TWI619499B - 黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經細胞之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途及基於此用途的組合物。黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有保護神經細胞活性，可用以製備保護神經細胞之醫藥組合物。

Description

黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經 細胞之用途

本發明是有關於一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途及基於此用途的組合物，特別是一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經細胞之用途，以及保護神經細胞組合物。

隨著醫療、食品科技進步及經濟成功的發展，人類平均壽命得以延長，並已漸漸步入老年人社會。老化所衍生的疾病包含免疫失調、癌症、心血管疾病、神經退化病症及代謝症候群等。其中後兩者所帶來的龐大醫療、社會成本及家庭生活品質的受損，乃不容忽視。

人類的神經系統可分為中樞神經系統和周圍神經系統，其中中樞神經系統包含腦、小腦和脊髓等。神經系統的基本結構單位是神經元，或稱神經細胞，而成人的中樞神經系統的神經細胞是分化的神經細胞，不能再分裂和增 殖，一旦損傷或死亡，即會造成永久性的功能喪失。因此，需要一種方法來保護神經細胞免於受傷、退化或死亡。

黑柄炭角菌(Xylaria nigripe)隸屬於炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)及炭角菌屬(Xylaria)，是一種中國傳統的藥用真菌，通常生長於廢棄白蟻巢穴，其菌絲體形成的菌核即是中國傳統的中藥材料「烏靈參」，又稱作烏靈菌、雷震子等。根據四川《中藥志》記載，烏靈參有「補心腎、治失眠」療效之描述，其具有補氣固腎、健脾除濕及鎮定安神等多種生理活性。

因野生資源逐漸匱乏，黑柄炭角菌有採集不易與品質不穩定的問題。目前開始以人工液態培養黑柄炭角菌菌絲體，是解決天然黑柄炭角菌產量不足和品質不穩定等問題的一種方法。而液態培養的過程中，黑柄炭角菌除了合成自身生長所需的有機物質外，還會分泌代謝產物，其中也可能包含具保護神經細胞功能的成分，因此以液態培養黑柄炭角菌具有發展天然保護神經細胞物質的潛力。但不同的培養方式會令菌體生長型態不同，其基因也表達不盡相同，所產出之代謝產物也必然有所差異，在功效上也不同，或可能產生新的功效與用途。

本發明之一態樣是在提供一種黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌絲體萃取物之用途，其係用於製備保護神經細胞之醫藥組合物。黑柄炭角菌菌絲體萃取物係由下 述步驟所製得：提供一基質，基質實質由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃取物以及99.4~94%重量比之水所組成。接著進行發酵製程，其係於基質中接種黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質。再分離發酵物質，以獲得黑柄炭角菌菌絲體。接著進行萃取製程，其係利用溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成混合物後，將混合物攪拌一萃取時間。最後去除混合物之一固體部份，以獲得一上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物，且黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有保護神經細胞活性。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，前述之基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃出物以及97.5%重量比之水所組成。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中發酵製程之發酵溫度為25℃，發酵時間為10天。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中萃取製程之溶劑可為80℃至100℃的熱水，萃取時間可為0.5小時至2小時。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中萃取製程之溶劑可為70%重量比之乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中混合物之固體部份可利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中保護神經細胞活性可保護或預防神經細胞免於損傷而死亡。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中保護神經細胞活性可透過保護或預防神經細胞的DNA免於損傷。

本發明之另一態樣是在提供一種保護神經細胞之組合物，組合物包含一有效劑量之黑柄炭角菌菌絲體萃取物。

依據前述之保護神經細胞之組合物，組合物係呈選自以下群組之一形式：醫藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。

藉此，本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物因具有保護神經細胞活性，可以保護或預防神經細胞免於損傷而死亡以及可保護或預防神經細胞之DNA免於損傷，故本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用於製備保護神經細胞之醫藥組合物。而包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物之組合物可作為保護神經細胞訴求之醫藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用於生醫保健市場之潛能。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備方法

110、120、130、140、150‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備步驟流程圖。

本說明書揭露內容提出黑柄炭角菌菌絲體萃取物的新穎用途，以體外試驗評估黑柄炭角菌菌絲體萃取物之保護神經細胞活性，並進一步驗證黑柄炭角菌菌絲體萃取物的保護神經細胞活性係為保護或預防神經細胞免於損傷而死亡以及保護或預防神經細胞之DNA免於損傷。本說明書揭露內容提出的黑柄炭角菌菌絲體萃取物為潛在的保護神經細胞補充劑，可用以製備保護神經細胞的醫藥組合物。

本發明所述之「有效劑量」係指黑柄炭角菌菌絲體萃取物能有效保護及/或預防神經細胞免於損傷的量。例如，黑柄炭角菌菌絲體萃取物的有效劑量可預防神經細胞免於損傷及/或在一定程度上緩解與神經細胞損傷所引起的疾病相關的一或多個症狀。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對 本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

<試驗例> 一、製備黑柄炭角菌菌絲體萃取物

請參照第1圖，其係黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備步驟流程圖。第1圖中，黑柄炭角菌菌絲體之製備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140和步驟150。

步驟110是提供一基質，基質實質係由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃出物以及99.4~94%重量比之水所組成。較佳地，基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃出物以及97.5%重量比之水所組成。更進一步說，使用之基質的組成份為20g/L糙米粉與5g/L麥芽萃出物。使用之發酵槽為5公升的攪拌式發酵槽(stirred-tank fermentor)，工作體積為3公升。以提供碳源、氮源及水份讓後續黑柄炭角菌能進行液態培養。

步驟120是進行一發酵製程，係於基質中接種黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質。所使用之菌株為黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為佳，購自食品工業發展研究所食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心(臺灣，新竹)，黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為一分離自台灣本土的菌株。然需說明的是，上述黑柄炭角菌菌株(BCRC34219)僅為本發明之一實施方式。發酵製程係以調節溫度、通氣量等條件，使黑柄炭角菌菌絲體生長。更進一步的說，發酵製程的條件為， 將300mL黑柄炭角菌種菌接種至基質中，再以攪拌轉速為100rpm、通氣量為1vvm及發酵溫度為25℃等發酵條件培養10天後，可獲得發酵物質。

步驟130是分離發酵物質，係將發酵物質分離為固體部份和液體部份，其中固體部分包含黑柄炭角菌菌絲體。在發酵製程完成後，因發酵物質中已充滿黑柄炭角菌菌絲體，因此將發酵物質中的液體部份和固體部分分離後，即可於固體部分中獲得黑柄炭角菌菌絲體。而分離方式可為過濾方式、離心方式或上述方式之組合。

步驟140是進行一萃取製程，利用一溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成一混合物後，將混合物攪拌一萃取時間。於萃取製程中，溶劑可為可為80℃至100℃的熱水，萃取時間可為0.5小時至2小時。或溶劑可為70%重量比之乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。更進一步的說，進行黑柄炭角菌菌絲體萃取物製備時，先使用水清洗黑柄炭角菌菌絲體數次，再利用冷凍乾燥機乾燥黑柄炭角菌菌絲體，製成菌絲體粉末，菌絲體粉末樣品保存於密閉容器內。再將菌絲體粉末與90℃熱水以重量比1：10至1：30之比例混合成一混合物後，將混合物攪拌1小時以萃取其中具有功能性的成分。或是將菌絲體粉末與70%重量比之乙醇以重量比1：10至1：30之比例混合成一混合物後，將混合物攪拌24小時以萃取其中具有功能性的成分。

步驟150是去除混合物之固體部份，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。經過萃取製程 後，黑柄炭角菌菌絲體萃取物已溶解至溶劑中，其中包含具有功能性的成分，因此去除混合物中固體部份後，所獲得的上清液中包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。而混合物之固體部份可利用離心方式、過濾方式或上述方式之組合而去除。更進一步的說，將萃取後之樣品經過濾與離心步驟，取上清液進行濃縮，再使用冷凍乾燥機進行乾燥，即可得黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。

二、黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經細胞能力

PC12神經細胞株係分離自大鼠腎髓質嗜鉻性細胞瘤屬中胚層組織，一般被廣為運用作為研究神經分化、神經毒性、神經藥理、神經保護機制。實驗上以未分化PC12神經細胞(nPC-12 cells)模擬未分化的神經細胞，並以誘導劑H₂O₂處理模擬神經細胞之氧化損傷，藉由細胞存活率分析、乳酸脫氫酶之釋出率、細胞之DNA損傷分析來探討黑柄炭角菌菌絲體萃取物對PC12神經細胞之保護能力。下述試驗例之PC12神經細胞係購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(臺灣，新竹)。

1.細胞存活率分析

PC12神經細胞之存活率(viability)分析以細胞存活率分析法(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide；MTT assay)計算黑柄炭角菌菌絲體萃取物對PC12神經細胞的保護率。MTT為可溶於水的黃色染劑，活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C 的作用下，生成藍紫色不溶於水的MTT-formazan，在波長595nm下具有吸光值。此法除了可偵測粒線體之還原能力外，也可代表細胞存活數目，當吸光值越高表示細胞存活率越高。

實驗上PC12神經細胞培養液為含10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液。進行細胞存活率分析時，先將PC12神經細胞以3×10⁵cell/well之濃度接種於96孔微量盤中，於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時後，分別給予樣品或誘導劑H₂O₂，其中以僅添加誘導劑H₂O₂做為控制組，同時添加誘導劑H₂O₂與樣品為實驗組，而樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物，再於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時。培養後將培養液吸出，用磷酸緩衝液(PBS)洗兩次，加入150μl濃度為0.5mg/ml的MTT，放置37℃、5% CO₂之培養箱反應4小時後，將MTT吸出，再加入100μl二甲基亞碸(DMSO)，以溶解MTT-formazan使溶液呈色。放置隔夜後，以酵素免疫分析測讀儀測定在波長595nm的吸光值，可代表細胞存活數目。而PC12神經細胞保護率的計算方式如下： 其中為同時添加誘導劑H₂O₂與樣品時PC12神經細胞之存活率；為只添加誘導劑H₂O₂時PC12神經細胞之存活率。

請參照下表一，為以細胞存活率分析法分析黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對於PC12神經細胞保護率。

實驗結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物對於PC12神經細胞保護率分別為9.4%、24.1%和29.6%。黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對於PC12神經細胞保護率分別為14.3%、29.2%和33.2%。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆可保護PC12神經細胞免於受到H₂O₂氧化傷害，而保護或預防PC12神經細胞免於損傷而死亡，且具有劑量依賴性。而在不同的樣品濃度下，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對PC12神經細胞保護率均高於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。

2.乳酸脫氫酶釋出率分析

H₂O₂對細胞造成氧化傷害，也導致細胞膜的破壞，因而釋放出乳酸脫氫脢(lactate dehydrogenase,LDH)到培養基之中，故培養基之中LDH釋出率越低，則細胞受到損傷的比率越低，表示樣品越有保護細胞之效力。

實驗上先將PC12神經細胞以3×10⁵cell/well之濃度接種於96孔微量盤中，於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時後，分別給予樣品或誘導劑H₂O₂，其中以僅添加誘導劑H₂O₂做為控制組，同時添加誘導劑H₂O₂與樣品為實驗組，而樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物，再於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時。培養後將培養液吸出，用磷酸緩衝液(PBS)洗兩次後，使用LDH Cytotoxicity Detection Kit(TaKaRa Bio Laboratories,Japan)分析培養液中之LDH活性，可以計算對PC12神經細胞造成的毒性百分率(percentage cytotoxicity)，即表示細胞受到損傷的情形。當分析結果LDH活性較低時，其毒性百分率較小，則細胞受到損傷的情形較不嚴重，表示該樣品越有保護細胞之效力。在這個分析套組中，乳酸脫氫酶活性是藉由比色法來測定，在特定的基質與酵素反應後，反應液的吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關。毒性百分率計算公式如下： 其中OD_樣品：為添加樣品處理後，細胞之LDH釋出量。OD_{Low Control}為未添加樣品之控制組，即細胞自發性之LDH釋出量。OD_{High Control}為未加添樣品之控制組，但添加Triton X-100使細胞100%死亡時之LDH釋出量。

請參照下表二，為以LDH釋出率分析在添加黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物時，對於H₂O₂誘發PC12神經細胞氧化傷害之毒性百分率。

實驗結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物對於H₂O₂誘發PC12神經細胞氧化傷害之毒性百分率分別為40.5%、35.7%和32.9%。黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對於H₂O₂誘發PC12神經細胞氧化傷害之毒性百分率分別為44.4%、36.3%和33.1%。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆具保護PC12神經細胞免於受到H₂O₂氧化傷害的功效，且具有劑量依賴性。而在不同的樣品濃度下，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對PC12神經細胞保護情形均高於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。

3.細胞之DNA損傷分析

單細胞凝膠電泳是一種可以檢測單一細胞DNA受損的方法，其原理是利用低熔點瓊脂膠體電泳分離不同大小片段的DNA，偵測細胞DNA有無斷裂的情況。若細胞DNA未損害則移動慢，而損傷斷裂的DNA片段在電泳後會移動至細胞核外，在核酸染色後，會形成像彗星拖尾的現象，又稱為彗星分析法(Comet assay)。因此，可利用單細胞凝膠電泳來觀 察PC12神經細胞受到誘導劑H₂O₂氧化傷害與黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護後，PC12神經細胞DNA受損的情形。

實驗上以未經任何處理的PC12神經細胞做為對照組，以僅添加誘導劑H₂O₂做為控制組，以同時添加誘導劑H₂O₂與樣品為實驗組。控制組係以300μg/mL的H₂O₂處理2小時後，再進行單細胞凝膠電泳。而實驗組先分別以濃度為10、50、100μg/mL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物或黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物處理24小時後，再以300μg/mL的H₂O₂處理2小時，之後進行單細胞凝膠電泳。在定量分析上，可使用影像處理軟體，統計DNA拖尾比率與拖尾長度。

請參照下表三，不同實驗組之PC12神經細胞的DNA損傷分析結果。

實驗結果顯示，對照組的PC12神經細胞在進行單細胞凝膠電泳時不會有拖尾的情形出現。控制組的PC12神經細胞在進行單細胞凝膠電泳時，拖尾DNA的比率達68.3%，平均拖尾長度為80。而實驗組的P12神經細胞，不論是先經黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物處理24小時，再以300μg/mL的H₂O₂處理2小時後，在進行單細胞凝膠電泳時，可以發現拖尾DNA的比率與 拖尾長度都降低了。尤其是先以100μg/mL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物處理後，拖尾DNA的比率降低為7.6%與平均拖尾長度減短為11.6。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆具有保護PC12神經細胞免於受到H₂O₂氧化傷害的功效，並能保護或預防PC12神經細胞的DNA免於損傷，且不論在何種樣品濃度，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物保護PC12神經細胞的能力均優於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。

由上所述，本發明所揭露之黑柄炭角菌菌絲體萃取物於保護神經細胞活性分析結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體萃取物可以保護或預防神經細胞免於損傷而死亡以及可保護或預防神經細胞之DNA免於損傷。故本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用於製備保護神經細胞之醫藥組合物。本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物所製備之保護神經細胞之醫藥組合物可經由局部表面施用式(topical)投藥、口服(如，口服用粉劑、膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)(例如注射)等適當方法施用。故包含有效劑量之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之組合物，可作為保護神經細胞訴求的醫藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用於生醫保健市場之潛能。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範 圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (7)

1. 一種黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌絲體萃取物之用途，其係用於製備保護神經細胞受損之醫藥組合物，其中該黑柄炭角菌菌絲體萃取物係由下述步驟所製得：提供一基質，其中該基質實質由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃取物以及99.4~94%重量比之水所組成；進行一發酵製程，於該基質中接種一黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質，其中該黑柄炭角菌之寄存編號為BCRC34219，該發酵溫度為25℃，且該發酵時間為10天；分離該發酵物質，以獲得該黑柄炭角菌菌絲體；進行一萃取製程，該萃取製程係利用一溶劑與該黑柄炭角菌菌絲體混合成一混合物後，將該混合物攪拌一萃取時間，其中該溶劑為熱水或乙醇；以及去除該混合物之一固體部份，以獲得一上清液，其中該上清液包含該黑柄炭角菌菌絲體萃取物，且該黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有一保護神經細胞活性。
2. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃取物以及97.5%重量比之水所組成。
3. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該溶劑為80℃至100℃的熱水，該萃取時間為0.5小時至2小時。
4. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該溶劑為70%重量百分比之乙醇，該萃取時間為22小時至26小時。
5. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該固體部份係利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。
6. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該保護神經細胞活性係保護或預防神經細胞免於損傷而死亡。
7. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該保護神經細胞活性係透過保護或預防神經細胞之DNA免於損傷。