CN115466322A - 一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质加工工程技术领域,尤其是涉及一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用,其中,一种自组装胶原蛋白的制备方法,包括以下步骤:使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理,得到酶解消化液;将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析,得到纯化后的胶原蛋白溶液;将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌,得到灭菌型胶原蛋白溶液;将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装,得到自组装胶原蛋白;优选地,所述热冲击自组装时,在1min内将自组装体系加热至35‑37℃,保温30‑60s后降至室温。本发明通过有效地调控胶原蛋白自组装过程参数,获得了具有理想流变学参数的胶原蛋白产品。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质加工工程技术领域,尤其是涉及一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是生命体内含量最丰富的蛋白质之一,其广泛存在于动物皮肤、骨骼和跟腱等组织中。由于天然胶原蛋白具有优异的生物相容性、良好的生物降解性以及低免疫原性,因而在食品科学、医学美容、生物材料等领域得到广泛使用。
分子自组装是指分子在一定平衡条件下,通过非共价键的作用自发形成一种稳定的、精确的超分子聚集体或超分子结构的过程,是天然胶原蛋白的最重要分子行为特征之一。在体内,胶原蛋白首先通过分子间疏水作用、氢键、离子键等相互作用形成微纤维,微纤维再进一步聚集成胶原纤维,从而为皮肤、跟腱、瓣膜等组织提供强大的生物力学性能。在体外,具有三螺旋结构的胶原蛋白在理想的浓度、温度、pH等条件下也能自组装形成胶原纤维或胶原凝胶,且经过自组装所形成的产物在机械性能、热稳定性和生物学性能都有显著提升。因此,自组装胶原蛋白在食品工业、生物医药材料以及化妆品等领域有着广泛的应用。然而,因其应用领域的不同,对其性能也提出了差异化的需求。在此背景下,实现胶原自组装分子行为调控并进而调节自组装产物性能也成为本技术亟需解决的一项技术问题。
胶原蛋白填充剂虽已经上市多年,但是目前产品的控制参数主要体现在胶原蛋白的浓度上,常见的规格也仅有20、35和65mg/ml。然而,胶原蛋白填充剂在使用过程中,其他参数也会极大的影响产品的使用体验和使用效果,比如产品的动力黏度,产品的黏弹性等。而这些参数,并不是只受胶原蛋白的浓度影响,与胶原蛋白的存在状态,也就是胶原蛋白的自组装结果密切相关,例如胶原蛋白纤维的直径、长度和密度。而胶原蛋白纤维的性质对温度、磷酸根离子浓度、离子强度和胶原分子的结构特征等聚合反应条件高度敏感。
目前,关于自组装胶原蛋白以及胶原蛋白制剂均未形成常规标准化,缺乏对胶原蛋白自组装过程的精细调控,所获得的胶原蛋白存在收率波动大,性质差异显著的问题;并且,对于胶原蛋白填充剂等可植入生物材料,也未将胶原蛋白的聚合物和胶原纤维自组装特性作为其设计特征和治疗策略的一部分。
鉴于此,本发明对胶原蛋白自组装过程中控制工艺进行了改进,提出了一种新型的控制去端肽胶原蛋白自组装的方法以及通过自组装生产医美胶原蛋白填充剂的方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种自组装胶原蛋白及其制备方法,通过对胶原蛋白自组装过程的精细调控,获得了收率稳定、均一化的自组装胶原蛋白;
本发明的第二目的在于提供一种胶原蛋白填充剂,通过有效地调控胶原蛋白自组装过程参数,获得了具有理想流变学参数的胶原蛋白产品。
本发明提供一种自组装胶原蛋白的制备方法,包括以下步骤:
S1、使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理,得到酶解消化液;
S2、将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析,得到纯化后的胶原蛋白溶液;
S3、将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌,得到灭菌型胶原蛋白溶液;
S4、将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装,得到自组装胶原蛋白;
优选地,所述热冲击自组装时,控制自组装体系中胶原蛋白的浓度为2.0-2.2mg/mL,离子强度为0.1-0.3mol/L,pH值为7.0-8.0,并在1min内将自组装体系加热至35-37℃,保温30-60s后降至室温。
在本发明胶原蛋白的自组装方法中,首先,使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理,以获得去端肽的胶原蛋白,有效保持了胶原的结构和生物活性;然后,采用对酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析的纯化方法,在不同体系下有效彻底地去除了酶解消化液中的杂蛋白,提高了胶原蛋白的纯度,保留了胶原蛋白良好的生物相容性,为胶原蛋白的自组装奠定了必要的浓度、纯度基础;最后,使用热冲击自组装方法对胶原蛋白自组装过程进行精细调控,通过短时控温加速了胶原蛋白自组装速度和程度,该方法所制得的胶原蛋白收率稳定、性质均一。
作为本技术方案优选地,步骤S1之前还包括预处理,所述预处理包括依次对牛皮进行酸浸、破碎和匀浆,其中,所述酸浸时,使用质量浓度为1-10%的醋酸溶液对清洗、清理后的牛皮进行浸泡,并控制浸泡的温度为4-25℃,时间为5-10d,浸泡完成后,将牛皮搅碎成牛皮颗粒;所述匀浆时,向破碎后的牛皮颗粒中加入注射用水进行匀浆,匀浆后使用醋酸调节pH至2-3,得到组织匀浆液;优选地,牛皮颗粒与注射用水的比例为1kg:(2-10)L。
作为本技术方案优选地,步骤S1中,所述消化处理具体包括:向所述组织匀浆液中加入胃蛋白酶溶液进行消化,消化处理后进行灭酶,得到匀浆消化液;优选地,胃蛋白酶溶液采用0.4-0.6M的醋酸作为溶剂,且胃蛋白酶溶液的酶活为1000-9000IU/ml;优选地,胃蛋白酶溶液与组织匀浆液的体积比为(0.8-1.2):100;优选地,所述消化时,控制温度为4-25℃,时间为7-10d;优选地,所述灭酶时,使用8-12M的氢氧化钠溶液将消化处理后的组织匀浆液的pH调至9-10,静置过夜,灭酶,得到匀浆消化液。
本发明使用胃蛋白酶对牛皮的组织匀浆液进行消化处理,可有效去除胶原分子端肽区域肽链序列,得到去端肽的胶原蛋白,以保持胶原的结构和生物活性。研究表明,本发明通过胃蛋白酶制备去端肽胶原蛋白的方法,所制得去端肽胶原蛋白的纯度可达99.9%,有效去除了天然胶原蛋白的免疫原性。
作为本技术方案优选地,步骤S2中,本发明首先使用硅藻土对匀浆消化液进行吸附处理,以去除未被酶解的牛皮颗粒,降低后续纯化的负担,而所述硅藻土吸附过滤过程具体包括:将匀浆消化液按1:1的比例加入注射用水,使用盐酸调节pH至4,充分搅拌后,加入预处理后的硅藻土进行静置吸附1-3h,收集上清液并使用板框过滤机进行过滤,得到吸附过滤液;优选地,每1L匀浆消化液需加入硅藻土的量为13-17g;优选地,所述硅藻土的预处理方法为:将硅藻土使用8-12mM的盐酸溶液浸泡2h以上,浸泡后采用注射用水清洗3次以上;
在硅藻土吸附过滤后,使用分子截留量为100-200kD的超滤膜,在醋酸钠体系下去除体系中的杂蛋白,并对胶原蛋白溶液进行浓缩,而一次超滤透析的过程具体包括:使用分子截留量为100-200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积的醋酸钠溶液,反复重复3次;优选地,所述醋酸钠溶液的浓度为20-40mM;
一次超滤透析后进一步使用GPCM-30弱阳离子交换介质进行纯化,所述离子交换层析包括:使用弱阳离子交换树脂作为层析柱,采用浓度为20-40mM、pH值为4-5的醋酸钠缓冲液冲洗平衡,上样后使用含有10-300mM氯化钠的20-40mM醋酸钠缓冲液进行蛋白洗脱,收集洗脱液,得到层析液;
最后,将醋酸钠更换为稀盐酸对体系进行二次超滤透析,进一步去除酸体系溶解的杂蛋白,而二次超滤透析具体包括:使用分子截留量为100-200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积的稀盐酸溶液,待胶原蛋白的浓度达到2mg/mL时,停止透析;优选地,所述稀盐酸溶液的浓度为10-30mM。
作为本技术方案优选地,步骤S3中,所述过滤灭菌时,使用经过灭菌处理的0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌。
作为本技术方案优选地,步骤S4中,所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装之前,使用稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.0-2.2mg/mL,并在室温下加入Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度和pH值;优选地,Na3PO4缓冲液与胶原蛋白溶液的体积比为1:(10-50);优选地,Na3PO4缓冲液的pH值为10-12。
作为本技术方案优选地,步骤S4中,所述热冲击自组装完成后,进行多次离心和洗涤,得到自组装胶原蛋白;优选地,所述离心时,控制转速为2000-6000rpm/min,时间为20-60min;优选地,所述洗涤时,使用无菌生理盐水对离心得到的胶原蛋白沉淀进行离心洗涤。
作为本技术方案优选地,步骤S4中,所述热冲击自组装所使用的热冲击系统包括依次收尾连接的胶原蛋白溶液储罐、蠕动泵、控温加热管、保温器、冷却器和胶原蛋白溶液接收罐。
在调整好胶原蛋白溶液的pH和离子强度后使用热冲击系统进一步调节胶原蛋白的自组装过程,首先,胶原蛋白溶液储罐中的胶原蛋白溶液通过蠕动泵打入控温加热管使其温度在1min内加热到35℃-37℃,然后进入保温器中,在此温度下保持30-60S,然后通过冷却器降温至室温,为加快冷却速度,通过冷媒加速冷却过程,最后通过热冲击的胶原蛋白溶液(悬浮液)进入胶原蛋白溶液接收罐中,完成热冲击自组装过程。本发明使用特定的热冲击系统,通过短时控温的方式控制胶原蛋白的自组装,不仅实现了胶原蛋白自组装的可控性,而且避免了微生物细菌对体外自组装过程的影响,确保了产品无菌和内毒素含量不超标。
上述方法制备得到的自组装胶原蛋白也理应属于本发明的保护范围,并且优选地,上述方法所制得自组装胶原蛋白的自组装程度为60%-75%。
本发明还提供了一种胶原蛋白填充剂,具体由上述自组装胶原蛋白经均质化处理得到,并且,所述自组装胶原蛋白均质化处理之前使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度至10-70mg/mL;
优选地,所述均质化处理所使用的均质系统包括均质前储袋、筛网和均质后储袋,其中,所述均质前储袋和所述筛网之间、所述均质后储袋和所述筛网之间均分别设置有正向流通管道和反向流通管道,所述正向流通管道上均依次设置有蠕动泵和截止阀,所述反向流通管道上均设置有截止阀;优选地,所述筛网的孔径为0.1-0.4mm;优选地,所述胶原蛋白填充剂的动力黏度为10-200Pa·s,弹性模量为100-3000Pa。
在胶原蛋白填充剂的制备过程中,首先,根据需要使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度,再使用胶原蛋白均质系统对胶原蛋白悬浮液进行均质化:调整浓度后的胶原蛋白悬浮液首先置于均质前储袋中,打开正向流通管道上的截止阀,关闭反向流通管道上的截止阀,通过蠕动泵将胶原蛋白悬浮液通过安装有孔径为0.1-0.4mm的筛网,实现对胶原蛋白的均质化,同时滤过自组装失控的胶原蛋白纤维团。待均质前储袋中的胶原蛋白悬浮液全部进入均质后储袋后,关闭正向流通管道上的截止阀,打开反向流通管道上的截止阀,通过蠕动泵将均质后储袋后中的胶原蛋白悬浮液通过筛网同向打回均质前储袋,重复上述操作10-15次,对胶原蛋白进行均质调整胶原蛋白的流变学参数,待胶原蛋白悬浮液全部进入均质后储袋停止均质操作。使用该均质系统对胶原蛋白悬浮液进行均质,相较于现有技术,可使得体系中的胶原团重新分散,不仅为胶原蛋白填充剂提供了稳定的推注力,避免了堵针问题,而且避免了胶原蛋白原料的浪费。
本发明的自组装胶原蛋白及其制备方法和应用,至少具有以下技术效果:
1、本发明采用对酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析的纯化方法,在不同体系下有效去除了酶解消化液中的杂蛋白,提高了胶原蛋白的纯度,保留了胶原蛋白良好的生物相容性,为胶原蛋白的自组装奠定了必要的浓度、纯度基础;
2、本发明使用热冲击系统,通过短时控温加速了胶原蛋白自组装速度和程度,短时间热冲击的工艺对生产的无菌保持影响不大,确保了产品无菌和内毒素含量不超标;
3、本发明通过对自组装过程的控制,在特定胶原蛋白浓度及筛网均质的条件下,可以获得流变学参数不同的胶原蛋白产品,满足了营养水光、紧致抗衰和长效填充等不同用途胶原蛋白产品的使用需求,提高了产品使用体验和使用效果;
4、本发明通过对胶原蛋白自组装过程的精细调控,解决了现有技术中胶原蛋白收率波动大、性质差异显著的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明热冲击系统的结构示意图;
图2为本发明均质系统的结构示意图。
附图标记
1:胶原蛋白溶液储罐;2:蠕动泵;3:控温加热管;4:保温器;5:冷却器;6:胶原蛋白溶液接收罐;7:均质前储袋;8:筛网;9:均质后储袋;10:正向流通管道;11:反向流通管道;12:截止阀。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、制备去端肽胶原蛋白
1、预处理
牛皮进行清洗及清理,随后采用10wt%的醋酸溶液在20±1℃的条件下浸泡7天,将浸泡后的牛皮搅碎成牛皮颗粒;取牛真皮颗粒,按1kg牛真皮颗粒:8L注射用水的比例浸泡解冻,搅散,加冰醋酸调pH在2.0-3.0之间,制成组织匀浆液;
2、消化灭酶
使用0.5M醋酸溶液配制酶活约3000IU/ml的胃蛋白酶溶液,然后将胃蛋白酶溶液按1:100的比例加入组织匀浆液中,混匀,室温消化7天。消化后,采用10M的氢氧化钠溶液调节pH值至9.0-10.0之间,静置过夜灭酶,得到匀浆消化液;
3、纯化
3.1硅藻土吸附过滤
将匀浆消化液按1:1比例加入注射水,使用5mol/LHCl调节pH至4.0,30min/次搅拌,持续2h,硅藻土用10mMHCl浸泡3h,使用注射用水清洗3次以上,按照15g/L比例,将硅藻土加入上述溶液静置沉淀3h,收集上清液并使用板框过滤机进行过滤,得到吸附过滤液,取样,检测蛋白质含量;
3.2一次超滤透析
使用分子截留量为200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积浓度为20mM的醋酸钠溶液,反复重复3次,得到超滤透析液Ⅰ,检测胶原蛋白含量;
3.3离子交换层析
使用GPCM-30弱阳离子交换树脂作为层析柱,采用浓度为20mM、pH值为4.6的醋酸钠缓冲液冲洗平衡,上样后使用含有200mM氯化钠的20mM醋酸钠缓冲液进行蛋白洗脱,收集洗脱液,得到层析液;
3.4二次超滤透析
使用分子截留量为100kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积10mM的稀盐酸溶液,待胶原蛋白的浓度达到2mg/mL时,停止透析,得到超滤透析液Ⅱ
4、过滤灭菌
使用经过灭菌处理的0.22um的减菌过滤器对超滤透析液Ⅱ进行过滤,得到灭菌型胶原蛋白溶液;
5、热冲击自组装
在灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装之前,首先,使用10mM的稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.0mg/mL,并在室温下,按10(无菌液):1(缓冲液)的体积比例加入0.2M的Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度为0.2和pH值为7.20;
将调整后的胶原蛋白溶液通过热冲击系统,控制流速使其温度在1min内加热到37℃,进入保温器,在此温度下保持30S,然后通过冷却器降温至室温,通过热冲击加速胶原蛋白的自组装速度和程度。
热冲击自组装完成后,将自组装完成后的胶原蛋白溶液在4000rpm下离心30min,收取离心后胶原蛋白沉淀,然后使用无菌生理盐水对沉淀进行离心洗涤,洗涤两次,测定自组装胶原蛋白收率。
二、制备胶原蛋白填充剂
测定胶原蛋白沉淀的浓度后,使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度为35mg/ml,在均质系统中,安装孔径为0.1mm的筛网对胶原蛋白自组装纤维进行均质化,反复滤过15次后,得到胶原蛋白填充剂;
使用流变仪,在25℃下测定所制备得到胶原蛋白填充剂的动力黏度、弹性模量,报告1Hz下的数据;同时使用注射器推注力测试仪测定推注力。
实施例2
一、制备去端肽胶原蛋白
1、预处理
牛皮进行清洗及清理,随后采用10wt%的醋酸溶液在20±1℃的条件下浸泡7天,将浸泡后的牛皮搅碎成牛皮颗粒;取牛真皮颗粒,按1kg牛真皮颗粒:8L注射用水的比例浸泡解冻,搅散,加冰醋酸调pH在2.0-3.0之间,制成组织匀浆液;
3、消化灭酶
使用0.5M醋酸溶液配制酶活约3000IU/ml的胃蛋白酶溶液,然后将胃蛋白酶溶液按1:100的比例加入组织匀浆液中,混匀,室温消化7天。消化后,采用10M的氢氧化钠溶液调节pH值至9.0-10.0之间,静置过夜灭酶,得到匀浆消化液;
3、纯化
3.1硅藻土吸附过滤
将匀浆消化液按1:1比例加入注射水,使用5mol/LHCl调节pH至4.0,30min/次搅拌,持续2h,硅藻土用10mMHCl浸泡3h,使用注射用水清洗3次以上,按照15g/L比例,将硅藻土加入上述溶液静置沉淀3h,收集上清液并使用板框过滤机进行过滤,得到吸附过滤液,取样,检测蛋白质含量;
3.2一次超滤透析
使用分子截留量为200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积浓度为20mM的醋酸钠溶液,反复重复3次,得到超滤透析液Ⅰ,检测胶原蛋白含量;
3.3离子交换层析
使用GPCM-30弱阳离子交换树脂作为层析柱,采用浓度为20mM、pH值为4.6的醋酸钠缓冲液冲洗平衡,上样后使用含有200mM氯化钠的20mM醋酸钠缓冲液进行蛋白洗脱,收集洗脱液,得到层析液;
3.4二次超滤透析
使用分子截留量为100kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积10mM的稀盐酸溶液,待胶原蛋白的浓度达到2mg/mL时,停止透析,得到超滤透析液Ⅱ
4、过滤灭菌
使用经过灭菌处理的0.22um的减菌过滤器对超滤透析液Ⅱ进行过滤,得到灭菌型胶原蛋白溶液;
6、热冲击自组装
在灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装之前,首先,使用10mM的稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.1mg/mL,并在室温下,按10(无菌液):1(缓冲液)的体积比例加入0.2M的Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度为0.2和pH值为7.20;
将调整后的胶原蛋白溶液通过热冲击系统,控制流速使其温度在1min内加热到36℃,进入保温器,在此温度下保持40S,然后通过冷却器降温至室温,通过热冲击加速胶原蛋白的自组装速度和程度。
热冲击自组装完成后,将自组装完成后的胶原蛋白溶液在4000rpm下离心30min,收取离心后胶原蛋白沉淀,然后使用无菌生理盐水对沉淀进行离心洗涤,洗涤两次,测定自组装胶原蛋白收率。
二、制备胶原蛋白填充剂
测定胶原蛋白沉淀的浓度后,使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度为65mg/ml,在均质系统中,安装孔径为0.4mm的筛网对胶原蛋白自组装纤维进行均质化,反复滤过10次后,得到胶原蛋白填充剂;
使用流变仪,在25℃下测定所制备得到胶原蛋白填充剂的动力黏度、弹性模量,报告1Hz下的数据;同时使用注射器推注力测试仪测定推注力。
实施例3
一、制备去端肽胶原蛋白
1、预处理
牛皮进行清洗及清理,随后采用5wt%的醋酸溶液在20±1℃的条件下浸泡7天,将浸泡后的牛皮搅碎成牛皮颗粒;取牛真皮颗粒,按1kg牛真皮颗粒:5L注射用水的比例浸泡解冻,搅散,加冰醋酸调pH在2.0-3.0之间,制成组织匀浆液;
4、消化灭酶
使用0.5M醋酸溶液配制酶活约5000IU/ml的胃蛋白酶溶液,然后将胃蛋白酶溶液按1.2:100的比例加入组织匀浆液中,混匀,室温消化7天。消化后,采用10M的氢氧化钠溶液调节pH值至9.0-10.0之间,静置过夜灭酶,得到匀浆消化液;
3、纯化
3.1硅藻土吸附过滤
将匀浆消化液按1:1比例加入注射水,使用5mol/LHCl调节pH至4.0,30min/次搅拌,持续2h,硅藻土用10mMHCl浸泡3h,使用注射用水清洗3次以上,按照15g/L比例,将硅藻土加入上述溶液静置沉淀3h,收集上清液并使用板框过滤机进行过滤,得到吸附过滤液,取样,检测蛋白质含量;
3.2一次超滤透析
使用分子截留量为200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积浓度为40mM的醋酸钠溶液,反复重复3次,得到超滤透析液Ⅰ,检测胶原蛋白含量;
3.3离子交换层析
使用GPCM-30弱阳离子交换树脂作为层析柱,采用浓度为40mM、pH值为4.6的醋酸钠缓冲液冲洗平衡,上样后使用含有200mM氯化钠的40mM醋酸钠缓冲液进行蛋白洗脱,收集洗脱液,得到层析液;
3.4二次超滤透析
使用分子截留量为100kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积20mM的稀盐酸溶液,待胶原蛋白的浓度达到2mg/mL时,停止透析,得到超滤透析液Ⅱ
4、过滤灭菌
使用经过灭菌处理的0.22um的减菌过滤器对超滤透析液Ⅱ进行过滤,得到灭菌型胶原蛋白溶液;
7、热冲击自组装
在灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装之前,首先,使用20mM的稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.0mg/mL,并在室温下,按10(无菌液):1(缓冲液)的体积比例加入0.2M的Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度为0.2和pH值为7.20;
将调整后的胶原蛋白溶液通过热冲击系统,控制流速使其温度在1min内加热到35℃,进入保温器,在此温度下保持60S,然后通过冷却器降温至室温,通过热冲击加速胶原蛋白的自组装速度和程度。
热冲击自组装完成后,将自组装完成后的胶原蛋白溶液在4000rpm下离心30min,收取离心后胶原蛋白沉淀,然后使用无菌生理盐水对沉淀进行离心洗涤,洗涤两次,测定自组装胶原蛋白收率。
二、制备胶原蛋白填充剂
测定胶原蛋白沉淀的浓度后,使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度为40mg/ml,在均质系统中,安装孔径为0.4mm的筛网对胶原蛋白自组装纤维进行均质化,反复滤过15次后,得到胶原蛋白填充剂;
使用流变仪,在25℃下测定所制备得到胶原蛋白填充剂的动力黏度、弹性模量,报告1Hz下的数据;同时使用注射器推注力测试仪测定推注力。
对照例1
一、常规制备去端肽自组装胶原蛋白
在自组装时,将过滤灭菌后的胶原蛋白溶液,首先,使用20mM的稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.0mg/mL,并在室温下,按10(无菌液):1(缓冲液)的体积比例加入0.2M的Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度为0.2和pH值为7.20;静置后在4000rpm下离心30min,收取离心后胶原蛋白沉淀,然后使用无菌生理盐水对沉淀进行离心洗涤,洗涤两次,测定自组装胶原蛋白收率。
其他步骤及工艺参数同实施例1。
对照例2
常规透析法制备去端肽胶原蛋白
在自组装时,将过滤灭菌后的胶原蛋白溶液,配制成2mg/mL的盐酸溶液,4℃条件透析袋透析,浓度为50mM、pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液为透析外液,得到自组装胶原蛋白。
自组装完成后,将自组装完成后的胶原蛋白溶液在4000rpm下离心30min,收取离心后胶原蛋白沉淀,然后使用无菌生理盐水对沉淀进行离心洗涤,洗涤两次,测定自组装胶原蛋白收率。
其他步骤及工艺参数同实施例1。
对照例3
常规均质法制备胶原蛋白填充剂
测定胶原蛋白沉淀的浓度后,使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度为35mg/ml,将其置于袋中,并于振荡器中振荡摇晃,得到胶原蛋白填充剂;
使用流变仪,在25℃下测定所制备得到胶原蛋白填充剂的动力黏度、弹性模量,报告1Hz下的数据;同时使用注射器推注力测试仪测定推注力。
其他步骤及工艺参数同实施例1。
为研究本发明胶原蛋白自组装效果及所制得胶原蛋白填充剂的流变学参数,对纯化过程中各阶段的纯化效果、自组装胶原蛋白的收率和胶原蛋白填充剂流变学参数进行了分析。
其中,自组装胶原蛋白收率的检测方法如下:
将组装好的胶原蛋白溶液在10000rpm、15min和4℃条件下离心,取出离心后的胶原蛋白上清液。分别向比色管量取5ml胶原蛋白上清液,每个样品重复三次。向每一个比色管中加入15mL浓盐酸后置入烘箱,在105℃条件下水解24h。待水解完毕,然后取出后,冷却至室温,再用氢氧化钠溶液慢慢调节至中性,最后用蒸馏水定容到50mL的容量瓶中。
用移液枪准确吸取4mL处理好的样品溶液放于比色管中,再另取4mL的蒸馏水置于比色管中为空白管作为对照,向比色管中分别加入2mL0.05M的氯胺-T,在室温条件下氧化20min后,再分别加入2mL对二甲氨基苯甲醛显色试剂,立刻混匀,在60℃水浴中保温20min,立刻置入冰水中冷却1min,在室温放置5min后,用可见分光光度计在560nm处分别测样品的吸光度。胶原自组装程度的计算公式如下:
自组装胶原蛋白收率=(1-b/a)×100%
式中:a为组装前样品中的羟脯氨酸总量;b为组装后样品上清液中的羟脯氨酸总量。
表1实施例1-3纯化效果数据
由表1可知,本发明采用对酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析的纯化方法,在不同体系下有效去除了酶解消化液中的杂蛋白,提高了胶原蛋白的纯度,为胶原蛋白的自组装奠定了基础。
表2实施例1-3及对照例1-2自组装胶原蛋白收率
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照例1 | 对照例2 | |
收率% | 67.6 | 72.3 | 75.0 | 42.5% | 35.5% |
由表2可知,本发明实施例1-3所制得自组装胶原蛋白的收率较高,普遍维持在65-75%,相比于对照例1-2有显著提高。
表3实施例1-3及对照例3所制得胶原蛋白填充剂流变学参数
动力学黏度Pa·s | 弹性模量Pa | 平均推注力N | |
实施例1 | 21.3 | 202 | 4.55 |
实施例2 | 102.3 | 1202 | 20.77 |
实施例3 | 75.4 | 400 | 14.36 |
对照例3 | 18 | 323 | 7.75 |
由表3可知,本发明通过使用热冲击系统对胶原蛋白的自组装过程进行了有效控制,在特定胶原蛋白浓度及筛网均质的处理下,可以获得流变学参数不同的胶原蛋白产品,满足了营养水光、紧致抗衰和长效填充等不同用途胶原蛋白产品的使用需求,提高了产品使用体验和使用效果。相比于传统的均质方法,不仅可以获得不同流变学参数的产品,而且保证了胶原蛋白产品的均一性,具有稳定的推注力。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种自组装胶原蛋白的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理,得到酶解消化液;
S2、将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析,得到纯化后的胶原蛋白溶液;
S3、将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌,得到灭菌型胶原蛋白溶液;
S4、将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装,得到自组装胶原蛋白;
优选地,所述热冲击自组装时,控制自组装体系中胶原蛋白的浓度为2.0-2.2mg/mL,离子强度为0.1-0.3mol/L,pH值为7.0-8.0,并在1min内将自组装体系加热至35-37℃,保温30-60s后降至室温。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S1之前还包括预处理,所述预处理包括依次对牛皮进行酸浸、破碎和匀浆,
其中,所述酸浸时,使用质量浓度为1-10%的醋酸溶液对清洗、清理后的牛皮进行浸泡,并控制浸泡的温度为4-25℃,时间为5-10d;
所述匀浆时,向破碎后的牛皮颗粒中加入注射用水进行匀浆,匀浆后使用醋酸调节pH至2-3,得到组织匀浆液;
优选地,牛皮颗粒与注射用水的比例为1kg:(2-10)L。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述消化处理包括:向所述组织匀浆液中加入胃蛋白酶溶液进行消化,消化处理后进行灭酶,得到匀浆消化液;
优选地,胃蛋白酶溶液采用0.4-0.6M的醋酸作为溶剂,且胃蛋白酶溶液的酶活为1000-9000IU/ml;
优选地,胃蛋白酶溶液与组织匀浆液的体积比为(0.8-1.2):100;
优选地,所述消化时,控制温度为4-25℃,时间为7-10d;
优选地,所述灭酶时,使用8-12M的氢氧化钠溶液将消化处理后的组织匀浆液的pH调至9-10,静置过夜,得到匀浆消化液。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤S2中,所述硅藻土吸附过滤包括:将匀浆消化液按1:1的比例加入注射用水,使用盐酸调节pH至4,充分搅拌后,加入预处理后的硅藻土进行静置吸附1-3h,收集上清液并使用板框过滤机进行过滤,得到吸附过滤液;
优选地,每1L匀浆消化液需加入硅藻土的量为13-17g;
优选地,所述硅藻土的预处理方法为:将硅藻土使用8-12mM的盐酸溶液浸泡2h以上,浸泡后采用注射用水清洗3次以上;
所述一次超滤透析包括:使用分子截留量为100-200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积的醋酸钠溶液,反复重复3次;
优选地,所述醋酸钠溶液的浓度为20-40mM;
所述离子交换层析包括:使用弱阳离子交换树脂作为层析柱,采用浓度为20-40mM、pH值为4-5的醋酸钠缓冲液冲洗平衡,上样后使用含有10-300mM氯化钠的20-40mM醋酸钠缓冲液进行蛋白洗脱,收集洗脱液,得到层析液;
所述二次超滤透析包括:使用分子截留量为100-200kD的超滤膜进行超滤透析,当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时,补加等体积的稀盐酸溶液,待胶原蛋白的浓度达到2mg/mL时,停止透析;
优选地,所述稀盐酸溶液的浓度为10-30mM。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S3中,所述过滤灭菌时,使用经过灭菌处理的0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装之前,使用稀盐酸溶液将胶原蛋白的浓度调整为2.0-2.2mg/mL,并在室温下加入Na3PO4缓冲液调控溶液的离子强度和pH值;
优选地,Na3PO4缓冲液与胶原蛋白溶液的体积比为1:(10-50);
优选地,Na3PO4缓冲液的pH值为10-12。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,所述热冲击自组装完成后,进行多次离心和洗涤,得到自组装胶原蛋白;
优选地,所述离心时,控制转速为2000-6000rpm/min,时间为20-60min;
优选地,所述洗涤时,使用无菌生理盐水对离心得到的胶原蛋白沉淀进行离心洗涤。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,所述热冲击自组装所使用的热冲击系统包括依次收尾连接的胶原蛋白溶液储罐、蠕动泵、控温加热管、保温器、冷却器和胶原蛋白溶液接收罐。
9.一种自组装胶原蛋白,其特征在于,根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备而到;
优选地,所述自组装胶原蛋白的自组装程度为60%-75%。
10.一种胶原蛋白填充剂,其特征在于,由权利要求9所述自组装胶原蛋白经均质化处理得到;
优选地,所述自组装胶原蛋白均质化处理之前使用生理盐水调节胶原蛋白的浓度至10-70mg/mL;
优选地,所述均质化处理所使用的均质系统包括均质前储袋、筛网和均质后储袋,其中,所述均质前储袋和所述筛网之间、所述均质后储袋和所述筛网之间均分别设置有正向流通管道和反向流通管道,所述正向流通管道上均依次设置有蠕动泵和截止阀,所述反向流通管道上均设置有截止阀;
优选地,所述筛网的孔径为0.1-0.4mm;
优选地,所述胶原蛋白填充剂的动力黏度为10-200Pa·s,弹性模量为100-3000Pa。
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