CN105255978B - 具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用途，该方法包括以下步骤：将凤尾鱼绞成肉糜，加水混合，加入蛋白酶酶解，所得上清液为凤尾鱼酶解液；往酶解液中添加还原糖，在90‑110℃的条件下反应1‑2h后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥后得到凤尾鱼美拉德肽。本发明首先采用生物酶解技术最大程度释放凤尾鱼蛋白中的具有改善记忆作用的蛋白肽，然后通过美拉德反应进一步提升其生物功效。同时，美拉德反应亦可改善酶解产物的风味，去除海洋产品的鱼腥味，产生令人愉悦的香味。

Description

具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽，及其制备方法和用途。

背景技术

现代社会的高速发展带来了经济腾飞和生活便利，同时，也给人们带来了压力，当人们长期处在高压力环境中，会出现记忆衰减或神经性损伤。此外，人类机体的自然老化、大脑创伤以及大脑退行性疾病同样也会造成记忆退化。研究表明，记忆的下降或退化与大脑海马区病变、神经递质减少以及突触病变等有关。此外，发生在中枢神经系统(Centralnervous system，CNS)的氧化应激和炎症损伤会随着年龄的增加而增加，从而导致许多与年龄相关的神经退行性疾病的产生，如阿尔茨海默病、帕金森病等疾病。其中，阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，又称老年痴呆症，以短期记忆障碍为主要临床表现的进行性神经病变疾病，是影响中老年人生活质量的隐形杀手。因此，探索和研究具有预防、改善或治疗与记忆相关疾病的功能物质成为了热点。

美拉德反应(Maillard Reaction,MR)是食品在热加工和贮藏过程中自然发生的羰基和氨基之间的化学反应，赋予热加工食品以独特的风味。已有大量研究表明，美拉德反应产物(MRP)可以提供令人愉悦的风味，而且也有文献报导其可以提升肽的抗氧化与抗炎症作用，而抗氧化与抗炎症作用对记忆均具有一定的改善效果。因此，美拉德反应是一种潜在提升改善记忆肽活性的手段之一。

海洋鱼蛋白质资源丰富，是一种制备生物活性肽的优质蛋白原料。近年来，在利用海洋鱼蛋白制备生物活性肽方面取得了一定的进展，例如利用海洋鱼制备具有降血压、抗贫血、抗痛风以及补充胶原蛋白等活性的蛋白肽产品。

申请号为201110167083X，名称为“以深海鱼为原料制备具有改善记忆的生物活性肽的方法”的中国专利公开了以深海鱼类为主要原料开发生物活性肽的制备方法，通过采用限制性酶解、超滤及离子交换树脂分离纯化获得得记忆改善肽；并通过小鼠实验表明该肽具有明显的改善记忆功效。但该法工艺复杂，需要多步分离纯化，难于实现大规模生产。

凤鲚，Coilia mystus(1inaeus)属鲱形目，鲲科，鲚属，称为凤尾鱼、肉鲚等。其为沿海中型鱼类，栖息于港湾、河口附近。80年代以来年平均产量为1961.3吨，约占长江口鱼虾类总产量的48.6％。凤尾鱼肉中含15-20％的蛋白质，其氨基酸组成比较合理，且脂肪含量低，是一种优质的蛋白质资源。目前我国主要将凤尾鱼制成罐头出售，产品远销东南亚和欧美等国，深受广大消费者喜爱，但罐头产品的附加值较低，没有最大程度利用这些优质的海洋蛋白资源。因此，有必要对凤尾鱼进行精深加工，提升其价值。以凤尾鱼为原料，通过生物可控酶解的方法制备具有改善记忆功效的生物活性肽，对提升凤尾鱼的附加值和拓展应用领域都具有重大的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的凤尾鱼美拉德肽。

本发明的再一目的在于提供上述的凤尾鱼美拉德肽在食品、保健品或药品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将凤尾鱼去头去内脏，清净后绞成肉糜；

(2)将肉糜与其质量1-3倍的水混合，加入蛋白酶在45-60℃下酶解，酶解6-10h后，灭酶、离心，所得上清液为凤尾鱼酶解液；

(3)取凤尾鱼酶解液，按照其中蛋白含量的1.0-3.0％(w/w)添加还原糖，在90-110℃的条件下反应1-2h后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥后得到凤尾鱼美拉德肽；

步骤(2)所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰酶或Alcalase 2.4L中的一种以上，以凤尾鱼肉糜的质量为计算基准，蛋白酶总添加量为0.5-1.0％；

步骤(3)所述的还原糖为食品级葡萄糖、木糖或核糖中的一种，优选核糖；

步骤(3)所述的真空浓缩，是将凤尾鱼酶解液浓缩至固形物含量30-50％，然后进行减压浓缩。

由上述方法制得的凤尾鱼美拉德肽可用于制备预防、治疗记忆退化的食品、保健品和药品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首先采用生物酶解技术最大程度释放凤尾鱼蛋白中的具有改善记忆作用的蛋白肽，然后通过美拉德反应进一步提升其生物功效。同时，美拉德反应亦可改善酶解产物的风味，去除海洋产品的鱼腥味，产生令人愉悦的香味。

(2)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、蛋白回收率高，所得改善记忆肽活性强，风味佳，可广泛应用于食品领域中。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中海洋鱼肽与PC12细胞H₂O₂损伤保护实验方法如下：

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，由上海细胞库购入。采用Dulbecco’sModified Eagle Medium培养基培养，其中加入10％胎牛血清(FBS)，1％的青霉素。在5％CO₂浓度，37℃下进行培养。传代三次后，进行过氧化氢损伤试验。采用96孔板培养细胞，细胞浓度在1.5×105细胞/孔。细胞首先与不同浓度的肽样品进行共同培养12小时后，换取新鲜的培养基。进而采用过氧化氢损伤2h后采用相差显微镜观察细胞形态，并采用MTT法检测细胞存活率。

MTT法，又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

采取250μL(终浓度在0.5mg/mL)的MTT加入到96孔板中，与待测样品避光共培养4h之后，将96孔板中旧的培养基吸出，加入250μL DMSO溶解甲瓒。采用酶标仪570nm检测甲瓒浓度，计算细胞存活率。

其中：

A实验为加了样品和过氧化氢的细胞；

A对照为只加了相同体积PBS的PC12细胞。

本发明实施例中，动物行为学测定方法如下：

通过Morris水迷宫法及跳台观察多肽产品对东莨菪碱致学习记忆获得障碍模型小鼠学习记忆能力的影响。Morris水迷宫是一种常被用于啮齿类动物神经认知疾病模型的验证和神经认知治疗可行性评估的方法，其优点是能提供大量的实验参数，较系统全面地考察实验动物的空间认知过程，客观反应动物的认知水平，且能较好地减少感觉和运动功能障碍对测定的干扰。

受试对象：

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，20-22g，购自广州中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)2008-0020

阳性药物：

吡拉西坦片：广东华南药业集团有限公司，批号121004；

试验试剂和仪器：

氢溴酸东莨菪碱注射剂：广州白云山明兴制药有限公司，批号130401；

生理盐水注射剂：江西科伦药业有限公司，批号D121018E；

无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司(分析纯)，批号GB/T 678-2002

电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司，型号EL204

XZC-5A型小鼠跳台仪：山东省医学科学院设备站，编号0012；

Morris水迷宫视频分析系统：上海移数科技有限公司，编号0017625。

试验方法：

样品对东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠空间学习和记忆能力的影响(Morris水迷宫实验)

定位航行实验(place navigation)

定位航行实验是让动物通过空间线索学习平台的位置，实验进行5天，每天训练4次。实验前一天将小鼠置于水迷宫中自由游泳2min，以熟悉水性。训练第一天为可见移动平台，此间将平台设高于水面1-2cm，并在平台上插入带红色小旗子使动物能识别，每训练一次将平台顺序移动。第2-5天为固定隐藏平台期，此时平台设于SE点，低于水面1-2cm。训练时小鼠从随机从现象点处面向池壁入水，视频跟踪系统记录其在60s内首次寻找到平台并且停留3秒以上的所需时间，记录为逃避潜伏期(escape latency)。训练期间，阳性对照及给药各组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液1.0mg/kg，模型和正常组给予等量生理盐水，30min后入水训练，连续5天。

空间探索实验(probe test)

用于测试动物的学习记忆能力，定位航行实验结束次日开始，此期间撤掉水池中的安全平台。给药第15天起，小鼠从测试点放入水池中，测定其60s内在平台象限的游泳时间。末次给药1h后，小鼠放入水中游泳，计算机定位跟踪系统记录小鼠60s内游泳轨迹。

样品对东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠空间学习和记忆能力的影响(跳台实验)

水迷宫实验结束次日进行跳台实验。末次给药后，模型对照组和受试药组分别腹腔注射氢溴酸东莨菪碱1.0mg/kg，正常对照组腹腔注射相应体积生理盐水，30min后进行跳台训练。实验时，将动物置于暗室，适应环境3min，然后立即通以36V电流，动物跳至铜栅时即受到电击，为错误反应，其正确反应是跳回安全区。如此训练5min，记录5min错误次数。24h后重复测试，先将跳台装置通以36V电流，然后将动物放在安全台上，记录小鼠5min内跳下平台的潜伏期和错误次数。

实施例1

一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法，包括以下步骤：

(1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入搅肉机中制成肉糜；

(2)加入肉糜质量2倍的水，加入鱼肉糜质量0.25％的木瓜蛋白酶和0.25％的Alcalase 2.4L，然后在60℃下保温水解，当酶解6h后，95℃加热15min灭酶，冷却后在3500r/min下离心10min，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；

(3)向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量1.0％的核糖，在90℃下反应2h，然后冷却至室温，得到凤尾鱼美拉德反应液。

(4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为40％；通过喷雾干燥，得到凤尾鱼美拉德肽1。

当凤尾鱼美拉德肽1浓度为1mg/ml时，可使得经H₂O₂损伤的PC12细胞存活率达到79.75％。

实施例2

一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法，包括以下步骤：

(1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入搅拌机中制成肉泥；

(2)加入肉糜质量1倍的水，添加肉糜质量0.27％的木瓜蛋白酶，0.27％的胰酶和0.27％的水解蛋白酶，在55℃下酶解8h，然后在95℃下加热15min灭酶，冷却后在3500r/min下离心10min，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；

(3)向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量2.0％的木糖，在100℃下反应1.5h，然后冷却至室温，得到凤尾鱼美拉德反应液。

(4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为30％；通过喷雾干燥，得到凤尾鱼美拉德肽2。

当凤尾鱼美拉德肽2浓度为1mg/ml时，可使得经H₂O₂损伤的PC12细胞存活率达到82.32％。

实施例3

一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法，包括以下步骤：

(1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入搅拌机中制成肉泥；

(2)加入肉糜质量3倍的水，添加肉糜质量0.33％的木瓜蛋白酶，0.50％的胰酶和0.17％的水解蛋白酶，在45℃下酶解10h，然后在95℃下加热15min灭酶，冷却后在3500r/min下离心10min，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；

(3)向凤尾鱼蛋白酶解液中添加其蛋白质量3.0％的葡萄糖，在110℃反应1.0h，然后冷却至室温，得到凤尾鱼美拉德反应液。

(4)采用真空浓缩法将凤尾鱼美拉德反应液浓缩至固形物含量为50％；通过喷雾干燥，得到凤尾鱼美拉德肽3。

当凤尾鱼美拉德肽3浓度为1mg/ml时，可使得经H₂O₂损伤的PC12细胞存活率达到77.21％。

对比例1

采用常规方法(非本发明方法)水解凤尾鱼制备蛋白肽，包括以下步骤：

(1)凤尾鱼去头去内脏，清洗干净后，放入搅拌机中制成肉泥；

(2)加入肉糜质量1倍的水，添加肉糜质量0.27％的木瓜蛋白酶、0.27％的胰酶和0.27％的水解蛋白酶，在55℃下酶解8h，然后在95℃下加热15min灭酶，冷却后在3500r/min下离心10min，收集上清液，得到凤尾鱼蛋白酶解液；

(3)采用真空浓缩法将凤尾鱼蛋白酶解液浓缩至固形物含量为45％；通过喷雾干燥，得到凤尾鱼蛋白肽1。

当凤尾鱼蛋白肽浓度为1mg/ml时，使得经H₂O₂损伤的PC12细胞存活率为达62.12％。

表1海洋鱼蛋白肽PC12细胞H₂O₂损伤保护实验比较

*:表示样品与模型组比较p<0.05。

表2Morrios水迷宫定向航行实验结果

#:表示模型组与正常组比较p<0.05；*:表示给药组与模型组比较p<0.05(n＝15)。

表3Morrios水迷宫空间搜索实验结果

#:表示模型组与正常组比较p<0.05；*:表示给药组与模型组比较p<0.05(n＝15)。

表4跳台测试实验结果

#:表示模型组与正常组比较p<0.05；*:表示给药组与模型组比较p<0.05；(n＝15)

由表1可看出，采用本发明方法制备的改善记忆肽(凤尾鱼美拉德肽1-3)与采用常规方法水解得到的凤尾鱼蛋白肽(凤尾鱼蛋白肽1)相比，可显著提高经H₂O₂损伤的细胞的存活率。这主要是因为采用多酶协同水解凤尾鱼蛋白可释放出具有神经细胞保护作用的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等的氨基酸，而通过美拉德反应可获得抗氧化活性更强的糖肽，两者皆对PC12细胞具有较强的保护作用，从而有效改善氧化应激对PC12细胞的损伤作用。而且，通过检测发现，采用本发明方法得到的凤尾鱼美拉德肽对细胞的保护作用明显强于谷胱甘肽对细胞的保护作用率。

由表2可看出，正常小鼠经过5天的训练，寻找隐藏平台的时间(逃避潜伏期)越来越短，而模型小鼠的逃避潜伏期显著提高，且经过5天的训练，逃避潜伏期基本不变，说明模型小鼠的记忆功能受到损伤。喂食本发明制备的凤尾鱼美拉德肽(1-3)产品后，小鼠寻找隐藏平台的时间明显缩短，尤其是凤尾鱼美拉德肽2的结果接近于商业药物吡拉西坦片的逃避潜伏期结果；而喂食采用常规的水解法制备的凤尾鱼蛋白肽只在训练第五天才表现出逃避时间的显著性降低。

表3中显示，与模型组比较，凤尾鱼美拉德肽1-3组小鼠潜伏期显著降低，平台穿越次数明显增加；表4为小鼠跳台实验结果，小鼠经跳台训练24小时后，与模型组比较，凤尾鱼美拉德肽1-3使得小鼠潜伏期显著延长、错误次数明显减少。

以上动物实验结果表明本发明方法制备的凤尾鱼美拉德肽与普通方法制备的凤尾鱼蛋白肽相比，对小鼠由东莨菪碱致短期记忆获得障碍具有更好的改善作用，表明采用本发明制备的凤尾鱼美拉德肽具有改善记忆的功效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将凤尾鱼去头去内脏，清净后绞成肉糜；

（2）将肉糜与其质量1-3倍的水混合，加入蛋白酶在45-60℃下酶解，酶解6-10 h后，灭酶、离心，所得上清液为凤尾鱼酶解液；

（3）取凤尾鱼酶解液，按照其中蛋白含量的1.0-3.0%（w/w）添加还原糖，在90-110℃的条件下反应1-2 h 后取出冷却，得到凤尾鱼美拉德反应液；真空浓缩、喷雾干燥后得到凤尾鱼美拉德肽；

步骤（2）所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰酶或Alcalase 2.4L中的一种以上，以凤尾鱼肉糜的质量为计算基准，蛋白酶总添加量为0.5-1.0%。

2.根据权利要求1所述的具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的还原糖为葡萄糖、木糖或核糖中的一种。

3.根据权利要求1所述的具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的真空浓缩，是将凤尾鱼酶解液浓缩至固形物含量30-50%，然后进行减压浓缩。

4.一种凤尾鱼美拉德肽，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。

5.权利要求4所述的凤尾鱼美拉德肽在制备预防、治疗记忆退化的食品、保健品或药品中的应用。