谢过程造成肝脏负担；其次酒精可以透过血脑屏障，对中枢神经产生直接的麻痹作用，并带来永久性损伤，包括记忆障碍、脑萎缩；另外，还有研究显示约40％有饮酒问题的人表现出不同程度的抑郁症症状。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了鲟鱼骨肽的在制备神经保护制剂中的应用及产品，其目的在于通过添加鲟鱼骨肽或服用鲟鱼骨肽制品，加速酒精体内代谢，起到神经保护、缓解醉酒症状、以及抗抑郁的作用，由此解决现有技术的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种鲟鱼骨肽的应用，其应用于制备神经保护制剂，优选应用于制备针对酒精引起神经损伤的神经保护制剂。

优选地，所述鲟鱼骨肽的应用，其应用于制备预防或缓解预防或缓解醉酒症状的药品、保健品、或食品添加剂；或

应用于制备预防或缓解酒精引起中枢神经麻痹的药品、保健品、或食品添加剂；或

应用于制备预防或缓解酒精引起的神经精神抑郁的药品、保健品、或食品添加剂。

优选地，所述鲟鱼骨肽的应用，其应用于制备加速酒精代谢的药品、保健品、或食品添加剂。

优选地，所述鲟鱼骨肽的应用，其所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

优选地，所述鲟鱼骨肽的应用，其所述鲟鱼骨肽硒含量在0.7mg/kg至 0.9mg/kg之间。

优选地，所述鲟鱼骨肽的应用，其所述鲟鱼骨肽分子量小于或等于 250Da的多肽质量分数在80％以上。

按照本发明的另一个方面，提供了一种解酒剂，其含有鲟鱼骨肽的3％至20％。

优选地，所述解酒剂，其所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

优选地，所述解酒剂，其鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

优选地，所述解酒剂，其所述鲟鱼骨肽硒含量在0.7mg/kg至0.9mg/kg 之间。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明通过动物模型和人群实验证实，本发明提供的鲟鱼骨肽具有加速酒精代谢，从而缓解醉酒症状、酒精更引起的中枢神经麻痹和精神抑郁的作用。

附图说明

图1是本发明实施例3提供的旷场实验记录；其中图a为空白组，图b 为基酒组，图c为肽度酒组，每批放四只小鼠同时测试；

图2是实施例3提供的旷场实验统计结果图；

图3是实施例3提供的高台迷宫实验记录；其中图a为空白组，图b 为基酒组，图c为肽度酒组，每次放一只小鼠依次按组测试；

图4是实施例3提供的高台迷宫实验统计结果；其中a为开放臂停留时间差异显著性检验，b为中心、开放臂和闭合臂停留时间结果统计；

图5为实施例3提供的悬尾实验记录；其中图a为空白组，图b为基酒组；每批放3只小鼠同时测试，按组分批测试；

图6是实施例3提供的悬尾实验统计结果；

图7为实施例3提供的强迫游泳实验记录；其中图a为空白组，图b 为基酒组；每批放3只小鼠同时测试，按组分批测试；

图8是实施例3提供的强迫游泳实验统计结果；

图9是实施例4提供的呼吸酒精含量测试记录，其中a为肽度酒饮组， b为基酒组；

图10是实施例4提供的静脉血液样品乙醇定量检测结果统计图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的鲟鱼骨肽的应用，所述鲟鱼骨肽应用于制备预防或缓解醉酒症状的药品、保健品、食品添加剂中；尤其是应用于制备预防或缓解酒精肝毒性的药品、保健品、或食品添加剂、以及应用于制备预防或缓解酒精引起的神经精神抑郁的药品、保健品、或食品添加剂。

所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽，硒含量在0.7mg/kg 至0.9mg/kg之间，分子量小于或等于250Da的多肽质量分数在80％以上。按照如下方法制备：

(1)将鲟鱼鱼骨原料，进行粉碎过160至300目筛，得到鱼骨粉；实验显示对于鱼骨原料的粉碎细度，影响提取过程的整体效果，细度过细导致最终得到的产品多肽活性不佳，而细度过粗导致酶解不完全，导致有机硒的溶出率、吸收率以及酶解后肽的分子量较大，整体营养价值下降。

(2)将步骤(1)中获得的鱼骨粉进行第一次酶解，降解鱼骨胶原蛋白骨架，暴露富硒糖蛋白，获得酶解粗产物；

具体步骤如下：

将步骤(1)中获得的鱼骨粉按照固液比(质量比)1:1至1:2加水制成悬浊液，再加入胶原酶和纤维素酶进行酶解，其中胶原酶质量为鱼骨粉质量的0.3％至0.5％，纤维素酶质量为鱼骨粉质量的0.1％至0.4％，酶解0.5 小时至1.5小时，期间持续搅拌维持温度在25至30℃；加热至90℃以上，维持30分钟灭酶。

(3)将步骤(2)中获得的酶解粗产物进行第二次酶解，获得酶解精产物，使得富硒糖蛋白降解为小分子多肽，其中分子量小于250Da的多肽质量比例超过80％，成为富硒多肽，从而提高硒元素的吸收率。

具体步骤如下：

将步骤(2)中获得的酶解粗产物，加入碱液调节pH值在7.5至8.0，加入质量分数在3％至5％的聚乙二醇、以及入鱼骨粉质量0.5％至1.0％的混合蛋白酶，酶解2小时以上，期间每0.5小时至2小时搅拌一次维持体系均匀，并监测pH值，使得pH值维持在7.5至8.0之间；

所述混合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胰酶、以及菠萝蛋白酶按照质量比1:1～2.5:0.8～1.2的混合，优选1:2.5:1。

本发明提供的解酒剂，含有所述鲟鱼骨肽3％至20％。所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。所述鲟鱼骨肽硒含量在0.7mg/kg至0.9mg/kg之间。

以下为实施例：

实施例1鲟鱼骨肽的制备

本发明提供的具有抗衰作用的鲟鱼骨肽的提取方法，包括以下步骤：

(1)将鲟鱼鱼骨原料，进行粉碎过160目筛，得到鱼骨粉；

(2)将步骤(1)中获得的鱼骨粉进行第一次酶解，降解鱼骨胶原蛋白骨架，暴露富硒糖蛋白，获得酶解粗产物；

具体步骤如下：

将步骤(1)中获得的鱼骨粉按照固液比(质量比)1:1加水制成悬浊液，再加入胶原酶和纤维素酶进行酶解，其中胶原酶质量为鱼骨粉质量的0.5％，纤维素酶质量为鱼骨粉质量的0.4％，酶解1.5小时，期间持续搅拌维持温度在25至30℃；加热至90℃以上，维持30分钟灭酶。

(3)将步骤(2)中获得的酶解粗产物进行第二次酶解，获得酶解精产物，使得富硒糖蛋白降解为小分子，成为富硒多肽，从而提高硒元素的吸收率。

具体步骤如下：

将步骤(2)中获得的酶解粗产物，加入碱液调节pH值在7.5至8.0，加入质量分数在3％的聚乙二醇4000，加入鱼骨粉质量0.5％的混合蛋白酶，酶解3小时，期间每1小时搅拌一次维持体系均匀，并监测pH值，使得pH 值维持在7.5至8.0之间；

所述混合蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶、胰酶、以及菠萝蛋白酶按照质量比1:2.5:1。

(4)将步骤(3)中获得的酶解精产物，反渗透脱盐处理，获得脱盐后的酶解精产物。

所述反渗透脱盐处理参数：压力1MP，温度25℃，脱盐率70％，醋酸纤维素膜。

(5)将步骤(4)中获得的脱盐后的酶解精产物固液分离后，取液相干燥，即制得所述鲟鱼骨肽。

本实施例制备的富硒鲟鱼骨肽的提取产品按照国标GB5009.93—2017 检测所述富硒鲟鱼骨肽的提取产品，硒含量为0.71mg/kg，金属硫蛋白含量 1.77mg/g。委托北京中科光析化工技术研究所(食品实验室)进行多肽含量及分子量分布检测结果如下，显示分子量小于243的多肽含量为87.27：

检测项目	检测结果	单位
			肽总量	89.17	％
分子量分布	242	Da

分子量分布(Da)	百分比(％)
		＞2300	0.0
2300-1200	0.42
		1199-580	5.62
579-242	6.69
		＜243	87.27

实施例2肽度酒对小鼠行为学的影响实验

测试对象：按照20％的比例添加实施例1中制备的鲟鱼骨肽(商品名：肽度酒)；对照：基酒

测试过程：防醉实验和行为学实验

1实验材料：

1.1动物

SPF级昆明种小鼠,饲养环境为光谷生物城干细胞中心5楼实验室动物房，温度在21～22℃，湿度在55±5％，每12h进行一次亮/暗循环，饲料、水均不受限。

1.2酒

肽度酒和基酒均为53％vol。将肽度酒和基酒均稀释2倍，用酒精度数为26.5°的酒给小鼠灌胃。

2防醉实验

2.1实验过程

取40只体质量为20g～22g雄性昆明小鼠，在(25±3)℃、相对湿度 (50±10)％的封闭环境中饲养1周，实验前12h禁食不禁水，随机分为 2组：基酒组，鲟鱼骨肽组。灌胃剂量均为650μL，将灌胃醉酒的小鼠仰卧至四肢朝上，保持姿势30s作为翻正反射消失的指标。

记录各组给酒后翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间及小鼠醉酒只数。

2.2实验结果如下表

醉酒缓解实验结果

组别	小鼠只数	醉酒只数	醉酒时间/min	醒酒时间/min
					基酒组	20	20	23.58±1.64	292.75±13.48
鲟鱼骨肽(肽度酒)组	20	20	39.86±2.21**	195.37±17.43**

由上表可知，鲟鱼骨肽(肽度酒)组对于延缓小鼠醉酒和缩短醉酒时间，与基酒组相比差异表现为极显著差异(P＜0.01)，说明该剂量的鲟鱼骨肽与防醉之间有一定的依存关系，同时也显示了该多肽具有延缓醉酒功效。

实施例3肽度酒对小鼠行为学的影响实验

实验方法：取昆明种雄性小鼠30只,鼠龄为四周左右，体重20g～22g，分为3组，每组8只:

(1)空白组，灌胃给予蒸馏水；

(2)基酒组,灌胃给予500μL的基酒(53％vol酱香型白酒)；

(3)肽度酒组,灌胃给予500μL的添加有实施例1制备的鲟鱼骨肽的基酒(53％vol肽度酒)。

灌胃后，当小鼠一出现醉酒症状后，即刻分别进行行为学实验：

旷场实验、高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验。

旷场实验实验步骤：

采用开口的观察盒(50cm×50cm×50cm)并用与小鼠毛色相反的颜色覆盖内壁，底部分为四等分的方块。将小鼠放入盒底中央区域(25cm×25cm) 适应周围环境30S，适应后进行测试，摄像机记录5分钟内总的跨格数、中央区域花费时间和在中心移动的距离比等，如图1所示。

实验结果如下表所示：

矿场实验结果

统计结果如图2所示：显示相比基酒组，肽度酒组的小鼠表现出类似于对照组更积极的行为，提示实施例1制备的鲟鱼骨肽，具有神经保护作用和抗抑郁作用。

高架十字迷宫实验实验步骤:

高架十字迷宫由两条相对开放臂(30cm长×5cm宽)和两条相对闭合臂 30cm长×5cm宽×15cm高)及中央区(5cm×5cm)连接而成。

测试前小鼠先放在空旷地自由活动5min，小鼠头朝开臂方向放入中央区域，记录5min内小鼠进入开放臂进入次数、停留时间，闭合臂进入次数、停留时间，并计算开放臂停留时间比例，开放臂进入次数比例,如图3所示。

实验结果如下表所示:

高台迷宫实验结果

统计结果如图4所示，实验显示肽度酒组与基酒组相比差异表现为显著性差异明显，肽度酒组小鼠在开放臂的探索时间和探索距离明显较长，且在开放臂表现出清醒的神志，认知能力良好，及时自救，判断能力良好。鲟鱼骨肽具有较为明显的中枢神经保护作用，环节酒精引起的中枢神经麻痹，避免认知能力和判断能力下降。

悬尾实验实验步骤

用胶带把老鼠的尾巴末端(尾巴末端距离2厘米)粘在一根悬吊杆上(离地面30厘米高)。运动活动由视频跟踪系统监测6分钟。静止的时间被记录下来。不动的定义是缺乏自愿的或逃避性的运动。

悬尾实验是一种经典而又能快速评价抗抑郁药物、兴奋药物、镇静药物药效的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态，抗抑郁药物、兴奋药物能明显地缩短改变其状态。末次给药1h 后，将小鼠尾部距末端约1cm处用夹子固定，使其倒吊于距地面15cm左右的横杆上，动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间后，出现间断性不动，显示失望状态，累计各组8min内的不动时间，如图5所示。

悬尾实验结果如下表所示：

悬尾实验结果

统计结果如图6所示，肽度酒组与基酒组相比，基酒组与空白组相比差异表现出一致的趋势，饮用肽度酒组的小鼠低活动量时间较长，不活动时间较短，提示实施例1制备的鲟鱼骨肽具有缓解乙醇对神经的麻痹作用，具有抗抑郁的效果。

强迫游泳实验实验步骤：

将小鼠放入装有干净水的圆柱容器内，水深30厘米，水温23-25℃。第一天，所有的老鼠被迫游泳15分钟进行训练。第二天，把老鼠放在同样的环境中10分钟。运动活动通过视频跟踪系统进行监控。应用电子视觉软件计算每只动物在测试期间的不动状态持续时间。不动状态是指动物放弃主动挣扎，除了保持头部在水面以上的浮动动作之外，躯体处于漂浮不扭动状态。

小鼠不动:被动的漂浮在水上，微微拱起但竖直状态，鼻子在水面上，不动时间越短，表明肽度酒的抗抑郁作用越强，如图7所示。

强迫游泳实验结果如下表所示：

强迫游泳实验结果

统计结果如图8所示，肽度酒组与基酒组相比差异表现为显著性差异不明显，基酒组与空白组相比差异表现为显著性差异明显。实验显示，肽度酒组小鼠相对于基酒组小组的表现低活动量时间较长，而静置不动时间较短，提示鲟鱼骨肽具有抗忧郁效果，考虑到肽度酒与基酒的酒精含量皆为53％vol，相对于对照样本，二者皆显示出对于小鼠的运动能力有影响。

以上行为学实验，皆接体现出肽度酒组的小鼠行为更类似于正常组，提示实施例1制备的鲟鱼骨肽具备神经保护作用。

实施例4人体内酒精代谢速度实验

实验方法：

征集志愿者7名，其中4男3女，年龄分布21至46岁，其中3人三年以上饮酒史，4人无饮酒史。7名志愿者分别进行两次饮酒测试，两次饮酒测试之间相隔24小时，每次饮酒测试前进行静脉血抽血，一次饮酒50ml，通过款速排查酒精含量测试仪每15分钟测试呼吸中酒精含量，记录酒精含量变化，并于饮酒1小时之后，进行二次静脉血抽血。将两次抽血样品，进行乙醇含量测定。

两次饮酒使用的测试用酒分别为：

第一次饮酒测试：添加有实施例1制备的鲟鱼骨肽的基酒(53％vol肽度酒)

第二次饮酒测试：基酒(贵州茅台镇12987工艺酱香酒53％vol)

呼吸酒精含量测试采用测试工具：产自深圳市丰兆为科技有限公司、型号为“捕酒灵1号”的款速排查酒精含量检测仪(酒驾测试仪)；

静脉血样品乙醇含量测定，委托武汉生物样本库有限公司，按照行业标准GA/T842-2009《血液酒精含量的检验方法》，采用SIM模式内标法定量。

实验结果如下：

第一次呼吸酒精测试，测试用酒“肽度酒”，测试结果如图9a所示。

第二次呼吸酒精测试，测试用酒基酒，测试结果如图9b所示。

血液样品乙醇定量检测结果：

饮酒前的血浆样品检测结果

饮酒后的血浆样品检测结果

静脉血液样品乙醇定量检测结果统计如图10所示。

实验显示，整体而言可见肽度酒组的代谢速度较明显的快于基酒组的代谢速度。呼吸酒精测试显示，整体而言添加有鲟鱼骨肽的53％vol具有更快的代谢速度，饮酒史大于3年的志愿者，相较于无饮酒史的志愿者对鲟鱼骨肽的加速酒精代谢速度的效果更为敏感，引用添加有鲟鱼骨肽的酒的志愿者呼吸酒精峰值明显低于饮用基酒的呼吸酒精峰值；血液样品乙醇定量检测结果显示，饮酒1小时后，饮用添加有鲟鱼骨肽的53％vol均值明显低于基酒组。结合小鼠行为学实验，论证了本发明提供的鲟鱼骨肽具有加速酒精代谢，从而保护神经的作用。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽应用于制备神经保护制剂，优选应用于制备针对酒精引起神经损伤的神经保护制剂。

2.如权利要求1所述的鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽应用于制备预防或缓解预防或缓解醉酒症状的药品、保健品、或食品添加剂；或

应用于制备预防或缓解酒精引起中枢神经麻痹的药品、保健品、或食品添加剂；或

应用于制备预防或缓解酒精引起的神经精神抑郁的药品、保健品、或食品添加剂。

3.如权利要求1或2所述的鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽应用于制备加速酒精代谢的药品、保健品、或食品添加剂。

4.如权利要求1所述的鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

5.如权利要求1所述的鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽硒含量在0.7mg/kg至0.9mg/kg之间。

6.如权利要求1所述的鲟鱼骨肽的应用，其特征在于，所述鲟鱼骨肽分子量小于或等于250Da的多肽质量分数在80％以上。

7.一种解酒剂，其特征在于，含有鲟鱼骨肽的3％至20％。

8.如权利要求7所述的解酒剂，其特征在于，所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

9.如权利要求7所述的解酒剂，其特征在于，所述鲟鱼骨肽含有1.5～1.9mg/g的金属硫蛋白肽。

10.如权利要求7所述的解酒剂，其特征在于，所述鲟鱼骨肽硒含量在0.7mg/kg至0.9mg/kg之间。

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