CN115429873A - 一种天然未变性注射用胶原溶液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种天然未变性注射用胶原溶液及其制备方法，该制备方法通过使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值，精确调控溶液酸碱度、盐浓度及体系温度，使其在低温、低pH值、盐溶作用条件下快速均匀溶解获得高浓度胶原溶液；在生理盐浓度、弱酸性、升温状态下使少量胶原分子形成聚集体并稳固；将体系pH缓慢提高至中性，获得天然未变性胶原溶液中存在一定比例的胶原分子聚集体，使得胶原溶液在20mm/min的推动速度下，采用30G针头，能够维持最大推挤力在20N以下，平均推挤力在15N以下，能够用于注射，胶原溶液内毒素小于20EU/件且无菌，可直接用于人体组织注射，并且能够提高注射效果的维持时间。

Description

一种天然未变性注射用胶原溶液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医疗材料领域，具体涉及一种天然未变性注射用胶原溶液及其制备方法。
背景技术
美容护肤的方式有很多，有食补、运动、涂抹、注射等。目前，在美容护肤领域所用的原料主要有透明质酸、胶原及各种生物提取营养物。透明质酸仅有补水、保湿功效，无法达到理想的护肤效果；而各类生物提取物来源复杂，提纯工艺不稳定，存在巨大的安全隐患。胶原作为生物体内含量最多的蛋白质，因其优良的生物活性受到越来越广泛的关注。注射美容以其操作便捷、见效快等优势收到了广大爱美认识的青睐。然而，目前市场上仅存在涂抹、贴敷等类型的胶原日常护肤品，没有注射用的天然胶原溶液产品。
胶原特殊的棒状三螺旋结构分子导致其在中性条件下溶解性降低。为解决胶原溶解性问题，中国专利申请20111313770.8中公开了一种酰化I型胶原蛋白水光针的制备方法：通过采取对胶原分子进行酰化改性的方式，与透明质酸进行复配解决胶原溶解性差的问题。然而，经侧链酰化改性后的胶原分子空间结构发生了改变，导致其生物活性大幅下降；并在生产过程中残留的交联剂也带来了巨大的安全隐患。此外，目前注射类产品大多选择磷酸盐作为最终的溶剂体系，以期获得一定的pH缓冲性能。然而，根据Hofmeister效应，磷酸盐属于低离液序列盐，其电荷离域性较弱、极化率低，对于胶原分子的聚沉能力高，不利于胶原分子在中性条件下的溶解。因此，需要选择适宜的离液盐体系以利于纯胶原分子的稳定溶解。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法,该方法在维持了天然胶原三螺旋结构、无任何添加剂的基础上，选取合适的离液盐溶剂体系，通过控制制备工艺，获得了中性条件下无菌、内毒素可控、均匀可注射的纯胶原溶液。
本发明的第二个目的是为了提供一种天然未变性注射用胶原溶液。
实现本发明的目的之一可以通过采取如下技术方案达到：
一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取胶原溶液或冻干胶原于pH值为2～3的HCl水溶液中低温溶解；
(2)待胶原溶液溶解均匀后，用注射用水将胶原浓度稀释，使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0，缓慢搅拌获得稳定的胶原溶液；
(3)将稳定的胶原溶液的pH值上调至6～8，搅拌均匀得到所述天然未变性注射用胶原溶液。
进一步的，步骤(1)中，溶解后胶原的浓度为8～10mg/mL；溶解时溶液中加入NaCl至浓度为0.2～0.4M；低温溶解的条件为4～10℃下搅拌溶解2～6h。
进一步的，步骤(2)中，稀释后的胶原的浓度为2～6mg/mL；稀释后调节NaCl的浓度至0.1～0.2M。
进一步的，步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0的过程具体为：
第一阶段：使用NaOH上调胶原溶液pH值至3～3.8，进行搅拌，然后进行第二阶段：使用NaOH将胶原溶液pH值上调至4.5～5.0。
进一步的，第一阶段NaOH的浓度为0.4～0.8M；搅拌时间为1～3h；第二阶段NaOH的浓度为0.05～0.2M。
进一步的，步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0后，在温度为8～15℃，搅拌速度为20～50rpm下搅拌12～20h。
进一步的，所述胶原溶液或冻干胶原包括以下步骤制备得到：
(11)将动物组织在酸或碱溶液中浸泡，浸泡完成后用水清洗；
(12)清洗后的动物组织置于有机弱酸中，并加入酶进行提取；
(13)提取完成后，将物料离心取上清液，加入盐进行盐析；
(14)离心取盐析沉淀，将沉淀充分溶解于醋酸中，然后进行透析至透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液冻存或冻干储存得到所述胶原溶液或冻干胶原。
进一步的，所述动物组织为经过脱脂、脱毛、脱杂蛋白后的动物皮或跟腱；在步骤(11)中进行浸泡之前，使用乙醇对动物组织进行冲洗；所述乙醇的浓度为70～80％；在步骤(11)中进行浸泡之后，将溶液体系的pH值调节至6～8后再用水清洗。
进一步的，所述酸或碱溶液的浓度为0.2～0.4M；浸泡时料液质量比为1:40～80；浸泡时间为4～6h。
实现本发明的目的之二可以通过采取如下技术方案达到：
一种天然未变性注射用胶原溶液，其通过上述任一所述的天然未变性注射用胶原溶液的制备方法制备得到。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，通过精确调控溶液酸碱度、盐浓度及体系温度，使其在低温、低pH值、盐溶作用条件下快速均匀溶解获得高浓度胶原溶液；在生理盐浓度、弱酸性、升温状态下使少量胶原分子形成聚集体并稳固；然后将体系pH缓慢提高至中性，获得天然未变性胶原溶液中存在一定比例的胶原分子聚集体，能够用于注射，并且能够提高注射效果的维持时间。
2、本发明的一种天然未变性注射用胶原溶液，存在一定比例的胶原分子聚集体，能够提高注射效果的维持时间；胶原溶液在20mm/min的推动速度下，采用30G针头，能够维持最大推挤力在20N以下，平均推挤力在15N以下，且胶原溶液内毒素小于20EU/件且无菌，可直接用于人体组织注射。
附图说明
图1为实施例5的天然未变性胶原溶液的电泳图；
图2为实施例5的天然未变性胶原溶液DSC热变性温度图；
图3为实施例5的天然未变性胶原溶液使用30G针头在20mm/min的推动速度下的推挤力变化曲线图；
图4为对比例1的胶原溶液使用30G针头在20mm/min的推动速度下的推挤力变化曲线图；
图5为对比例2的胶原溶液使用30G针头在20mm/min的推动速度下的推挤力变化曲线图；
图6为对比例3的胶原溶液使用30G针头在20mm/min的推动速度下的推挤力变化曲线图；
图7为对比例4的胶原溶液使用30G针头在20mm/min的推动速度下的推挤力变化曲线图；
图8为实施例5的天然未变性胶原溶液中胶原粒径分布图；
图9为对比例1的天然未变性胶原溶液中胶原粒径分布图；
图10为对比例2的天然未变性胶原溶液中胶原粒径分布图；
图11为对比例3的天然未变性胶原溶液中胶原粒径分布图；
图12为对比例4的天然未变性胶原溶液中胶原粒径分布图；
图13为L929细胞在含有实施例5天然未变性胶原溶液的高糖培养基内进行培养结果图；
图14为L929细胞在不含有实施例5天然未变性胶原溶液的高糖培养基内进行培养结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，本发明制备过程中所用所有的试剂均为药用级或在250℃烘箱干烤2h进行灭菌去内毒素；所有容器均以0.2～0.4M HCl或NaOH溶液浸泡去内毒素并湿热灭菌。
一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，包括以下步骤：
(1)取胶原溶液或冻干胶原于pH值为2～3的HCl的水溶液中低温溶解；
(2)待胶原溶液溶解均匀后，用注射用水将胶原浓度稀释，使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0，缓慢搅拌获得稳定的胶原溶液；
(3)将稳定的胶原溶液的pH值上调至6～8，搅拌均匀得到所述天然未变性注射用胶原溶液。
本发明制备的天然未变性注射用胶原溶液以氯化钠作为溶剂体系，能够稳定胶原在中性条件下的结构稳定性及溶解性，体系渗透压与体液一致，符合注射要求；胶原溶液内毒素小于20EU/件且无菌，可直接用于人体组织注射。
在其中一个实施方式中，步骤(1)中，溶解后胶原的浓度为8～10mg/mL；溶解时溶液中加入NaCl至浓度为0.2～0.4M；低温溶解的条件为4～10℃下搅拌溶解2～6h。
加入NaCl是为了使胶原溶液或者冻干胶原可以快速均匀的溶解在酸性溶液中，而NaCl的浓度为0.2～0.4M是酸性条件下促进胶原盐溶的适宜盐浓度，浓度过高会导致胶原盐析。体系的温度和搅拌速率影响胶原的溶解和分散，而本发明的条件下可以实现在低温、低pH值、盐溶作用条件下快速均匀溶解获得高浓度胶原溶液。
在其中一个实施方式中，步骤(2)中，稀释后的胶原的浓度为2～6mg/mL；稀释后调节NaCl的浓度至0.1～0.2M。
胶原的浓度为2～6mg/mL是纯胶原注射液的最终浓度；NaCl的浓度为0.1～0.2M是与人体可注射的生理盐水浓度一致，也为纯胶原注射液的终体系盐浓度，且处于促进胶原的盐溶浓度。
在其中一个实施方式中，步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0的过程具体为：
第一阶段：使用NaOH上调胶原溶液pH值至3～3.8，进行搅拌，然后进行第二阶段：使用NaOH将胶原溶液pH值上调至4.5～5.0。
分两个阶段将体系的pH值调节至4.5～5.0之间，是因为随着溶液pH值的升高，逐渐接近胶原分子的等电点会导致胶原溶解性降低，因此分阶段调节pH值可以防止pH短时间内波动过大胶原快速析出。
在其中一个实施方式中，第一阶段NaOH的浓度为0.4～0.8M；搅拌时间为1～3h；第二阶段NaOH的浓度为0.05～0.2M。
在第二阶段上调pH值时，选择浓度更低的NaOH，使pH值上升速度放缓，防止pH值波动过大而胶原快速析出。
在其中一个实施方式中，步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0时，温度为8～15℃，搅拌速度为20～50rpm，并搅拌12～20h。
在第二阶段上调pH值时，同时同步提高溶液体系的温度，使胶原的溶解性同步升高，维持胶原在体系中的溶解稳定性；在该状态下长时间搅拌12～20h可以让体系中的部分胶原分子形成少量微小的聚集体，在同步控制盐浓度和温度的条件下，使聚集体稳固而阻止其进一步聚集。
在其中一个实施方式中，步骤(3)将稳定的胶原溶液的pH值上调至6～8后，温度控制在10～20℃之间，搅拌2～4h后，得到所述天然未变性注射用胶原溶液；优选的，使用0.05～0.2M的NaOH调节pH值。
在其中一个实施方式中，将所述天然未变性注射用胶原溶液罐装于注射器内。
在其中一个实施方式中，所述胶原溶液或冻干胶原购自分子量为300kDa的为胶原溶液或冻干胶原的活性胶原。
在其中一个实施方式中，所述天然未变性注射用胶原溶液以质量百分数计包括分子量为300kDa的活性胶原0.4wt％、氯化钠0.9wt％和余量的水。
在其中一个实施方式中，所述胶原溶液或冻干胶原包括以下步骤制备得到：
(11)将动物组织在酸或碱溶液中浸泡，浸泡完成后用水清洗；
(12)清洗后的动物组织置于有机弱酸中，并加入酶进行提取；
(13)提取完成后，将物料离心取上清液，加入盐进行盐析；
(14)离心取盐析沉淀，将沉淀充分溶解于醋酸中，然后进行透析至透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液冻存或冻干储存得到所述胶原溶液或冻干胶原。
本发明上述制备方法制备得到的胶原溶液或冻干胶原为天然未变性的胶原，具有三螺旋结构，侧链无改性修饰，无其他添加剂；并且内毒素小，满足注射要求。
在其中一个实施方式中，所述动物组织为经过脱脂、脱毛、脱杂蛋白后的动物皮或跟腱。
在其中一个实施方式中，在步骤(11)中进行浸泡之前，使用乙醇对动物组织进行冲洗；所述乙醇的浓度为70～80％；优选的，所述乙醇为75％的乙醇。
在其中一个实施方式中，在步骤(11)中进行浸泡之后，将溶液体系的pH值调节至6～8后再用水清洗。优选的，清洗用的水为注射用水，清洗的次数为3～5次。有助于除去动物组织中残留的盐。
在其中一个实施方式中，所述酸或碱溶液的浓度为0.2～0.4M；浸泡时料液质量比为1:40～80；浸泡时间为4～6h。
如果酸或碱的浓度过高，动物组织内胶原分子容易变性；而液比不易过低，因为浸泡过程中组织容易溶胀，液比过低可能导致内毒素去除不彻底。
在其中一个实施方式中，步骤(12)中，有机酸为柠檬酸、醋酸中的一种或两种的组合物；有机酸的浓度为0.2～0.8M；动物组织的料液质量比为1:20～40。
在其中一个实施方式中，所述酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或两种以上的组合物；加入酶的量为动物组织湿重的1％～3％。
在其中一个实施方式中，所述提取的过程为：在温度为4～10℃下，搅拌转速80～200rpm下提取3天，然后补充水至料液比为1：10～20后继续提取2天。其中通过分次补水可以提高提取效率。
在其中一个实施方式中，步骤(13)中，所述盐为硫酸铵、氯化钠、氯化钾、硫酸钠中的一种或两种以上的组合物；加入盐的量为至盐浓度为0.5～2.0M.
在其中一个实施方式中，盐析条件为：在温度为4～10℃，搅拌速度为150～300rpm下盐析3～5h，随后静置5～10h。
在其中一个实施方式中，步骤(14)中，醋酸的浓度为0.2～0.4M；沉淀溶解后溶液的质量含量为0.05～0.1％；胶原溶液的质量含量浓度过低会导致透析袋内胶原成胶，浓度过高会导致溶液透析不彻底。
在其中一个实施方式中，透析分子量为8000～14000Da；透析时间为2～5天，优选的，每天更换液体3次。
实施例1：
经脱脂、脱毛、脱杂蛋白后用于胶原提取的牛皮用70％的乙醇冲洗3次后，于0.2M的HCl中浸泡6h，液比为1:40，去除内毒素；浸泡完成后将体系的pH值调节至6。倾倒去液体后，用注射用水清洗3次，然后将处理后的动物组织加入0.2M的醋酸中，液比为1：20，再加入动物组织湿重1％的胃蛋白酶，温度4℃，搅拌转速80rpm，提取3天后，补充注射用水至液比为1：10再继续提取2天。提取完成后，将物料离心，取上清液，加入0.5M的氯化钠进行盐析4h，搅拌150rpm，温度4℃，随后静置8h。离心取盐析沉淀溶解于0.2M的醋酸中，充分溶解后用8000～14000Da分子量的透析袋中对0.05％的醋酸溶液透析4天，每天换液3次，最终测定透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液经灭菌后冻存或冻干储存。
实施例2：
经脱脂、脱毛、脱杂蛋白后用于胶原提取的牛皮用75％的乙醇冲洗3次后，于0.3M的HCl浸泡2.5h后再在0.3M的NaOH水溶液中浸泡2.5h，液比为1:60，去除内毒素；浸泡完成后将体系的pH调节至7。倾倒去液体后，用注射用水清洗4次，除去组织中残留的盐。处理后的动物组织于0.5M的醋酸中，液比1：30，加入组织湿重2％的胃蛋白酶，温度7℃，搅拌转速140rpm，提取3天后，补充注射用水至液比为1：15再继续提取2天。提取完成后，将物料离心取上清液，加入1.3M的氯化钠进行盐析4h，搅拌230rpm，温度7℃，随后静置8h。离心取盐析沉淀，溶解于0.3M的醋酸中，充分溶解后，于8000～14000Da分子量的透析袋中对0.07％的醋酸溶液透析4天，每天换液3次，最终测定透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液经灭菌后冻存或冻干储存。
实施例3：
经脱脂、脱毛、脱杂蛋白后用于胶原提取的牛皮用80％的乙醇冲洗2次后，于0.4M的的NaOH水溶液中浸泡4h，液比为1:80，去除内毒素；浸泡完成后将体系的pH调节至8。倾倒去液体后，用注射用水清洗5次，除去组织中残留的盐。处理后的动物组织于0.8M的醋酸中，液比1：40，加入组织湿重3％的胃蛋白酶，温度10℃，搅拌转速200rpm，提取3天后，补充注射用水至液比为1：20再继续提取2天。提取完成后，将物料离心取上清液，加入2.0M的氯化钠进行盐析4h，搅拌300rpm，温度10℃，随后静置8h。离心取盐析沉淀，溶解于0.4M的醋酸中，充分溶解后，于8000～14000Da分子量的透析袋中对0.1％的醋酸溶液透析4天，每天换液3次，最终测定透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液经灭菌后冻存或冻干储存。
实施例4：
取灭菌后的胶原溶液，用pH值为2的HCl水溶液稀释至胶原浓度为8mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为200mM，并于低温水浴4℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至2mg/mL，并补加NaCl使其浓度为100mM。用0.4M的NaOH水溶液将体系pH值缓慢上调至3，水浴4℃下搅拌2h。随后改用0.05M的NaOH水溶液将pH值缓慢上调至4.5，同时将水浴温度上升至8℃，转速放缓为20rpm，搅拌12h。待体系搅拌均匀稳定后，用0.05M的NaOH水溶液将pH上调至6，在10℃水浴中搅拌2h，最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得天然未变性注射用胶原溶液。
实施例5：
取实施例2制备得到的灭菌后冻存的胶原溶液，用pH值为2.5的HCl水溶液稀释至胶原浓度为9mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为300mM，并于低温水浴7℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至4mg/mL，并补加NaCl使其浓度为150mM。用0.6M的NaOH水溶液将体系pH值缓慢上调至3.4，水浴7℃下搅拌2h。随后改用0.1M的NaOH水溶液将pH值缓慢上调至4.7，同时将水浴温度上升至12℃，转速放缓为35rpm，搅拌12h。待体系搅拌均匀稳定后，用0.1M的NaOH水溶液将pH值上调至7.4，于15℃水浴中搅拌3h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得天然未变性注射用胶原溶液。
实施例6：
取灭菌后的胶原溶液，用pH值为3的HCl水溶液稀释至胶原浓度为10mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为400mM，并于低温水浴10℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至6mg/mL，并补加NaCl使其浓度为200mM。用0.8M的NaOH水溶液将体系pH缓慢上调至3.8，水浴10℃下搅拌2h。随后改用0.2M的NaOH水溶液将pH值缓慢上调至5.0，同时将水浴温度上升至15℃，转速放缓为50rpm，搅拌12h。待体系搅拌均匀稳定后，用0.1M的NaOH水溶液将pH值上调至8.0，于20℃水浴中搅拌4h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得天然未变性注射用胶原溶液。
对比例1：
与实例5相比，对比例1最终产品的pH值为4.7，控制于弱酸性而非中性，制备过程如下：
取实施例2制备得到的灭菌后冻存的胶原溶液，用pH值为2.5的HCl水溶液稀释至胶原浓度为9mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为300mM，并于低温水浴7℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至4mg/mL，并补加NaCl使其浓度为150mM。用0.6M的NaOH水溶液将体系pH值缓慢上调至3.4，水浴7℃下搅拌2h。随后改用0.1M的NaOH水溶液将pH值缓慢上调至4.7，同时将水浴温度上升至12℃，转速放缓为35rpm，搅拌12h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得注射用胶原溶液。
对比例2：
与实施例5相比，对比例2在将体系pH值由酸性调至中性过程中选用一次性用NaOH直接快速上调，制备过程如下：
取实施例2制备得到的灭菌后冻存的胶原溶液，用pH值为2.5的HCl水溶液稀释至胶原浓度为9mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为300mM，并于低温水浴7℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至4mg/mL，并补加NaCl使其浓度约为150mM。用0.6M的NaOH水溶液将体系pH值上调至7.4，水浴7℃下搅拌12h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得注射用胶原溶液。
对比例3：
与实施例5相比，对比例3最终的溶剂体系中含有0.01M的PBS，制备过程如下：
取实施例2制备得到的灭菌后冻存的胶原溶液，用pH值为2.5的HCl水溶液稀释至胶原浓度为9mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，4.4g十二水合磷酸氢二钠，0.4g二水合磷酸二氢钠，并于低温水浴7℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至4mg/mL，并补加NaCl使溶剂体系为0.01M的PBS氯化钠浓度为150mM。用0.6M的NaOH水溶液将体系pH值缓慢上调至3.4，水浴7℃下搅拌2h。随后改用0.1M的NaOH水溶液将pH值缓慢上调至4.7，同时将水浴温度上升至12℃，转速放缓为35rpm搅拌12h。待体系搅拌均匀稳定后，用0.1M的NaOH水溶液将pH值上调至7.4，于15℃水浴中搅拌3h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得天然未变性注射用胶原溶液。
对比例4：
与实施例5相比，对比例4的产品最终未长时间搅拌12h，直接进行灌装，制备过程如下：
取实施例2制备得到的灭菌后冻存的胶原溶液，用pH值为2.5的HCl水溶液稀释至胶原浓度为9mg/mL，最终总体积为1L。向胶原溶液中缓慢加入NaCl晶体，使体系的NaCl浓度为300mM，并于低温水浴7℃下搅拌2h。搅拌后用注射用水将体系的胶原浓度稀释至4mg/mL，并补加NaCl使其浓度为150mM。用0.6M的NaOH水溶液将体系pH缓慢上调至3.4，水浴7℃下搅拌2h。随后改用0.1M的NaOH水溶液将pH缓慢上调至4.7，待体系搅拌均匀稳定后，用0.1M的NaOH水溶液将pH值上调至7.4，于15℃水浴中搅拌3h。最后在负压和无菌条件下，将制备好的胶原溶液罐装于3mL的预灌封注射器中，即得天然未变性注射用胶原溶液。
试验例
电泳分析实验
将实施例5的天然未变性注射用胶原溶液进行电泳分析，电泳结果如图1所示。从图1电泳结果可以看出，实施例5的天然未变性注射用胶原溶液呈现了胶原特征三螺旋结构条带，在100kDa附近有两条α1链和1条α2链，总分子量约为300kDa。
热稳定性实验
将实施例5的天然未变性注射用胶原溶液进行热稳定性试验，获得DSC热变性温度图，如图2所示。从图2的DSC结果可以看出，实施例5的天然未变性注射用胶原溶液中胶原变性温度约为39.7℃，与文献报道的牛皮胶原的变性温度一致，表明其稳定性高，具有完整的三螺旋结构。
推挤力实验：
将实施例5和对比例1-4的胶原溶液离心去泡后，罐装于3mL的注射器内，采用30G针头，于拉力机测定样品在20mm/min的推动速度下的推挤力(配备推挤力测定专用套件)。截取样品测试过程中15秒时间作为考察对象，绘制推挤过程中样品推挤力的变化曲线，如图3-图7所示：
从图3-7分析，实施例5的天然未变性注射用胶原溶液，最大推挤力约为5N，平均推挤力小于5N，达到要求。对比例1胶原溶液为酸性条件样品，体系内为均匀胶原溶液，无胶原聚集体，因此推挤力符合要求，但是产品为酸性，可能会产生不良影响；且体系内无胶原聚集体，维持时间较短。对比例2的胶原溶液在pH调节至中性时，采用氢氧化钠一次性上调，导致胶原快速不均匀析出，不均匀的胶原聚集体堆积后是注射器针口堵塞，推挤力一致升高，最大推挤力约为45N。对比例3胶原溶液最终体系内含有0.01M的磷酸盐体系，不利于胶原分子在中性调节下的溶解，体系内有较多胶原聚集体沉降，导致注射推挤力波动较大，最大推挤力达到约37N。对比例4胶原溶液未经过最终长时间的搅拌，导致其内部胶原聚集体大小不均一，造成最终推挤力不稳定，最大推挤力约25N。因此可以知道采用本发明方法制备得到的天然未变性注射用胶原溶液采用30G针头进行注射推挤力较小，可以满足注射要求。而其他对比例2-4的胶原溶液，推挤力较大，不适用于注射。
粒径分析实验：
将实施例5和对比例1-4的胶原溶液采用动态光散射测试溶液中的分子尺寸分布，测试方法为：所有样品溶液加入聚苯乙烯比色皿中进行检测；在溶液中，胶原分子会进行无规则的布朗运动，采用动态光散射分析胶原的粒径分布时，溶液中的粒子会使通过的光发生散射，而散射光的相互叠加会导致粒子的黑暗区和明亮区光强的叠加或减少，从而使光强呈现出波动的形式。溶液中的胶原粒子在受到其周围溶剂分子布朗运动的不停撞击后，也会进行无规则运动。在激光的照射下，运动的粒子的散射光强度也会将产生波动。波动的频率与颗粒的大小有关，通过动态光散射记录离子涨落快慢的变化，得到溶液中粒子的粒径分布信息；结果如图8-12所示。
从图8可以看出，实施例5的天然未变性注射用胶原溶液，其粒径尺寸集中分布在20～28nm和600～850nm范围内，为胶原分子特有的两种不同尺寸粒径分布。而在20000～80000nm处具有约15％的胶原分子，为胶原聚集体的粒径分布范围。因此实施例5的天然未变性注射用胶原溶液平均粒径为8035.55nm，最大聚集体粒径分布于20000～80000nm(20～80μm)。而30G针头的内径约为150μm，因此实施例2的天然未变性注射用胶原溶液可以均匀注射；其中单分子胶原约占85％，胶原聚集体约15％。
从图9可以看出，对比例1的胶原溶液为酸性溶液，溶液内无胶原聚集体，均匀单分子胶原，平均粒径为888.23nm，因此会导致注射维持时间短。
从图10可以看出，对比例2的胶原溶液在pH调节至中性时，采用氢氧化钠一次性上调，其平均粒径为113811.7nm，其中胶原聚集体粒径分布为102400～445890nm(102.4～445.89μm)，其占比约66.6％。说明该样品内有大量不均匀的聚集体存在，而30G针头的内径约为150μm，因此对比例2的胶原溶液在注射时会造成堵针。
从图11可以看出，对比例3的胶原溶液为磷酸盐体系溶液，由于磷酸盐会造成胶原在中性条件下溶解度降低，使胶原发生聚集，因此对比例3的胶原溶液出现多组粒径分布，但其中126870～201490nm范围内的聚集体占29.47％，会造成样品堵针。
对比例4的胶原溶液未进行长时间搅拌，从图12可以看出，对比例4的胶原溶液同样有多组不均匀的粒径分布范围存在，且最大粒径分布为56980～254720nm，同样存在堵针风险。
因此从图8-12可以知道，不同的制备方法制备得到的胶原溶液的粒径大小及其分布是不同的，因此通过本发明的制备方法制备得到的天然未变性注射用胶原溶液，胶原颗粒都在30G针头的内径范围内，推挤力较小，不会具有堵针的情况。并且除了单分子胶原外，含有少量的胶原聚集体，能够提高注射效果的维持时间。
细胞培养实验：
使用L929细胞在含有实施例5天然未变性注射用胶原溶液的高糖培养基内进行培养，对照组培养基内不添加实施例5天然未变性注射用胶原溶液的相同高糖培养基内进行培养，培养结果如图13-14所示。
对比图13-14培养基结果，可以看出：显然图13中细胞数量和密度远超过图14，说明图13中实施例5天然胶原天然未变性注射用胶原溶液注射进入皮肤后能够作为细胞生长和依附的支架物，诱导成纤维细胞的增殖，加快美容注射针口皮肤的修复，起到改善面部肌肤状态的作用。
综上所述，本发明的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，通过精确调控溶液酸碱度、盐浓度及体系温度，使其在低温、低pH值、盐溶作用条件下快速均匀溶解获得高浓度胶原溶液；在生理盐浓度、弱酸性、升温状态下使少量胶原分子形成聚集体并稳固；然后将体系pH缓慢提高至中性，获得天然未变性胶原溶液中存在一定比例的胶原分子聚集体，胶原溶液在20mm/min的推动速度下，采用30G针头，能够维持最大推挤力在20N以下，平均推挤力在15N以下，且胶原溶液内毒素小于20EU/件且无菌，能够用于注射，可直接用于人体组织注射，并且能够提高注射效果的维持时间。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取胶原溶液或冻干胶原于pH值为2～3的HCl水溶液中低温溶解；
(2)待胶原溶液溶解均匀后，用注射用水将胶原浓度稀释，使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0，缓慢搅拌获得稳定的胶原溶液；
(3)将稳定的胶原溶液的pH值上调至6～8，搅拌均匀得到所述天然未变性注射用胶原溶液。
2.根据权利要求1所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，溶解后胶原的浓度为8～10mg/mL；溶解时溶液中加入NaCl至浓度为0.2～0.4M；低温溶解的条件为4～10℃下搅拌溶解2～6h。
3.根据权利要求1所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中，稀释后的胶原的浓度为2～6mg/mL；稀释后调节NaCl的浓度至0.1～0.2M。
4.根据权利要求1所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0的过程具体为：
第一阶段：使用NaOH上调胶原溶液pH值至3～3.8，进行搅拌，然后进行第二阶段：使用NaOH将胶原溶液pH值上调至4.5～5.0。
5.根据权利要求4所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
第一阶段NaOH的浓度为0.4～0.8M；搅拌时间为1～3h；第二阶段NaOH的浓度为0.05～0.2M。
6.根据权利要求1所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中使用NaOH分阶段调节胶原溶液的pH值至4.5～5.0后，在温度为8～15℃，搅拌速度为20～50rpm下搅拌12～20h。
7.根据权利要求1所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液或冻干胶原包括以下步骤制备得到：
(11)将动物组织在酸或碱溶液中浸泡，浸泡完成后用水清洗；
(12)清洗后的动物组织置于有机弱酸中，并加入酶进行提取；
(13)提取完成后，将物料离心取上清液，加入盐进行盐析；
(14)离心取盐析沉淀，将沉淀充分溶解于醋酸中，然后进行透析至透析外液电导率在50～200μs/cm，透析后的胶原溶液冻存或冻干储存得到所述胶原溶液或冻干胶原。
8.根据权利要求7所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
所述动物组织为经过脱脂、脱毛、脱杂蛋白后的动物皮或跟腱；在步骤(11)中进行浸泡之前，使用乙醇对动物组织进行冲洗；所述乙醇的浓度为70～80％；在步骤(11)中进行浸泡之后，将溶液体系的pH值调节至6～8后再用水清洗。
9.根据权利要求7所述的一种天然未变性注射用胶原溶液的制备方法，其特征在于，
步骤(11)中所述酸或碱溶液的浓度为0.2～0.4M；浸泡时料液质量比为1:40～80；浸泡时间为4～6h。
10.一种天然未变性注射用胶原溶液，其特征在于，通过权利要求1-9任一项所述的天然未变性注射用胶原溶液的制备方法制备得到。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1534727A (fr) * 1967-03-31 1968-08-02 Haver Lockhart Lab Procédé de préparation d'un adjuvant injectable
WO1998044809A1 (en) * 1997-04-03 1998-10-15 Clearcoll Pty. Ltd. Improved process for the manufacture of collagen
CN102276716A (zh) * 2011-08-08 2011-12-14 四川大学 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法
US20170334969A1 (en) * 2014-11-21 2017-11-23 Sewoncellontech Co., Ltd. Method for producing high-concentration collagen for using as medical material
CN108640987A (zh) * 2018-06-26 2018-10-12 四川大学 一种以离子液体预处理提取未变性天然胶原的方法
CN110615838A (zh) * 2019-08-14 2019-12-27 浙江珂瑞康生物医疗科技有限公司 一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及制备方法
US20200282107A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Imtek Ltd Sterile clear concentrated solution of biocompatible collagen, process for the preparation and use thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1534727A (fr) * 1967-03-31 1968-08-02 Haver Lockhart Lab Procédé de préparation d'un adjuvant injectable
WO1998044809A1 (en) * 1997-04-03 1998-10-15 Clearcoll Pty. Ltd. Improved process for the manufacture of collagen
CN102276716A (zh) * 2011-08-08 2011-12-14 四川大学 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法
US20170334969A1 (en) * 2014-11-21 2017-11-23 Sewoncellontech Co., Ltd. Method for producing high-concentration collagen for using as medical material
CN108640987A (zh) * 2018-06-26 2018-10-12 四川大学 一种以离子液体预处理提取未变性天然胶原的方法
US20200282107A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Imtek Ltd Sterile clear concentrated solution of biocompatible collagen, process for the preparation and use thereof
CN110615838A (zh) * 2019-08-14 2019-12-27 浙江珂瑞康生物医疗科技有限公司 一种无菌速溶未变性天然胶原冻干品及制备方法

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