JP6726182B2 - 真皮結合組織中のフィブロエラスチンの回復用途のアミノ酸系組成物 - Google Patents

Description

本発明は、エラスチンおよびコラーゲンの生合成の活性化が可能な、アミノ酸の混合物を、有効成分として含有している、組成物に関する。

発明の背景
真皮は、支持ならびに栄養保持機能を発揮し、そして、全体として、強度、柔軟性、張りおよび代謝生存性を皮膚に与えている、皮膚の中央領域である。主に、それぞれ、配糖体の性質、および、糖ペプチドの性質の親水性物質である、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）およびプロテオグリカン（ＰＧｓ）により構成される、間質マトリックスを継続的に再生成している、間葉系の起源の特異化した細胞である、繊維芽細胞と称される細胞を含んでいる。皮膚に強度と健康な状態を与える、全ての繊維性タンパク質が、その中にはめ込まれている、ゲル形状の親水性の網目を構成している、多量の水を、前記高分子は、維持している。

また、繊維芽細胞は、皮膚ならびに粘膜に、それらが蒙った、形態的、ならびに、機械的な変化に適合する、本来的な特性を付与する、弾力性を具えたタンパク質である、エラスチンの合成の責を負っている。

エラスチンは、重大な分子変化を伴うことなく、その本来の長さの７倍まで伸長し、また、その寸法基準に戻ることができ、そして、理論的には、この伸長を、限りない回数繰り返すことができる。

皮膚老化ならびに光老化として知られている、症状は、細胞、表面組織の構造、なかでも、深部の組織構造に影響を及ぼす、極めて複雑な生化学的現象の客観的な皮膚科学的徴候を示す。

光老化は、皮膚表面上、特に、光にさらされた部位（顔、首筋、および胴）の、様々な数と深さの皺、弾性繊維症、大なり、小なり拡散している色素斑、表皮肥厚ならびにそばかすの出現を引き起こす。外皮組織の末梢部（真皮網状層）内に位置する、エラスチン繊維のネットワークにより代表される、皮膚の弾性成分は、上述する光老化現象の結果、皮膚の全体の弾力性の有意な低下を引き起こす、大きな変化を蒙る。巨視的レベルでは、前記の現象は、組織のたるみ、ならびに弾性繊維症を誘起する、機械的伸長に適合するための、皮膚の結合組織の能力を低減させる。

エラスチンの前駆体である、トロポエラスチン タンパク質をコードする遺伝子（ＥＬＮ遺伝子）は、独特である：コラーゲンの場合のような、異なる型のエラスチンをコードしているいくつかの遺伝子（スーパーファミリー）は、存在していない［１］。前記遺伝子は、異なる型のエラスチンをコードしている（すなわち、例えば、熱傷あるいは光老化等の、物理的な損傷への応答において、健康な、新たに形成される組織のため、恐らくは、異なるトロポエラスチンをコードするプロセスがある）；胎児の段階から、既に発現を開始しており、生後の最初の５年間は、活性なままであり、そして、その後、その活性が停止するまで、急激に遅くなる［１，２］。換言すると、結合組織、そして、特には、真皮、粘膜、軟骨組織、内膜、肺および心臓弁膜／心筋の結合組織、の弾性成分は、生後、初めの数年の間には、既に、次第に合成されなくなっている。前記成分は、結果として、体の「弾力性の供給源」を代表しており、そして、熱傷あるいは重い光老化等の、重篤な組織損傷の場合を除き、生涯、補充されることはない。これらの場合には、機能性のエラスチンの生成と、引き続き、細胞表面に接着しているミクロフィブリル中への取り込みに必要なステップである、トロポエラスチン 前駆体分子中のリシン残基の酸化を触媒する、５つの異なる酵素をコードしている、ＬＯＸ（リシン オキシダーゼ）遺伝子の過剰発現が観られる［３，４］。特に、前記酵素依存的プロセスは、リシン酸化と、それと同時に起こる、架橋された分子内結合を生じさせる、Ｌ−ｌｙｓのアミノ基とアルドースとの間のシッフ塩基の生成で構成されている。エラスチンは、実質的に置き換えがなされない、唯一の結合組織タンパク質であり、そして、７０年を超える間（平均半減期間７４年）、その状態で保持されている。

コラーゲンの場合、ＩＶ型コラーゲンは、マトリック内の細胞の配向に着目して、基底の真皮表皮膜、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の超分子的組織の構築過程において、中心的な役割を果たしている。ＩＶ型コラーゲンの不足は、特に、皮膚の老化および光老化で典型的な、皮膚の変性現象における、ヒトの皮膚の基礎栄養ならびに弾力性の欠損と密接に関連している［７，８］。

経口的に、あるいは、局所的に適用され、そして、適切に送達されると、アミノ酸とオリゴペプチドの特定の組み合わせは、真皮表皮結合組織、粘膜ならびに関節の軟骨中における、新たなタンパク質合成、特に、コラーゲンならびにトロポエラスチンの合成を起こさせる、遺伝子の発現を促進することが知られている［９，１０，１１，１２］．
皮膚の老化および光老化における、真皮表皮組織の弾性機能の進行性低下に関与する、主要な現象の一つは、皮膚の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ならびに、コラーゲンとエラスチン タンパク質の再生を担当する細胞である、繊維芽細胞による生合成活性の進行性欠失により、代表される。この現象の結果、新たな構造性の皮膚タンパク質ならびに親水性の細胞外マトリックスの合成が不十分または低い場合には、エラスターゼ、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼおよびゲラチナーゼと称される、特異的な分解酵素による、それらの分解が増加する［１３，１４，１５］。加齢繊維芽細胞のミトコンドリア、ならびに、マクロファージ内で、高発現され、そして、合成される、前記の酵素が、「合成−破砕」平衡を、破砕側にシフトさせると、緩やかであるが、しかし進行性である、組織の劣化に誘導され、そして、組織は、緻密さの低下、弾力性の低下、ならびに、含水性の低下（ＧＡＧ，ＰＧ，ならびに、繊維状エラスチン成分の不足）となる。部分的には生理的であるが、種々の環境的ならびに遺伝子的要因により悪化されている、前記の現象を、阻害、少なくとも、限定するためには、後者が存在している、全ての領域においては、繊維芽細胞中の構造性タンパク質（トロポエラスチンおよびコラーゲン）の合成を誘導する、遺伝子の発現を促進する、そして、同時に、メタロプロテアーゼ、特には、コラーゲンとエラスチンの劣化に特異的なもの（コラゲナーゼとエラスターゼ）のコードに関与する、遺伝子の発現を低減させることが必要である。

マトリックスを分解する酵素、特には、コラゲナーゼならびにエラスターゼの、遺伝子の過剰発現により媒介される、増加された分解活性を考慮すると、前記酵素の発現を阻害する、判明している活性を具える物質の、真皮表皮組織、粘膜あるいは関節中に直接、局所的あるいは注入適用は、特に、戦略的に重要である。特には、イオウ含有アミノ酸 Ｌ−システインのＮ−アセチル化体である、Ｎ−アセチルシステインは、光照射により誘導される、メタロエラスターゼの発現を阻害する、明白な作用を発揮する［１６］。抗エラスターゼ活性ならびに抗コラゲナーゼ活性を奏する、多アミノ酸組成物中への、その同時導入は、結合組織のエラスチンとコラーゲンの含有量の回復なたびに維持を促進するために、有利に使用可能である。

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、結合組織のアモルファス状間質性マトリックス中に存在する、主要なＧＡＧである。

ＧＡＧｓ（グリコサミノグリカン）は、一または二糖の繰り返し単位で構成される、多糖分子である；ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル グリコサミンとグルクロン酸で構成される、ポリ−グルコダイマーである。ＨＡは、その分子中に硫酸基を含んでいない、唯一のＧＡＧであり、そして、非分岐の直鎖構造を具えている、唯一のＧＡＧである。結合組織のアモルファス状のマトリックス中に存在する、その他のＧＡＧｓ、ならびに、腱や軟骨等の、その他の結合組織構造の成分は、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ならびにヘパリンである。ＨＡは、ＥＣＭ中において、重要な水和機能を発揮し、細胞の運動性、栄養素ならびに水溶性タンパク質因子の交換を促進し、そして、繊維質の結合組織マトリックスの再生ならびに組織化の生化学的現象を調節している。

EP 2 033 689 A1, WO 2007/048522 A1, WO 2011/064297 A1中に、注入用、外用、あるいは、経口用のアミノ酸の混合物が開示されている。しかし、コラーゲンとエラスチンの両方の合成の活性化が可能である、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩の、適する比率の混合物を含有している、組成物は、開示されていない。

図１は、翻訳後試験の結果を示すグラフである。 図２は、トランスクリプトーム解析法の原理に基づき実施される、単層のヒト線維芽細胞試験の結果を示すグラフである。

発明の開示
本発明は、トロポエラスチン（ＥＬＮ）、リシンオキシダーゼ（ＬＯＸＬ−１）ならびにＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬ４Ａ１）をコードする遺伝子の発現を選択的に誘起し、また、メタロエラスターゼ類をコードする遺伝子の発現を阻害する、アミノ酸の混合物を含有する組成物に関する。

本発明にかかる、アミノ酸の混合物は、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩を、下記の質量比で含んでなる。

Ｌ−システインないしはＮ−アセチル−システインも、全アミノ酸混合物の１〜２０質量％の範囲の重量比率で、存在することができる。

好ましい質量比は、

または、

または、

または、

である。

前記組成物は、液剤、顆粒剤、分散性粉末剤、錠剤、あるいは、カプセル剤等の、経口投与に適する形状であることができる。

本発明にかかる、アミノ酸の混合物は、また、５００，０００〜３．０００，０００ Ｄａの範囲の平均分子量を具える、ヒアルロン酸ないしはその塩、特には、ヒアルロン酸ナトリウムを、全組成物の０．０１〜３質量％の範囲の重量比率で、含有していることができる。上述のアミノ酸の混合物ならびにヒアルロン酸を含有している、前記組成物は、外用あるいは注入用に適している。使用可能な剤型の例は、ゲル、軟膏、乳剤、経皮吸収パッチ、滅菌溶液、ならびに、ヒアルロン酸塩の滅菌水性溶液を用いて再構成するように設計されている、滅菌アミノ酸粉末を含んでいる。

経口製剤の場合、グリシンの単位用量は、１００ｍｇ〜１５００ｍｇの範囲内で変動する。

注射用製剤の場合、グリシンの単位用量は、１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲内で、そして、ヒアルロン酸ないしはそのナトリウム塩の単位用量は、１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲内で変動する。

本発明にかかる組成物は、弾性繊維症、光老化により引き起こされる真皮表皮萎縮、真皮萎縮性および医原性の起因を伴う皮膚障害［１７］、（放射線熱傷をはじめとする）熱傷、皮膚病変、褥瘡（床擦れ）、薬物（抗レトロウイルス剤、抗ＨＩＶ薬、副腎皮質ステロイド薬あるいは抗がん剤治療）に起因する皮膚形成不全、腱および関節の病変の治療において、有用である、
イン ビトロにおける、トランスクリプトーム解析ならびにプロテオーム解析を用いることで、ヒト線維芽細胞を１２０時間培養すると、トロポエラスチン（ＥＬＮ）ならびにＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬＩＶ）をコードする遺伝子の発現の増加を、該アミノ酸の混合物が誘導することが見出された。驚くことに、該アミノ酸のうちの一つでも、除去されている、あるいは、重量比が、相違しているならば、前記の効果は、もはや、見出されない。

ナトリウム塩の形状のヒアルロン酸を用いて、ゲル化されている、水性溶液の形状での、アミノ酸の送達は、真皮マトリクスの柔軟性を回復させ、そして、所望の生理的効果を誘導するに十分な時間、真皮表皮領域内に、該アミノ酸類の保持を保証する。

注射用製剤は、(例えば、経皮インプラント用シリンジを用いて、)粉末を含有しているバイアル中に直接、ヒアルロン酸（ナトリウム塩）ゲルを導入することで、ヒアルロン酸ナトリウム塩の滅菌水性溶液中に、滅菌粉末の形状のアミノ酸を溶解することで、調製することができる。完全に溶解させて、得られたゲル溶液を、真皮表皮の領域中に注入する。

ヒアルロン酸ナトリウム塩の滅菌水性溶液は、ｐＨ調整用緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）あるいは浸透圧調製剤（例えば、塩化ナトリウム）、ならびに、滅菌注射用医薬剤形に要求される、物理化学的ならびに組織適合性の特性を保証することが可能な、その他の技術的な補助剤を含有することができる。下記の事例中において、本発明を詳しく説明する。

例１
ヒアルロン酸ナトリウム塩の滅菌水性溶液

滅菌アミノ酸粉末

例２
ヒアルロン酸ナトリウム塩の滅菌水性溶液

滅菌アミノ酸粉末

例３
ヒアルロン酸ナトリウム塩の滅菌水性溶液

滅菌アミノ酸粉末

例４
アミノ酸とヒアルロン酸ナトリウム塩に基づく、局所用ハイドロゲル

例５
経口用溶液用の小袋（スティックパック）

添加物：
保存剤：安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム；
ｐＨ調整剤：クエン酸、クエン酸ナトリウム。

有効性試験
細胞外マトリックスの構造性成分の産生、特には、エラスチンの新たな合成を活性化し、ならびに、弾性繊維のより効率的な沈積（弾性繊維形成）を容易にし、同時に、コラーゲンの活性化を持続させることにおける、本発明にかかるアミノ酸混合物の有効性を、対照混合物ならびにヒアルロン酸混合物との比較によって、評価した。

標準化された、ヒト繊維芽細胞の初代培養物を使用した。エラスチンとコラーゲンの遺伝子発現を評価するため、試験系の設計を組み立てた。遺伝子の発現は、下記の時刻：２４時間、７２時間、１２０時間後において、ＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した。前記マトリックス タンパク質の産生は、１２０時間後において、ウエスタン ブロット法により評価した。

細胞毒性を示さない、試験される最大濃度を特定するため、前記アミノ酸およびヒアルロン酸の混合物の細胞毒性の事前評価を実施した。取得されたデータに基づいて、１０００ μｇ/ｍｌの濃度を選定した。

転写試験の結果
この試験には、処理を施していない繊維芽細胞（生理学的応答）に相当する、陰性対照が含まれている。コラーゲンを構成しているアミノ酸（Ｇｌｙ，Ｌ−Ｐｒｏ，Ｌ−Ｌｙｓ，Ｌ−ｌｅｕ）のみで構成されている、混合物Ａは、有意な遺伝子発現を誘起しなかった。反対に、試験した６種のアミノ酸を含有する、コラーゲンとエラスチンの双方中で、最も発現されているアミノ酸からなる、二つの混合物ＣおよびＤは、１２０時間後、ＥＬＮ（エラスチン）遺伝子ならびにＣＯＬＩＶ（ＩＶ型コラーゲン）遺伝子の有意な変化を引き起こした。

試験された混合物の組成を、下記の表に示す。

対照との比較により、定量化された、ＥＬＮ（エラスチン）遺伝子ならびにＣＯＬＩＶ（ＩＶ型コラーゲン）遺伝子の発現

図１は、翻訳後試験の結果を示す。

グラフ中に示すように、混合物Ａは、コラーゲンの産生の増加のみを引き起こすが、混合物ＣおよびＤは、エラスチンとＩＶ型コラーゲンの双方の産生を有意に調節している。

基準として、ＮＣを使用した、ＩＶ型コラーゲンとエラスチン タンパク質の相対的定量

考察
図２中のグラフは、必要に応じて、ヒアルロン酸の組み合わせた、特定のアミノ酸混合物のみが、細胞外マトリックス タンパク質の生合成を調節することができ、特には、弾性繊維形成を促進できることを査証する、トランスクリプトーム解析法に基づいて実施された、単層ヒト繊維芽細胞試験の結果を示している。本出願中に開示される比率に従って組み合わされた、アミノ酸混合物のみが、コラーゲン（特には、ＩＶ型コラーゲン）の活性化をさらに高めるとともに、エラスチンの遺伝子ならびにタンパク質の発現を増加させている。

該マトリックスの完成度と品質は、コラーゲンにのみ限定させてなく、繊維芽細胞により生産される、構造性タンパク質の全て、特には、エラスチンの生産と生理学的な相互作用にも、限定されていることは、特に言及するべきである。

実際、コラーゲンとエラスチンが、加齢とともに失われる特徴である、マトリックス中の異方性、すなわち、張力を伝搬するために産生された繊維の能力を維持している。

エラスチンの出現は、素早く、不規則であり、そして、誘導されたエラスターゼによって、実際に、劣化が引き起こされる、ＵＶ照射に対する応答とは全く異なる、動態での、生理学的なエラスチン 遺伝子の誘導を、問題のアミノ酸混合物は引き起こすことをも、証明している。

結論
この試験の結果は、本発明にかかる混合物のみは、該二種のタンパク質の有意な産生を促進していることを査証している。従って、誘導する機構が存在することのみでなく、産生されるｍＲＮＡは、機能性のタンパク質をコードしていることも、査証している。

参考文献
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Claims (11)

1. 有効成分として、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩を、下記の質量比で含んでなる、アミノ酸の混合物を含有しているトロポエラスチン（ＥＬＮ）ならびにＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬＩＶ）をコードする遺伝子の発現を選択的に誘起するための組成物：
   

   
2. Ｌ−システインないしはＮ−アセチル−システインを、全アミノ酸混合物の１〜２０質量％の範囲の重量比率で、さらに含有していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記アミノ酸の質量比は、下記の比である：
   

   

   ことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記アミノ酸の質量比は、下記の比である：
   

   

   ことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
5. 前記アミノ酸の質量比は、下記の比である：
   

   

   ことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
6. 経口用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 液剤、顆粒剤、分散性粉末剤、錠剤、あるいは、カプセル剤の形状である、請求項６に記載の組成物。
8. ５００，０００〜３．０００，０００ Ｄａの範囲の平均分子量を具える、ヒアルロン酸ないしはその塩を、全アミノ酸混合物の０．０１〜３質量％の範囲の重量比率で、さらに含有している
   ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ヒアルロン酸ないしはその塩が、ヒアルロン酸ナトリウムである請求項８に記載の組成物。
10. 外用または、注入用である、請求項８または９に記載の組成物。
11. ゲル、軟膏、乳剤、経皮吸収パッチ、滅菌溶液、または、ヒアルロン酸塩の滅菌水性溶液を用いて再構成するように設計されている、滅菌アミノ酸粉末の形状である、請求項１０に記載の組成物。

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