CN102286582B - 以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法，该方法包括以下步骤：（1）限制性酶解；（2）蛋白质与脂质分离；（3）超滤法祛除大分子蛋白；（4）离子交换树脂分离纯化；（5）浓缩、喷雾干燥，得记忆改善肽。本发明所研制的改善记忆肽，通过小鼠跳台试验及日式迷宫试验证明该肽具有明显的生理活性，且大脑皮质组织学结构变化揭示该肽能明显增多大鼠脑神经细胞突触类型、增厚突触膜、增多突触小泡、增多线粒体且大型化，证明该改善记忆肽十分有益于大脑皮层的生长发育。该肽可改善成年人记忆力减退并促进未成年儿童的智力发育，同时有望发展成为老年痴呆患者的临床营养食品。

Description

以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法

技术领域

本发明涉及一种记忆改善生物活性肽的制备方法，更具体地说，涉及一种以深海鱼类为主要原料的具有记忆改善功效的生物活性肽的制备方法。

背景技术

学习和记忆是人类中枢神经系统的高级机能，是大脑最基本也是最重要的高级神经功能之一。一些外界因素，如脑部疾病、嗜好烟酒、年龄增长、摄入营养不足或生活、工作压力大等原因则可导致记忆力减退。具有改善记忆的保健食品成为当今社会三大人群的重要诉求：中老年“银发族”、中青年“白领族”、青少年“备考族”。目前，市场上“辅助改善记忆”的保健食品从起效成分上来看，主要有以下一些品种：

（1）蛋白质和氨基酸类。蛋白质参与脑细胞的代谢，维持大脑的各种运动状态，且参与神经传导、负责信息传递的化学物质——神经递质也是由蛋白质的分解产物氨基酸或其衍生物所构成的。如研究发现新型蛋氨酸衍生物（如S-腺苷-L-蛋氨酸）具有辅助改善记忆的效果；磷脂酰基丝氨酸（PS）可促进氧与营养物质进入大脑细胞，同时刺激多巴胺的分泌，增强学习记忆能力。

（2）脂类。脂类可以促进脑细胞发育和神经髓鞘的形成，并保证其维持良好的功能。如来自深海鱼的脂类EPA、DHA等有助于脑细胞中氧的进入和二氧化碳的逸出，可直接提高大脑的工作效率。

（3）矿物质和微量元素。钙、镁、钠、钾等协同维持神经的应激性；钙能保证脑力旺盛、工作持久、头脑冷静并提高人的判断力；磷参与生物氧化、调节能量和物质代谢；铁质可使红细胞运氧的能力加强，脑组织供氧充足；而锌缺乏则会影响智力，妨碍正常的学习记忆功能。

（4）维生素。维生素是提高智力活动的重要营养素之一，如V_C能保护生物膜；B族维生素尤其是V_B1参与碳水化和物代谢，产生能量，保证神经系统的正常功能；V_E能维持脑细胞活力，抵抗不饱和脂肪酸的过氧化物对脑神经细胞的毒害，并能预防脑细胞衰退及脑力疲劳。

（5）生物碱。如从石杉科植物千层塔中提取的生物碱石杉碱甲，是一种强力“乙酰胆碱酯酶”抑制剂，能防止脑组织中乙酰胆碱的分解，提高脑力活动效率，直接改善记忆力。

（6）植物活性物质。如花青素（来自葡萄籽）、儿茶素（来自绿茶）等能清除脑组织代谢过程中产生的游离基，具有减轻脑疲劳和间接提高脑力的作用；银杏提取物可显著改善阿尔茨海默病患者的认知能力，成为近20年来国际保健食品市场上的热门产品；长春花提取物在美国和日本已被批准用作功能食品出售，它可以增加大脑氧和糖的消耗量，使脑细胞间递质量增多，提高记忆力、精神集中能力、方向感和思维能力。

此外，关于中草药成分对于改善记忆的研究也有较多报道：

（1）单味中药。如潘陈为等研究表明中草药川芎嗪对高血氨大鼠空间学习记忆功有辅助作用，可使大鼠寻找障台的平均逃避潜伏期缩短。杨萍等研究发现何首乌可增加小鼠脑内去甲肾上腺素（NA）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）等单胺递质的含量, 从而改善中枢神经系统突触信息传递功能，间接地增强学习记忆能力。戴新民等报道桑科植物楮实对正常小鼠的空间辨别学习、记忆获得有促进作用；可拮抗东茛菪碱造成的记忆获得障碍；改善氯霉素和亚硝酸钠造成的记忆巩固不良。

（2）复合中药。张岗等研究表明由生晒参、制首乌、淫羊藿、干地龙、石菖蒲、川芎、 远志等药物组成的参龙健脑胶囊对于脑缺血损伤（VD）大鼠学习记忆能力有明显的改善，并可显著减轻一氧化氮（NO）等活性氮介质对脑的损伤。张吉仲报道由藏红花、绿绒蒿、荜茇、余甘子、麝香、木香、沉香、檀香、黑种草子等组成的藏药复方珍珠丸，可以增加记忆再现缺失小鼠模型的逃避潜伏期，减少错误次数。袁海峰报道由人参、川芎、生地黄、益智仁、黄芪、丹参、葛根、石菖蒲、何首乌、枸杞子、冰片等组成的复方具有抑制阿尔茨海默病（AD）模型小鼠大脑皮层和海马胆碱酯酶活性，改善小鼠学习记忆的作用。

生物活性肽是蛋白质中20种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的线性或环形肽类的总称，是源于蛋白质的功能性化合物。肽通常以非活性状态存在于蛋白质的长链之中，当用适当的方法释放出某些肽片段时，它们的活性就会表现出来。肽类分为内源性肽与外源性肽两大类，其中内源性肽主要包括体内一些重要内分泌腺分泌的肽类激素，如促生长激素、促甲状腺素、肝脏合成的类胰岛素生长因子、胸腺分泌的胸腺肽、脾脏中的脾脏活性肽等；外源性肽是动植物蛋白经化学法或生物酶法等断裂蛋白质肽链而释放出来的肽段，如从大豆、蛋清蛋白、酪蛋白等动植物蛋白中已得到具有不同生理活性的肽类包括抗氧化肽、降血压肽、抗疲劳肽、解酒肽等等。

内源性肽类物质与大脑的学习记忆有着密切的关系。据美国Duke大学的D.Nemeroff教授报道，在哺乳动物中枢神经系统中的多肽可能多达200种左右，对记忆有调节作用的多肽已经证实的包括：加压素（VP），是垂体后叶释放的一个 9肽，该肽有助于改善注意力和学习失调儿童的记忆再现；促肾上腺皮质激素（ACTH）和黑色细胞刺激素（MSH），都是由腺垂体促肾上腺皮质激素细胞分泌的多肽，研究证实无论在去垂体或是正常动物中，这两种肽都有提高学习能力和加强记忆过程的作用；胆囊收缩素（CCK），是从十二指肠提取物中分离得到的一种能使胆囊收缩的物质，为33肽，大鼠试验证实，皮下或脑室注射CCK可防止易遗忘症的产生。

有关外源性肽类物质对大脑学习记忆能力影响的研究目前甚少。目前公开的中国专利中与记忆增强肽相关的专利共有3个：

（1）中国专利申请公开号【93112493.X】中公开了“记忆增强肽及其应用”，发明人是中国科学院上海生物化学研究所的杜雨苍教授，但该专利中涉及的是利用化学合成法制成的合成多肽，化学结构式为“R1-Asn-X1-X2-Y-R2”，取名为记忆增强肽。

（2）中国专利申请公开号【00116876.2】中公开了“一类记忆增强肽和它们的用途”，发明人也是杜雨苍教授等，该专利涉及对专利号【93112493.X】中的记忆增强肽通过化学合成进行结构改进，并借助动物试验研究其对不同人群智力发育的影响。

（3）中国专利申请公开号【00104242.4】中公开了“记忆增强肽在制备治疗更年期综合征药物中的应用”，该专利中所提及的“记忆增强肽”即为专利号【93112493.X】中所合成的多肽，此专利仅是探讨上述肽在制药中的新应用。

综上所述，目前关于生物酶法制备的生物活性肽对学习和记忆影响的报道尚无。限制性酶解法生产生物活性肽具有化学法所不能比拟的优势，酶法水解在温和的条件下进行，能在一定的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且易于控制水解进程，因而能较好地满足肽的生产需要。此外，蛋白质酶降解法生产生物活性肽安全性极高，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解过程易控制，因而近几年报道的活性肽的制备方法主要为酶解法。  

近年来随着人们对海洋生物的关注度愈加提高，由于海洋生物长期处于海水这样一个特异的闭锁环境里，在进化过程中产生了与陆上生物不同的代谢系统和机体防御系统，因此海洋生物中蕴藏着许多功能特异、结构新颖的生理活性物质，包括肽类、生物碱类、多糖类、多烯类不饱和脂肪酸等化合物。牛津大学的研究人员对挪威西部的2031名年龄为70-74岁之间的老年人的调查研究发现，经常吃鱼的老年人，在参加记忆、视觉感知、空间认知、注意力、方向感和语言流畅度测试时，得分高于不经常吃鱼的老年人。另外，德国《星期日图片报》报道，日本民族平均智商为115，有10%的人智商在130 以上，而德国人、英国人、美国人的智商达到130以上的只有3%。因此，利用深海鱼类开发益智产品具有潜在的可行性，同时也是实现海洋生物资源可持续性发展的重要途径之一。

本发明人以深海鱼为原料，通过生物可控酶解的方法制备具有改善记忆功效的生物活性肽。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述问题，提供以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法，能为相关健脑功能性食品的开发提供一种基料，具体技术方案如下。

以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法，包括如下步骤： 

（1）限制性酶解：将冷冻的深海鱼解冻后去头、内脏，搅成肉糜备用，以上述肉糜为原料，加水使蛋白质含量达到6-10%（w/w），水浴加热至45-60oC，加入Alcalase或木瓜蛋白酶中的一种或两种，酶解至水解度为28-35%，90-98oC灭酶10-15min，得酶解液；

（2）蛋白质与脂质分离：酶解液于4-8 oC冷冻离心，离心转速4800~6500g, 离心时间30-45min，离心后去除上层脂质，得离心清液；

（3）超滤祛除大分子蛋白；将离心清液过滤，过分子量为10-30kDa的超滤膜，取透过液；

（4）离子交换树脂分离：将透过液通过001×7凝胶型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂，以纯水为洗脱剂，收集洗脱液；

（5）浓缩、喷雾干燥，得记忆改善肽：真空浓缩步骤（4）分离后的产物，喷雾干燥，得记忆改善肽。

上述方法中，所述冷冻为将捕获后的深海鱼于-18~-22oC温度下冷冻。

上述方法中，深海鱼包括小黄鱼、石斑鱼中的一种以上。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明制得的记忆改善肽可使小鼠走迷宫的错误次数明显减少，跳台试验亦证实该肽可使小鼠触电潜伏期明显延长，错误次数极显著减少，提高了学习记忆的能力，具有改善记忆力的功效。

2、本发明的记忆改善肽的制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施不限于此。

实施例1

（1）限制性酶解：小黄鱼捕获后于-18oC温度下急冻，解冻后去头、内脏，搅成肉糜备用。以上述肉糜为原料，加水使蛋白质含量达到10%（w/w），水浴加热至45oC，加入Alcalase酶解至水解度为28%，98oC灭酶10min，得酶解液；

（2）蛋白质与脂质分离：酶解液于4 oC冷冻离心，离心转速4800g, 离心时间30min，离心后去除上层脂质，得离心清液；

（3）超滤祛除大分子蛋白；将离心清液过滤，过分子量为10kDa的超滤膜，取透过液；

（4）离子交换树脂分离：将透过液通过001×7凝胶型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂，以纯水为洗脱剂，收集洗脱液；

（5）浓缩、喷雾干燥，得记忆改善肽：真空浓缩分离后的产物，喷雾干燥，得记忆改善肽。  

实施例2

（1）限制性酶解：石斑鱼捕获后于-22oC温度下急冻，解冻后去头、内脏，搅成肉糜备用。以上述肉糜为原料，加水使蛋白质含量达到6%（w/w），水浴加热至60oC，加入木瓜蛋白酶酶解至水解度为35%，90oC灭酶15min，得酶解液；

（2）蛋白质与脂质分离：酶解液于8 oC冷冻离心，离心转速6500g, 离心时间45min，离心后去除上层脂质，得离心清液；

（3）超滤祛除大分子蛋白；将离心清液过滤，过分子量为30kDa的超滤膜，取透过液；

（4）离子交换树脂分离：将透过液通过001×7凝胶型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂，以纯水为洗脱剂，收集洗脱液；

（5）浓缩、喷雾干燥，得记忆改善肽：真空浓缩分离后的产物，喷雾干燥，得记忆改善肽。

本实施方式通过不同的试验证明记忆改善肽对学习记忆的影响及其机制：（1）跳台法评价记忆改善肽对小鼠学习记忆的影响；（2）迷宫法评价记忆改善肽对小鼠学习记忆的影响。

实验动物：健康合格的NIH小鼠，雌雄兼有，体重17-20克；健康合格的SD大鼠，雌雄兼有，体重60-80克；均由广东省医学实验动物中心提供。

实验剂量设计： 给NIH小鼠灌胃，测得其对记忆改善肽的最大耐受量为36g/kg。均按体重法换算，实验中大鼠与小鼠的剂量设计均按小鼠（按公斤体重法）最大耐受量的1/18、1/36、1/72设置，即为高剂量组 (2g/kg·bw)、中剂量组 (1g/kg·bw)、低剂量组 (0.5g/kg·bw)。空白对照组灌胃生理盐水；阳性对照组灌胃天然牛磺酸（纯度大于95%）。经查阅文献，其有效剂量为150mg/kg·bw，故按此剂量试验。

统计分析：所有数据统计分析由SPSS13.0软件进行处理，实验数据采用平均值±标准差（x ± s）表示，以P<0.05为差异有显著意义。

跳台法评价改善记忆肽对小鼠学习记忆的影响

（1）实验动物饲养及分组：选取健康合格的NIH小鼠90只，随机分成5组（即空白对照组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组），每组18只，雌雄各半，分笼饲养，动物体重17±2.1g，按上述实验剂量设计连续灌胃30天。

（2）跳台实验训练及测验方案：跳台装置为一长方形反射箱，其长径被黑色塑料板隔为若干区间，底部铺以间距为5mm的铜栅，可通电流。每个小区间有一个小平台。实验时，将小鼠放在铜栅上，当铜栅通电时，跳在铜栅上的小鼠受到电击，其正常反应是躲避电击跳上平台，大部分小鼠有可能再次或多次跳下平台受到电击，受到电击时又会迅速跳回平台，如此进行训练。训练频率为每2天1次，灌胃期间训练15次，训练于灌胃前1小时进行。具体训练方案如下：电压控制在36V，将小鼠放入铜网上，先适应环境3min，然后通电，小鼠受电击后，多数跳上平台逃避电击，若小鼠跳下平台，以小鼠双足同时接触铜网为触电，视为错误反应。灌胃30天后，进行正式试验。试验开始时，将小鼠放在跳台上，同时按动秒表，记录小鼠第1次跳下时间，此为触电潜伏期，记录5min内小鼠跳下次数（即错误次数），作为记忆指标，将结果进行t-检验统计分析（表1）。

（3）实验结果：表1所示为各组实验小鼠触电潜伏期及5min内错误次数的记录，从表中可以看出，与空白对照组相比较，高、中、低3个剂量灌胃记忆改善肽均均可使小鼠触电潜伏期明显延长，其中高、中剂量组与空白对照组之间对比差异显著（P<0.05），而低剂量组的改善效果不显著（P>0.05）。此外，高、中剂量组灌胃记忆改善肽可使小鼠5min内错误次数显著减少，尤其是高剂量组灌胃的效果与阳性对照组相当，比起空白对照组有极显著的改善（P<0.01），中剂量灌胃组的效果也比空白对照组有显著改善（P<0.05），但低剂量灌胃组的效果与空白对照组无显著差异（P>0.05）。以上结果提示，按中剂量（1.0g/kg）以上灌胃记忆改善肽有助于小鼠记忆获得，且效果显著。

表1 改善记忆肽对小鼠学习记忆的影响（跳台法）(n=18，±SD)

组   别	剂    量	触电潜伏期（秒）	5min内错误次数（次）
				空白对照组	0.2 ml/10g·bw	198 ± 42.7	2.48 ± 0.65
高剂量组	2.0 g/kg·bw	312 ± 72.3**	0.41 ± 0.87***
				中剂量组	1.0 g/kg·bw	305 ± 65.6**	0.51 ± 0.73**
低剂量组	0.5 g/kg·bw	289 ± 57.4	1.12 ± 1.02
				阳性对照组	150 mg/kg·bw	302 ± 61.5**	0.62 ± 0.91***

注：与空白对照组比较：**P<0.05，  ***P<0.01.

迷宫法评价改善记忆肽对小鼠学习记忆的影响

（1）实验动物饲养及分组：选取健康合格的NIH小鼠90只，随机分成5组（即空白对照组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组），每组18只，雌雄各半，分笼饲养，动物体重17±1.6g，按上述实验剂量设计连续灌胃30天。

（2）迷宫训练及测验方案：采用日本式迷宫装置进行试验。首先对小鼠进行“迷宫熟悉训练”，即将小鼠放在迷宫装置中，让小鼠在迷宫内走动，熟悉迷宫的环境。之后，进行“迷宫引导训练”，即对迷宫进行挡盲处理，把迷宫的各个盲点入口用纸板挡住，形成一条从起点到终点的捷径，在终点放置食物，将饥饿小鼠放在迷宫装置的起点，让其自主走到终点，并在终点让小鼠吃到适量食物作为奖励，如此重复训练，训练次数按小鼠当天的熟悉迷宫的程度和精神状态来确定，持续3天。3天后，进行“迷宫强化训练”，把之前放置在各个盲点入口纸板撤掉，恢复原状，在迷宫终点放置食物，将饥饿小鼠放在迷宫装置的起点，让小鼠自主走到终点，并让小鼠吃到适量食物作为奖励。该训练每3天一次，让小鼠每次均在空腹状态下用食物条件反射法使小鼠沿正确路线到达存放饲料的迷宫终点，自由进食5~10min，然后将小鼠取出放回饲养笼。灌胃30天后，正式测试小鼠从迷宫模式起点走至终点的时间，以及向回头走、向前走错的的次数，连续测试3天，整理数据，将结果进行t-检验统计分析（表2）。

（3）实验结果：表2所示为各组实验小鼠达到终点的时间及错误次数的记录，从表中可以看出，与空白对照组相比较，高、中、低3个剂量灌胃记忆改善肽均均可使小鼠达到终点的时间明显缩短，其中高、中剂量组与空白对照组对比有极显著差异（P<0.01），效果甚至优于阳性对照组（P<0.05）；低剂量组也比空白对照组的平均达到时间有明显缩短（P<0.05）。就错误次数而言，高、中、低剂量组也比空白对照组明显减少（P<0.05），效果与阳性对照组相当（P>0.05）。以上结果表明，小鼠经灌胃记忆改善肽，在走迷宫训练时，到达终点的时间明显缩短，且走错次数明显减少，提高了学习记忆的能力。

表2 改善记忆肽对小鼠学习记忆的影响（日式迷宫法）(n=18，±SD)

组    别	剂    量	到达终点的时间（s）	错误次数（n）
				空白对照组	0.2 ml/10g·bw	385 ± 84.6	14.1 ± 3.7
高剂量组	2.0 g/kg·bw	232 ± 74.7***	9.3± 4.5**
				中剂量组	1.0 g/kg·bw	256 ± 87.9***	10.2 ± 3.3**
低剂量组	0.5 g/kg·bw	284 ± 100.7**	11.6 ± 5.2**
				阳性对照组	150 mg/kg·bw	266 ± 104.2**	10.5 ± 3.1**

注：与空白对照组比较：**P<0.05，  ***P<0.01。

Claims (2)

1.以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法，其特征在于包括如下步骤： 

（1）限制性酶解：将冷冻的石斑鱼解冻后去头、内脏，搅成肉糜备用，以上述肉糜为原料，加水使蛋白质含量达到6-10%（w/w），水浴加热至45-60oC，加入Alcalase或木瓜蛋白酶中的一种或两种，酶解至水解度为35%，90-98oC灭酶10-15min，得酶解液；

（2）蛋白质与脂质分离：酶解液于4-8 oC冷冻离心，离心转速4800~6500g, 离心时间30-45min，离心后去除上层脂质，得离心清液；

（3）超滤祛除大分子蛋白；将离心清液过滤，过分子量为30kDa的超滤膜，取透过液；

（4）离子交换树脂分离：将透过液通过001×7凝胶型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂，以纯水为洗脱剂，收集洗脱液；

（5）浓缩、喷雾干燥，得记忆改善肽：真空浓缩步骤（4）分离后的产物，喷雾干燥，得记忆改善肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述冷冻为将捕获后的石斑鱼于-18~-22oC温度下冷冻。