CN107338278A - 超声联合模拟消化制备胶原凝胶抗氧化多肽液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了超声联合模拟消化制备胶原凝胶抗氧化多肽液的方法，属于食品加工技术和蛋白利用技术领域。采用的制备工艺以酶溶性胶原蛋白为原料，经溶解、透析、超声处理、水浴自组装成胶原凝胶，使用体外模拟胃肠消化技术，由含模拟胃蠕动频率和振幅、分泌腺分泌胃消化液的仿生动态鼠胃消化系统，以及之后的模拟肠消化，利用胃蛋白酶‑胰蛋白酶，两步酶解法。极大地提高了蛋白的酶解率，提高原料利用率。本发明使用动态模型模拟胃肠消化过程，在37℃环境下，更接近于人体模拟消化环境，过程更高效，相比人工合成抗氧化肽法、发酵法更安全可靠。

Description

超声联合模拟消化制备胶原凝胶抗氧化多肽液的方法
技术领域
本发明属于食品加工技术和蛋白利用技术领域，具体涉及利用超声预处理性成胶原凝胶结合仿生动态鼠胃消化系统和模拟肠消化制备抗氧化多肽液。
背景技术
胶原凝胶是胶原蛋白分子，在没有外力的作用下，通过非共价键的作用力在体外自发组织、聚集形成有序排列、结构稳定的超分子结构或者分子聚集体。胶原蛋白从分子结构，聚集逐渐形成纤维丝，再聚合形成胶原纤维和胶原纤维束，这一过程分三个阶段完成：成核阶段，成长阶段和平衡阶段。近年来，超声波在生物、化学等领域的研究很热门，超声波以其机械作用、空化作用等效应在各个领域都有很好的应用。超声波预处理会对胶原凝胶的自组装有明显的促进作用，形成的胶原凝胶质构软，更有利于酶解。目前，胶原凝胶广泛应用于食品中的肠衣、医药学中的敷料、胶囊外皮等，因此研究制备胶原凝胶的抗氧化多肽液具有非常重要的现实意义。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。抗氧化多肽主要包括天然形成的抗氧化多肽，如谷胱甘肽等；蛋白降解产生的抗氧化多肽，如酶解大豆蛋白的酶解产物；人工合成的抗氧化多肽等。其中酶解形成的抗氧化多肽符合人体的营养需求，易于工业化生产，且操作简单，高效。目前酶解蛋白产生多肽多采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等单一酶解方法。例如：中国专利CN106520877A中，利用新鲜猪脑为原料，利用碱性蛋白酶解提取猪脑蛋白抗氧化肽。此专利单一酶解方法易导致酶解不完全，形成的多肽分子量分布较复杂，因此带来分离纯化繁琐，成本较高等问题。
胃肠是人体消化食物的主要场所，胃通过蠕动把食物和胃分泌液混匀，使食物颗粒研磨变小，并且在胃中发生部分生物化学反应，之后进入肠在肠消化液的作用下大部分都消化掉从而使食物更有利于人体消化吸收。因此本发明先采用超声预处理技术，使胶原蛋白溶液形成胶原凝胶，再通过仿生动态鼠胃消化系统来进行模拟胃消化，之后加入模拟肠消化来制备胶原凝胶抗氧化多肽液。
发明内容
本发明以超声预处理(胶原蛋白溶液)形成的胶原凝胶为原料，利用仿生动态鼠胃消化系统来进行模拟胃消化，之后加入模拟肠消化来制备抗氧化多肽液。
超声处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，按照以下步骤进行：
(1)将胶原蛋白溶解于分散剂中得到一定浓度的溶液，透析48h，以除去溶液中盐离子小分子杂质等。透析结束后，溶液在20000×g的离心机中离心15min，取上清液。恒温条件下，采用超声波技术，对胶原蛋白溶液进行预处理，之后将形成的胶原分子单体在水浴的条件下自组装形成胶原凝胶。
(2)构建仿生动态鼠胃消化系统：模拟胃液配制，称取10.42g胃蛋白酶，0.02g碳酸氢钠，0.44g氯化钠，0.08g胃粘膜素(mucin)，搅拌溶解在蒸馏水中，50mL容量瓶定容，用1MHCl调整pH为1.63±0.01。实验中，注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85mL/h，灌注时间为4h。消化系统装置37℃预热10min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2mL样品进行模拟胃消化。
(3)模拟肠消化系统：模拟肠消化液(模拟肠消化液的配制：称取0.68g磷酸二氢钾，用1M氢氧化钠调节pH为6.8，用蒸馏水定容到100mL，加入1g胰蛋白酶。)使用前37℃加热10min。胃消化阶段结束后加入4mL模拟肠消化液，在水浴37℃下持续搅拌消化6h。
(4)上述消化液在100℃灭酶10min，5000×g离心10min除去大分子蛋白，所得上清液即为抗氧化肽液。
其中步骤(1)中溶解胶原蛋白所用的溶液为0.5M醋酸，配制成3mg/mL的胶原蛋白溶液。
其中步骤(1)中透析在4℃冰箱中进行，透析液为磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.4)，反复换透析液，直至测定透析后透析液pH保持7.4不变，并且透析液和0.01M AgNO3(1:1)反应无白色絮状沉淀，反应液保持澄清透明即透析结束。
其中步骤(1)中超声预处理条件为，用单频超声设备对前处理后的胶原溶液进行超声预处理，水浴30℃，超声频率60KHz，功率90W，作用5min，之后相同水浴条件下进行胶原蛋白自组装，最得到胶原凝胶，最后再进行真空冷冻干燥，得到胶原凝胶海绵体。
其中步骤(1)中胶原蛋白溶液的前处理在4℃条件下完成，以防止胶原蛋白变性，胶原凝胶的形成过程都在30℃下完成。
其中步骤(2)中样品液的制备为：将0.04g胶原凝胶固体溶解在2mL蒸馏水中。
其中步骤(4)中采用高温灭酶，再通过离心方法除去大分子蛋白和不溶解的杂质，得到抗氧化多肽液。
本发明的优势在于：
1)本发明采用超声预处理制备胶原凝胶，可以加速胶原蛋白的自组装进程，使形成的胶原凝胶更利于酶解消化。
2)本发明采用仿生动态鼠胃消化系统装置来进行模拟胃消化，过程中模拟鼠胃的蠕动，每分钟三个压缩循环，并且固定胃的压缩振幅，使消化更加彻底。
3)本发明采用仿生动态鼠胃消化系统装置来进行模拟胃消化，过程中在注射泵的作用下模拟分泌腺以一定分泌速度加入模拟胃液，胃消化结束后引入肠消化过程，两步酶解法，使得酶解液中的蛋白更少。
4)本发明模拟动物的消化系统，过程为动态模型消化，在食品安全方面，比其他的抗氧化多肽的生产，如发酵法和人工合成法所得到的产品更加安全合理。
附图说明
图1是抗氧化肽液的制备流程图。
图2是标准分子量蛋白和多肽对照品色谱图(A)；仿生动态鼠胃消化系统消化后酶解液的相对分子质量分布图(B)。
图3是仿生动态鼠胃模拟消化系统实物安装图，其中(1)马达；(2)频率控制；(3)轴；(4)角板；(5)弹簧；(6)压板；(7)体外仿生鼠胃；(8)支撑板。
图4是模拟鼠胃示意图。
具体实施方式
仿生动态鼠胃消化系统装置由实验室购买所得(图3)，结构为由一个软硅胶制成的鼠胃模型、保温盒、体外电动压缩装置和模拟胃液分泌装置四部分组成。模拟鼠胃(图4)的制作是在小鼠体内取出胃，将其内部翻到外面，然后用特定的石蜡浇筑模型，修复后切开并流出分泌胃液和排空食物的管口，之后用硅胶制作鼠胃模型。模拟鼠胃的尺寸为40×30×21mm，内部的最大储水体积为9mL，较薄的前胃厚度为0.65±0.11mm，腺胃厚度为1.22±0.15mm。十二指肠和食道于胃的连接处的咽和幽门装上单向阀，咽的单向阀使气体可以进入以确保消化过程胃中的气压是恒定的，幽门处的单向阀只能排空消化物，阻止其回流入胃中。
体外电动压缩装置由马达调节为接近真实鼠胃蠕动收缩频率即每分钟3个循环。通过调节角板的角度(弹簧的支点位置)和压缩板的螺丝位置，可以改变压缩板的初始位置和垂直移动高度即振幅，为保证固体颗粒有效破碎，振幅应设在4mm。
本发明对前处理好的胶原蛋白溶液进行超声预处理，水浴条件下自组装形成胶原凝胶。利用体外模拟胃肠消化制备抗氧化多肽液，以过程中游离氨基的含量变化来监测抗氧化肽的形成进程，利用高效液相色谱法测定仿生动态鼠胃结束后消化液的相对分子量分布。实施流程图如图1所示。
(1)可溶性氨基含量测定
消化过程中每0.5h取适量的消化液，100℃水浴10min进行灭酶处理，5000×g离心10min除去大分子蛋白。取125μL消化液离心上清液与磷酸缓冲液(pH8.2)和2,4,6-三硝基苯磺酸溶液震荡混合均匀，50℃水浴避光反应30min，用亚硫酸钠溶液终止反应，室温下放置15min后，可见光分光光度计法在420nm波长下测定吸光值，相同试验方法用L-亮氨酸测定自由氨基含量，以此绘制标准曲线(y＝14.429x+0.0062，相关系数R2＝0.9925)，空白组用蒸馏水代替酶解液测定。
(2)多肽分子量分布
安捷伦1260色谱仪，色谱柱：TSKgel-G2000SWXL(300mm×7.8mm，Tosoh)；流动相：超纯水配制0.1mol/L Na2SO4+0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.7)混合均匀，超声脱气；试验柱温30℃；紫外检测器波长：220nm；检测流速：0.5mL/min；样品用流动相稀释合适倍数0.22μL水膜过滤才能上样，进样量为10μL。
实例1：
称取0.04g酶溶性胶原蛋白(胶原蛋白由实验室制备所得，鸡爪皮在4℃条件下，利用20％(w/v)NaCl(0.05mol/L Tris-HCl,pH7.5)的溶液除去杂蛋白、脂肪以及色素等杂质。预处理后的鸡爪皮用含0.1％(w/v)胃蛋白酶(2500U/mg)的预冷的0.5M乙酸提取，离心，上清液盐析所得沉淀真空冷冻干燥即为酶溶性胶原蛋白。)，用0.5M醋酸，配制成0.02g/mL的胶原蛋白溶液，4℃冰箱磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.4)透析。透析结束后，溶液离心20000×g离心15min，取上清液。30℃水浴，用单频超声设备270W/60kHz超声5min，30℃水浴加热55min，形成胶原分子单体自组装形成胶原凝胶。真空冷冻干燥得到胶原凝胶海绵体，以待下一步使用。
试验中用蒸馏水配制2mL 0.04g/mL的胶原凝胶溶液进行体外模拟胃肠消化。仿生动态鼠胃消化系统设置体外电动压缩装置由马达调节为接近真实鼠胃蠕动收缩频率即每分钟3个循环,振幅设在3mm，在37℃下，注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85mL/h，灌注时间为4h。消化系统装置37℃预热10min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2mL样品进行模拟胃消化4h。取出混合物，不用灭酶，加入37℃预热10min的模拟肠消化液，在37℃恒温水浴锅中，搅拌，消化6h，定时定量取样检测消化过程。消化结束后可得到超声预处理的胶原凝胶的模拟胃肠消化抗氧化肽液。测定消化过程的游离氨基含量，测定得模拟胃消化结束游离氨基含量为0.078mmol/L，肠消化结束后含量为0.0143mmol/L。相对分子质量在200-5000Da的占84.56％。
实例2：
称取0.04g酶溶性胶原蛋白(实验室自制，同实施例1)，用0.5M醋酸，配制成0.02g/mL的胶原蛋白溶液，4℃冰箱磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.4)透析。透析结束后，溶液离心20000×g离心15min，取上清液。30℃水浴，用单频超声设备270W/60kHz超声5min，30℃水浴加热55min，形成胶原分子单体自组装形成胶原凝胶。真空冷冻干燥得到胶原凝胶海绵体，以待下一步使用。
试验中用蒸馏水配制2mL 0.02g/mL的胶原凝胶溶液进行体外模拟胃肠消化。仿生动态鼠胃消化系统设置体外电动压缩装置由马达调节为接近真实鼠胃蠕动收缩频率即每分钟3个循环,振幅设在4mm，在37℃下，注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85mL/h，灌注时间为4h。消化系统装置37℃预热10min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2mL样品进行模拟胃消化4h。取出混合物，不用灭酶，加入37℃预热10min的模拟肠消化液，在37℃恒温水浴锅中，搅拌，消化6h，定时定量取样检测消化过程。消化结束后可得到超声预处理的胶原凝胶的模拟胃肠消化抗氧化肽液。测定消化过程的游离氨基含量，测定得模拟胃消化结束游离氨基含量为0.0069mmol/L，肠消化结束后含量为0.0093mmol/L。分子量分布如图2，相对分子质量在200-5000Da的占87.48％。

Claims (9)

1.超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
（1）将胶原蛋白溶解于分散剂中得到一定浓度的溶液，透析48 h，以除去溶液中盐离子等小分子杂质；透析结束后，溶液离心取上清液；水浴条件下，采用超声波技术对胶原蛋白溶液进行预处理，之后胶原蛋白溶液在相同的水浴的条件下自组装形成胶原凝胶；
（2）构建仿生动态鼠胃消化系统：实验中注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85 mL/h，灌注时间为4 h；消化系统装置37℃预热10 min后，装样前鼠胃模型里先加入0.6 mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2 mL样品进行模拟胃消化；
（3）模拟肠消化系统：模拟肠消化液使用前37℃加热10 min；胃消化阶段结束后加入4mL模拟肠消化液，在水浴37℃下持续搅拌消化6 h；
（4）上述消化液在100℃灭酶10 min，5000×g离心10 min除去大分子蛋白，所得上清液即为抗氧化肽液。
2.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（1）溶解胶原蛋白所用溶液为0.5 M醋酸，配制成3mg/mL的胶原蛋白溶液；醋酸起到溶解胶原蛋白和分散胶原纤维的作用，使其尽可能成为胶原分子单体的状态，有利于之后胶原蛋白分子单体自组装成胶原纤维。
3.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（1）透析在4℃冰箱中进行，透析液为磷酸盐缓冲液（200 mM，pH7.4），反复换透析液，直至测定透析后透析液pH保持7.4不变，并且透析液和0.01 M AgNO3（1:1）反应无白色絮状沉淀，反应液保持澄清透明即透析结束；透析结束后的胶原蛋白溶液进行离心，离心条件为20000×g离心15 min，取得上清液。
4.根据权利要求1超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（1）超声预处理条件为，用单频超声设备对前处理后的胶原溶液进行超声预处理，水浴30℃，超声频率60KHz，功率90W，作用5min，之后相同水浴条件下进行胶原蛋白自组装，最得到胶原凝胶，最后再进行真空冷冻干燥，得到胶原凝胶海绵体。
5.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（1）中胶原蛋白溶液的前处理在4℃条件下完成，以防止胶原蛋白变性，胶原凝胶的形成过程都在30℃下完成。
6.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（2）中样品液的制备为0.04 g胶原凝胶固体溶解在2 mL蒸馏水中。
7.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（2）中模拟胃消化液的配制为称取10.42 g胃蛋白酶，0.02 g碳酸氢钠，0.44 g氯化钠，0.08 g胃粘膜素（mucin），搅拌溶解在蒸馏水中，50 mL容量瓶定容，用1M HCl调整pH为1.63±0.01。
8.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（3）中模拟肠消化液的配制为称取0.68 g磷酸二氢钾，用1 M 氢氧化钠调节pH为6.8，用蒸馏水定容到100 mL，加入1 g胰蛋白酶。
9.根据权利要求1所描述的超声预处理形成胶原凝胶的仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于步骤（4）采用高温灭酶，再通过离心方式除去大分子蛋白和不溶解的杂质，得到抗氧化多肽液。
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