JP5642388B2 - 注射用ヒアルロン酸ゲル移植片混合物 - Google Patents
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Description
ヒアルロン酸の50%〜95%、好ましくは60%〜90%、更に一層好ましくは85重量%が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の5%〜50%、好ましくは10%〜30%、更に一層好ましくは15重量%が遊離形態またはHAの生理学的に許容可能な塩の1つの形態であり、分子質量が500〜2800kDaであり、好ましくは750〜2600kDaであり、更に好ましくは800〜2500kDaであり、更に一層好ましくは1000〜1500kDaであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体において、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と遊離ヒアルロン酸の重量の比が1:1〜1:0.05であることを特徴とする、移植片に関する。
1)ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
− 膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
− pH約7の緩衝液中で等張化剤(iso-osmolarizing agent)を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
− 架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
2)pH約7の等張性(iso-osmolar)緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
− 膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
3)工程1)で得た架橋ゲルと、工程2)で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
4)任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
工程を含んでなる。
健康な繊維芽細胞と、
老化繊維芽細胞(H 2 O 2 による酸化的ストレスによる)
についての様々な分子質量のHA活性の特性決定
MMP−1(コラゲナーゼ1)は、コラーゲンIおよびIIIのような繊維性コラゲナーゼのトリプルへリックスを分解する間質コラゲナーゼである。皮膚では、それは繊維芽細胞とケラチノサイトによって発現され、分泌される。MMP−1は老化に関与している。実際に、老化の際のその過剰発現は堅さおよび弾力性の喪失および皺の出現に関係している可能性がある。老化がH2O2によって誘発されるときには、繊維芽細胞においてMMP−1の大きな増加が見られる。従って、この過剰産生を減少させることができる積極的な原理物質は、「老化防止」(anti-aging)特性を有する。
老化繊維芽細胞については、HAを最終濃度1μg/mlに加え、H2O2ストレス中、すなわち、24時間のインキュベーション中放置する。
総RNAの定性的および定量的アッセイを、RNA 6000 Nano LabChipアッセイキットとBioanalyseur 2100装置(Agilent)によって行う。これは、ナノチップにおける試料の電気泳動による移動の原理に基づいている。28S/18SリボソームRNAの比を計算すると、RNAの完全性の評価に対する情報が与えられる。更に、ゲノムDNAに関するRNAの純度を評価する。
H2O2とインキュベーションすることによって老化した繊維芽細胞は、正常な繊維芽細胞の2.14倍のMMP−1を発現し(従って、老化が適正に誘発された)。ビタミンE(ポジティブコントロール)の存在下では、老化繊維芽細胞によるMMP−1の過剰発現は、40%だけ減少した。
H2O2とインキュベーションすることによって老化した繊維芽細胞について、I型コラーゲンの様々な転写の阻害を測定したが、このような阻害はドナーによって変化すると思われた。I型の転写がH2O2ストレスによって24%阻害されたドナーの1人について、様々なサイズの様々なHAはコラーゲンの合成を回復しなかった。
この実験の結論は、老化を誘導したこのモデルでは、HAは抗MMP−1活性を有する(従って、酸化防止剤は老化防止活性を潜在的に有する)と思われることである。一層高分子質量のHA(800、1500および2600kDa)は、450kDaのHAより有効であると思われる。
2.1.架橋HAの調製
分子質量が1.6MDaのヒアルロン酸ナトリウム5gを、1%水酸化ナトリウム(35.6g)に加えた。混合物を、断続的に1時間30分ホモジナイズする。次いで、BDDE 315mgをホモジナイズしたHA/NaOH混合物に加えて、ホモジナイズを中止し(closed)、次いで50℃の水浴に2時間入れた。混合物を、1N HCl 5gを添加して中和した。
この精製したゲルに、リン酸緩衝液で予め水和した1.2MDaのHAを加えた。濃度が20mg/gのHAゲル1.2MDa60gを、得られた架橋ゲル226gに加える。2種類のゲルを、標準的ブレードミキサーで1−2時間ホモジナイズする。
本発明の一つの面によれば、以下の発明が提供される。
(1)重量で0.5%〜5%、好ましくは0.5%〜4%、更に好ましくは2%のヒアルロン酸を含んでなる、単相ヒドロゲルの形態で皮下または皮内注射可能な移植片であって、
ヒアルロン酸の50%〜95%、好ましくは60%〜90%、更に一層好ましくは85重量%が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の5%〜50%、好ましくは10%〜30%、更に一層好ましくは15重量%が遊離形態またはその生理学的に許容可能な塩の1つの形態であり、分子質量が500〜2800kDaであり、好ましくは750〜2600kDaであり、更に好ましくは800〜2500kDaであり、更に一層好ましくは1000〜1500kDaであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体において、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と遊離ヒアルロン酸の重量の比が1:1〜1:0.05であることを特徴とする、移植片。
(2)架橋ヒアルロン酸から構成されるゲルの粘度が、200〜2000Pa・s、好ましくは1000〜1800Pa・sである、上記(1)に記載の注射可能な移植片。
(3)架橋ゲルを構成するヒアルロン酸の分子質量が、1000〜6000kDaであり、好ましくは1000〜4000kDaである、上記(1)または(2)に記載の注射可能な移植片。
(4)分子質量が2〜80kDaであり、好ましくは20〜50kDaであるコンドロイチン硫酸を更に含む、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の注射可能な移植片。
(5)遊離ヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の1つが、架橋ヒアルロン酸ゲルの内部に均質に分布している、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の注射可能な移植片。
(6)キャリヤー流体が非発熱性の滅菌等張緩衝液である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の注射可能な移植片。
(7)皮膚化粧品で用いられる少なくとも1種類の他の活性物質を更に含む、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の注射可能な移植片。
(8)皮膚化粧用の活性物質が、ビタミン、酸化防止剤、無機塩、防腐剤およびコンドロイチン硫酸から選択される、上記(7)に記載の注射可能な移植片。
(9)酸化防止剤がマンニトールである、上記(8)に記載の注射可能な移植片。
(10)薬剤としての、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片。
(11)注射器形態で提示されかつ上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片を含む、キット。
(12)皮膚をフリーラジカルから保護しおよび/または皮膚のヒアルロン酸の解重合を制限することを目的とした移植片を製造するための、マンニトールのような酸化防止剤の存在下における分子質量が500〜2800kDa、好ましくは750〜2600kDa、更に好ましくは800〜2500kDa、更に一層好ましくは1000〜1500kDaの遊離形態のヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の1つの形態の使用。
(13)注射可能な移植片の皮下注射を含んでなる、皺、小皺、皮膚陥凹および/または瘢痕を塞ぐための、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片または上記(11)に記載のキットの使用。
(14)皮膚の酸化防止活性を刺激しおよび/または皮膚老化を防止する薬剤を調製するための、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片の使用。
(15)コラーゲンIII/コラーゲンI比をより若い組織で測定した値に維持しおよび/または回復する薬剤を製造するための、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の移植片の使用。
(16)皺を塞ぎ、皮膚の細胞活性を高めおよび/または皮膚の堅さおよび弾力性の機械的特性を維持しおよび/または表皮および真皮の代謝を刺激しおよび/または真皮の酸化防止活性を刺激しおよび/または皮膚老化を防止することを目的とする皮下移植片を製造するための、架橋ヒアルロン酸のゲル中に分布した分子質量が500〜2800kDa、好ましくは750〜2600kDa、更に好ましくは800〜2500kDa、更に一層好ましくは1000〜1500kDaの遊離形態のヒアルロン酸またはその生理学的に許容可能な塩の1つの形態の使用。
(17)少なくとも1種類の上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片を投与することを含んでなる、皺および/または小皺を塞ぐ化粧方法。
(18)
1)ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
− 膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
− pH約7の緩衝液中で等張化剤(iso-osmolarizing agent)を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
− 架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
2)pH約7の等張性(iso-osmolar)緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
− 膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
3)工程1)で得た架橋ゲルと、工程2)で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
4)任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
の工程を含んでなる、上記(1)〜(9)のいずれかに記載の注射可能な移植片の調製方法。
Claims (14)
- 重量で0.5%〜5%のヒアルロン酸と生理学的に許容可能なキャリヤー流体とを含んでなる、単相ヒドロゲルの形態で皮下または皮内注射可能な移植片混合物であって、
ヒアルロン酸の50重量%〜95重量%が架橋ゲルの形態であり、
ヒアルロン酸の5重量%〜50重量%が遊離形態またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な1種の塩の形態であり、分子質量が500〜2800kDaであり、
生理学的に許容可能なキャリヤー流体が非発熱性の滅菌等張緩衝液であり、架橋ヒアルロン酸ゲルの重量と、遊離ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な1種の塩の重量の比が1:1〜1:0.05であることを特徴とする、移植片混合物。 - 架橋ヒアルロン酸から構成されるゲルの粘度が、200〜2000Pa・sである、請求項1に記載の注射可能な移植片混合物。
- 架橋ゲルを構成するヒアルロン酸の分子質量が、1000〜6000kDaである、請求項1または2に記載の注射可能な移植片混合物。
- 分子質量が2〜80kDaであるコンドロイチン硫酸を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
- 遊離ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の生理学的に許容可能な1種の塩が、架橋ヒアルロン酸ゲルの内部に均質に分布している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
- 皮膚化粧品で用いられる少なくとも1種類の他の活性物質を更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物。
- 皮膚化粧用の活性物質が、ビタミン、酸化防止剤、無機塩、防腐剤およびコンドロイチン硫酸から選択される、請求項6に記載の注射可能な移植片混合物。
- 酸化防止剤がマンニトールである、請求項7に記載の注射可能な移植片混合物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、薬剤。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、皺、小皺、皮膚陥凹および/または瘢痕を塞ぐことに使用するための薬剤。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含んでなる、皮膚の酸化防止活性を刺激しおよび/または皮膚老化を防止することに使用するための薬剤。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植片混合物を含んでなる、コラーゲンIII/コラーゲンI比をより若い組織で測定した値に維持しおよび/または回復することに使用するための薬剤。
- 注射器形態である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物を含む、キット。
- 1)ヒアルロン酸を塩基性流体に添加し、
− 膨潤し、低速攪拌下で均質化し、熱架橋し、
− pH約7の緩衝液中で等張化剤(iso-osmolarizing agent)を添加することによって架橋ゲルを中和および膨潤し、
− 架橋剤を除去する
工程によって架橋ゲルを調製し、
2)pH約7の等張性(iso-osmolar)緩衝液にヒアルロン酸を添加し、
− 膨潤させる
ことによって遊離ヒアルロン酸ゲルを調製し、
3)工程1)で得た架橋ゲルと、工程2)で得た遊離ヒアルロン酸ゲルとを混合し、
4)任意に脱気し、および場合によってはボトルまたは注射器へ包装し、次いで滅菌する
の工程を含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の注射可能な移植片混合物の調製方法。
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