CN106986915A - 一种加快多肽‑糖类体系美拉德反应进程的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种加快多肽‑糖类体系美拉德反应进程的方法，涉及美拉德反应领域。在草鱼肉水解多肽‑葡萄糖体系美拉德反应过程中，施加聚能式超声处理，加快分子运动、强化传质过程，克服了美拉德反应耗时长、温度高的缺点，具有在保证美拉德反应效果基础上加快反应进程、降低反应温度的优点。

Description

一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法

技术领域

本发明涉及美拉德反应领域，特别是一种利用聚能式超声加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法。

背景技术

美拉德反应又称为“非酶棕色化反应”，是法国化学家L.C.Maillard在1912年提出的。目前美拉德反应广泛存在于食品工业生产领域，由羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸、蛋白质）在一定温度下接枝结合，经过一系列复杂的反应最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质——类黑精，所以美拉德反应又称羰氨反应，整个反应过程不需要酶类参与就可逐步进行。

美拉德反应在食品领域很普遍。食品加工过程中美拉德反应，会造成氨基酸消耗、糖及蛋白质损失，致使食品营养价值下降，但该过程会赋予食品浓郁的香味和愉悦的色泽，同时研究表明美拉德反应生成的主要产物（类黑精、还原酮类及一系列含氮、硫的挥发性杂环化合物）具有良好的抗氧化性、抗突变、抗癌、抗衰老、抗菌性、溶解性和乳化性等功能特性（美拉德反应研究进展，李亚丽，2012），如何合理利用和改进美拉德反应值得研究。

目前，美拉德反应主要采用湿法反应，以蛋白、氨基酸、肽等含氨基化合物和葡萄糖、木糖等含羰基化合物进行反应，反应温度一般在90~130℃，反应时间从1 h到8 h不等。在食品加工过程中美拉德反应温度高、时间长，然而长时间的高温处理，不仅降低食品品质、破坏食品营养、消耗大量能源，也更容易产生大量具有神经毒性、遗传毒性和潜在致癌性的对人体有害的化合物，如丙烯酰胺等（丙烯酰胺与类黑精生成量的相关性及其体外代谢初探，王亚君，2009）。如何缩短反应时间、降低反应温度是改进美拉德反应的一个重要方向。

早在20世纪人们就发现超声波可用于催化化学反应，其加快化学反应并非靠声场与反应物的直接作用，而是通过超声过程中产生的空化作用及其引起的冲击波和微射流（超声波在催化过程中的应用，于凤文，2001）。空化作用是指原存在于液体中的气泡受到声场作用而振荡、生长、崩溃、闭合的过程，气泡崩溃瞬间可以在局部形成高温和高压，使局部原本缓慢的化学反应被瞬时催化而加快进程。气泡崩溃产生高温高压的同时也会带来强烈的冲击波和微射流，加快分子运动、强化传质过程，进而加快化学反应的进程。因此，利用超声波有助于加快反应进程、降低反应温度，有望弥补美拉德反应温度高、时间长的缺点。目前已有超声辅助美拉德反应的研究，主要集中于超声辅助蛋白质-糖类体系美拉德反应，用于蛋白质改性等研究，对提升美拉德反应产物的抗氧化能力效果显著（酪蛋白-葡聚糖接枝改性研究，刘娟，2008）。多肽参与的美拉德反应与蛋白质-糖类体系有很大的区别，多肽相比大分子蛋白反应活性更高，美拉德反应过程中能生成更多的类黑精物质，但是关于超声辅助多肽-糖类体系美拉德反应，用以降低反应温度和减少反应时间方面的研究目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服美拉德反应温度高、反应时间长的缺点，提供一种利用聚能式超声技术加快美拉德反应进程、降低反应温度的方法。

为了实现上述发明目的，技术方案如下：

聚能式超声设备，主要由聚能式超声探头、超声发生器、超声作用室、控制器等组成。超声探头是超声仪器与样品的接触界面，超声发生器产生超声，超声作用室是样品接受超声作用的场所，控制器控制超声发生器和超声作用室，其中控制器通过线缆分别与超声发生器和超声作用室连接，超声探头通过线缆与超声发生器连接。

一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，按照下述步骤进行：取烧杯加蒸馏水并调pH到6~8，90~100℃预热整个超声作用室和蒸馏水。升温到位后，将草鱼肉水解多肽和葡萄糖按7:1（质量比）加入各烧杯，迅速混匀后把烧杯放入超声作用室，将超声探头浸没于美拉德反应容器中，设置功率密度800~1200 W/L、超声频率28 kHz后开动超声发生器进行超声作用。美拉德反应进行60 min后取出烧杯，迅速冰浴降温以终止美拉德反应，取样以备测定。

草鱼肉水解多肽干燥粉末的制备方法，按照下述步骤进行：

将草鱼肉用绞肉机绞成鱼糜，取草鱼鱼糜按液固比4 mL/g用蒸馏水溶解，在50℃、pH7.0条件下按酶与底物（E/S）质量比1:100加入风味蛋白酶，酶解7.8 h，酶解物经沸水浴灭酶（100℃，10 min）和离心（4000 r/min，10 min）后得上清，将上清浓缩、冻干后即得草鱼肉水解多肽干燥粉末样品。

本发明的优点：

借助聚能式超声辅助美拉德反应，在相同反应效果下，加快反应速率、降低反应温度。相比不加超声作用120℃下反应60 min的反应体系，超声作用的反应体系类黑精浓度能提高4.79~14.85 mmol/L，反应速率提高24.16~74.89%，同时反应温度降低20~30℃。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本实施例和对照例所用草鱼购买自江苏省镇江市学府路欧尚超市。

本实施例和对照例所用鱼糜由草鱼肉经绞肉机绞肉制得。

本实施例和对照例所用风味蛋白酶购买自无锡市联合恒洲化工有限公司，酶活为500 LAPU/g。LAPU指每分钟水解1 mmol L-亮氨酸-对硝基苯胺所需的酶量。

本实施例和对照例所用葡萄糖购买自国药集团化学试剂有限公司。

本实施例和对照例所用的草鱼肉水解多肽干燥粉末由以下方法制备：

（1）按照25%的底物浓度（m/v）用蒸馏水配置鱼糜混浊液，放入50℃恒温水浴锅并调节pH到6.75。

（2）按酶底（E/S）质量比1:100加入风味蛋白酶，酶解7.8 h，用NaOH溶液维持反应体系pH维持在6.75。

（3）酶解结束，经沸水浴和离心获得上清液，将其浓缩、干燥后得草鱼肉水解多肽干燥粉末，置于干燥皿中保存备用。

其中干燥方式可以为冷冻干燥、喷雾干燥或其他合适的干燥方式。

本实施例聚能式超声作用方法如下：

本实施例所用聚能式超声设备购自温州博创轻工机械有限公司，型号BC-CS-1200。主要由聚能式超声探头、超声发生器、超声作用室、控制器等组成。细节操作参考说明书。

（1）取烧杯加蒸馏水并调pH到6~8，于90~100℃下预热，升温到位后加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖并迅速混匀，将烧杯置于超声作用室，使超声探头浸没于液面以下，设置功率密度800~1200 W/L后开动超声发生器进行超声作用。

（2）超声作用60 min后，迅速冰浴降温，终止美拉德反应，取样以备测定。

其中所述草鱼肉水解多肽可由其他多肽或肽类衍生物简单替代。

其中所述葡萄糖可由其他还原糖简单替代。

类黑精是美拉德反应终产物，类黑精浓度越高表明美拉德反应进行越彻底。本实施例和对照例类黑精检测方法如下：

（1）超声结束降温终止反应后取得的样品溶液经离心（4000 r/min，10 min）后，取上清液备测。

（2）每次测定样品稀释后取样0.2 mL加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。根据公式C=（A₄₂₀/ε×N）/100 计算类黑精浓度，其中N（这里N=18.5）为稀释倍数，ε取500 L·mol^-1·cm^-1，C为类黑精浓度，单位为mmol/L，所有样品以蒸馏水为空白，以不使用超声作用的草鱼肉水解物干燥粉末-葡萄糖溶液为对照进行实验。

对照1

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于120℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀并保持搅拌，120℃反应60 min。迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为19.83±1.33 mmol/L。

实施例1

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于90℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为400 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为24.62±2.07 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了4.79 mmol/L。

实施例2

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于95℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为400 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为28.26±1.41 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了8.43 mmol/L。

实施例3

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于100℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为400 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为31.33±1.27 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了11.50 mmol/L。

实施例4

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于90℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为600 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为26.38±1.39 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了6.55 mmol/L。

实施例5

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于95℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为600 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为30.45±1.68 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了10.62 mmol/L。

实施例6

取500 mL烧杯加入500 mL蒸馏水调pH到7.0，于100℃油浴中预热15 min后，加入14 g草鱼肉水解多肽干燥粉末和2 g葡萄糖，迅速混匀后放入超声作用室，使聚能式超声探头浸没液面，设定超声功率为600 W，超声作用60 min后，迅速冰浴降温到4℃，终止美拉德反应。取样离心后取上清0.2 mL，加入3.5 mL磷酸缓冲液（pH 8.5，1/15 mol/L），在420 nm处测定吸光值A₄₂₀。代入公式计算类黑精浓度。样品中类黑精的浓度为34.68±1.88 mmol/L，相比于对照1，类黑精浓度提高了14.85 mmol/L。

Claims (5)

1.一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，其特征在于按照下述步骤进行：取烧杯加蒸馏水并调pH到6~8，90~100℃预热整个超声作用室和蒸馏水；

升温到位后，将草鱼肉水解多肽和葡萄糖按7:1（质量比）加入各烧杯，迅速混匀后把烧杯放入超声作用室，将超声探头浸没于美拉德反应容器中，设置功率密度800~1200 W/L后开动超声发生器进行超声作用；

美拉德反应进行60 min后取出烧杯，迅速冰浴降温以终止美拉德反应，取样以备测定。

2.根据权利要求1所述的一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，其特征在于草鱼肉水解多肽干燥粉末的制备方法，按照下述步骤进行：

将草鱼肉用绞肉机绞成鱼糜，取草鱼鱼糜按液固比4 mL/g用蒸馏水溶解，在50℃、pH7.0条件下按酶与底物（E/S）质量比1:100加入风味蛋白酶，酶解7.8 h，酶解物经沸水浴灭酶（100℃，10 min）和离心后得上清，将上清浓缩、冻干后即得草鱼肉水解多肽干燥粉末样品。

3.根据权利要求1所述的一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，其特征在于超声频率为28 kHz。

4.根据权利要求2所述的一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，其特征在于离心条件为4000 r/min，10 min。

5.根据权利要求2所述的一种加快多肽-糖类体系美拉德反应进程的方法，其特征在于水浴灭酶条件为100℃，10 min。