CN103181902B - 一种凝胶微球及其质控方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种交联透明质酸凝胶微球及其质控方法，本发明的交联凝胶可以是单层球也可以是双层球，溶胀度小于15，两种交联剂残留小于0.5ug/g，本发明凝胶微球具有更好的生物安全性，可应用于美容方面的组织填充材料。

Description

一种凝胶微球及其质控方法

技术领域

本发明涉及一种交联透明质酸或其盐凝胶及其质量控制方法，有本发明凝胶制备的产品可应用于美容和医疗领域。

技术背景

透明质酸(HA)是存在于生物组织中细胞外基质的一种直链线性阴离子多糖，是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织得重要组成部分，其分子量数量级为10⁴～10⁷，在稀溶液中，HA分子任意卷曲形成高度粘弹性透明胶体，这一性质使其作为粘弹性生物材料应用于眼科显微手术和膝关节腔内注射治疗骨关节病；另外一个重要性质是它具有很强的保水性可以避免皮肤干燥，因此用于化妆品中。天然的HA容易被机体中的透明质酸酶降解，良好的水溶性在组织中容易扩散，在组织中的存留时间短。

化学交联是改变HA结构，有效提高HA分子量，延长降解时间，增强机械稳定性的主要手段之一。交联的目的是使水溶性高分子的分子量和分子体积显著增大，形成连绵的网状结构，在水中可溶胀但不再溶解。由交联程度的不同来制备高度溶胀的凝胶或本质不溶的产物。通过交联反应使透明质酸分子延长、改变其溶解性，从而提高机械强度和抵御机体的降解作用。交联度可根据交联剂的使用量和反应时间来控制。

现已有多种方法对HA进行交联。HA分子中，羟基，羧基、N-乙酰氨基以及还原末端是可被化学修饰的四个部位，用了双环氧基化合物、双碳化二亚胺、脂肪双酰肼、二乙烯基砜、戊二醛等双功能试剂。这些试剂和HA的活性羟基或羧基作用，通过新合成的醚键或酯键实现HA分子内和分子间的交联，可合成HA交联网状结构。上述不管是哪一类交联剂都具有一定的毒性，解决交联剂的残留是一方面内容，降低交联剂的用量，提高产品的安全性的同时并不必降低产品的性能，是我们追求的目标，

CN1342171A公开了采用1，4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂制备透明质酸凝胶，再通过挤压装置，获得500～2000μm的凝胶微球。专利中交联剂的所用量与透明质酸钠等量，交联剂的较大用量无疑给产品的安全性带来挑战，用挤压装置来制备符合粒径的凝胶微球，效率低下，不适合批量生产；CN101594892A也采取同样的交联剂，通过增大透明质酸的反应浓度，降低了交联剂的用量，制得的凝胶通过搅拌器均质分散，专利中的凝胶粒径控制困难，粒径分布宽，形状不规整。CN101056891也公开了交联透明质酸凝胶的制备方法，交联剂的浓度降低到1％时，为获得与前面相同物理性能的凝胶，提高透明质酸水溶液浓度达30％以上，需要设计特殊的装置进行搅拌来保证透明质酸混合均匀，专利中也并未给出块状凝胶的处理和使用方法。

US20040127698公布了采用双环氧基化合物和双碳化二亚胺两种交联剂来制备透明质酸凝胶，获得耐酶降解性能更好的透明质酸材料。US6969531采用己二酰肼作为交联剂制备透明质酸凝胶微球，交联剂的添加量是透明质酸钠的0.5-1倍。

针对以上提出的问题，本发明选用双环氧基化合物、二乙烯基砜(DVS)对透明质酸进行二次交联，获得凝胶耐酶解性能更好的凝胶产品，本发明凝胶溶胀度小于15，两种交联剂残留分别小于0.5g/g，具有更好的安全性和耐酶解性能，更大限度发挥凝胶作为组织填充剂的功效，同时具有良好的润滑性、粘弹性、生物相容性和非免疫原性，与其他组织填充材料相比具有较大的优越性，获得交联凝胶的制备工艺简单，有利于大规模生产。

凝胶的溶胀度大小跟耐酶解性能密切相关，耐酶解性能，是交联凝胶产品的考察指标之一，这个指标直接关系到凝胶作为组织填充剂填充效果，以及有效填充时间。溶胀度越小，耐酶解性能越好，目前尚未检索到该类凝胶产品溶胀度小于等于15，交联剂残留是凝胶进入体内造成过敏反应的重要因素，残留控制对注射用凝胶尤其重要，目前也尚未检索到相关产品明确指出交联剂残留控制在0.5ug/g。

胶原是美容行业广泛使用的物质，其中交联胶原也是可以皮下植入的材料，由于单独使用交联胶原植入，降解速度较快，制成本发明双层球后，大大延缓了其降解时间，美容填充效果更为持久。

发明内容

本发明的目的是提供一种经过二次交联透明质酸凝胶，具备更加出色的耐酶解性能，以及使用该凝胶用于制备美容或者医用的注射剂，如制备用于消除面部皱纹的皮内或者皮下注射剂，或者用于治疗关节炎的关节腔注射剂。

本发明一种交联透明质酸凝胶微球及其质控方法，其特征在于可以是单层球也可以是双层球，凝胶溶胀度小于等于15，两种交联剂残留均小于0.5ug/g。

所述的交联透明质酸凝胶中的单层球为交联透明质酸凝胶微球，该交联透明质酸凝胶经过二次交联获得，具体制备方法包括如下：

(a)透明质酸或其盐和交联剂1溶解在碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的浓度10％～40％，在20～100℃温度下反应一段时间，获得一次交联凝胶；

(b)反应完成后，将含有交联剂2的水溶液中倒入步骤a的凝胶中，在20～100℃温度下浸泡反应一段时间，获得二次交联凝胶；

(c)破碎、洗涤、过滤后得即得交联透明质酸凝胶微球；

(d)将凝胶微球与一定浓度的透明质或胶原酸磷酸盐缓冲液混合均匀，灭菌既获得可注射制剂。

所述的交联透明质酸凝胶中的双层球，内球为交联胶原，外层包裹交联透明质酸凝胶形成外球，具体制备方法包括如下：

(a)取纯化后的胶原加适量酸溶解后中和，形成胶冻状，微孔挤压制成10-100um的微球，干燥后辐射交联制成交联微球。

(b)透明质酸或其盐和交联剂1溶解在碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的浓度10％～40％，在20～100℃温度下反应一段时间，获得一次交联凝胶，调节PH为中性；

(c)在(b)中制备的凝胶中加入(a)法制备的胶原交联微球，充分混合后投入加入含有交联剂2的水溶液中，在20～100℃温度下浸泡反应一段时间，获得二次交联双层凝胶；

(d)挤压破碎、洗涤、过滤后得即得交联透明质酸凝胶微球；

(e)将凝胶微球与一定浓度的透明质或胶原酸磷酸盐缓冲液混合均匀，湿热灭菌既获得可注射制剂。

本发明透明质酸或其盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁透明质酸铵透明质酸锌中的任意一种、任意两种或者两种以上混合物，优选透明质酸钠。

透明质酸原料来源可以通过动物组织提取，亦可通过微生物发酵获取。

透明质酸选用的分子量为70万至260万道尔顿，优选100～150万道尔顿。

制备过程中交联剂1和交联剂2可选自双环氧基化合物、二乙烯基砜(DVS)，两种交联剂的使用顺序可互换，双环氧基化合物优选1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，两种交联剂用量均在HA的0.1％～10％(w/w)。

制备过程中使用到碱溶液，可以是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙，所用浓度0.001～2mol/L，优选0.01～0.5mol/L。

在二次交联过程中添加的交联剂2水溶液用量为HA用量的20～40倍。

本发明制备的交联凝胶微球的大小可以控制在50～2000μm范围内，凝胶粒径的大小可以根据用途做出更合适的选择。

本发明凝胶制备的反应温度设定在在20～100℃之间。

本发明胶原购自市售的酸溶胶原或可容性胶原。

本发明制备交联凝胶微球，可用于组织填充材料以及药物载体。

下面结合实施例进一步阐述发明内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。

交联凝胶质量控制

1.交联剂二乙烯基砜(DVS)残留的测定

1仪器与试剂

气相：岛津GC-2010或类似仪器

色谱条件：色谱柱：RTX-5，30m×0.25μm×0.25mm，或类似色谱柱；

载气：氦气或氮气，99.999％；检测器：FID，柱流量：1.0mL/min

炉温：80℃，保持3分钟；以16℃/分钟升到290℃，保持3分钟。进样口温度：150℃；检测器温度300℃，进样量1μL，分流比5∶1

二乙烯基砜：含量≥99％

无水乙醇：GR，含量≥99.8％

2标准溶液配制：

精密称取二乙烯基砜0.1g左右，纯化水定容至1000mL，作为储备液，浓度为100μg/ml左右。取该溶液10mL于50ml容量瓶中，用无水乙醇定容，浓度为20μg/mL左右。再用无水乙醇依次稀释，配成浓度为0.3-10μg/mL范围内的工作液。

3样品检验液制备

精密称取样品2g左右，加入2倍体积(g：mL)无水乙醇，经漩涡振荡，至出现白色沉淀。静置，取上清液过滤，即得检验液。

4气相测试

依次测定无水乙醇空白，系列标准工作液，样品。

5结果

用外标法计算二乙烯基砜的残留量。

2.交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)的残留量测定

1目的

对交联透明质酸钠凝胶中的交联剂1，4-丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)的残留量进行测定，要求BDDE的残留量小于2ug/g。

2原理

本方法是检测环氧化合物高灵敏度的方法。环氧化合物与烟碱反应在激发光370nm作用下产生荧光，其荧光强度与环氧化合物的量成正比，荧光分光光度计在发射波长为430nm处可检测其荧光强度。

3仪器与试剂

多功能酶标仪、分析天平、恒温水浴锅、微量加样器、透明质酸酶(Sigma公司)、1，4丁二醇二缩水甘油基醚(Sigma公司95％)、尼克酰胺(Sigma公司)、苯乙酮(Sigma公司99％)、PBS(中山公司0.0667mol/L)、氢氧化钾(分析纯＞82％)、甲酸(分析纯＞88％)、乙醇(分析纯＞99.5％)

4溶液配制

2.0mg/mLBDDE标准储备液：精密称取0.1g的95％BDDE置50mL容量瓶中，加纯化水定容，混匀，备用。

125mmol/L尼克酰胺溶液：精密称取0.7630～0.7635g尼克酰胺置50mL容量瓶中，加纯化水定容，混匀，备用。

15％苯乙酮溶液：移取1.5mL苯乙酮溶液置10mL容量瓶中，加无水乙醇定容，混匀备用(因苯乙酮在水中的溶解度不好，故此处用无水乙醇)。

1mol/l氢氧化钾溶液：精密称取7.0g氢氧化钾，溶解于15mL纯水中(放置冰面上)，置100mL容量瓶中，用纯化水定容。混匀保存在具塞瓶中静置24小时，取上清液备用。(氢氧化钾为分析纯，含量＞82％)

3mg/ml透明质酸酶溶液：称取30mg透明质酸酶用纯水定容于10mL容量瓶。取80uL于effendoff管中，临用前配制。

5实验步骤

5.1系列标准溶液配制

a：取1mL的2.0mg/mLBDDE标准储备液纯化水定容至25ml，得到80ug/mLBDDE溶液

b：取1mL的80ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到8.0ug/mLBDDE溶液

c：取5mL的8.0ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到4.0ug/mLBDDE溶液

d：取5mL的4.0ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到2.0ug/mLBDDE溶液

e：取5mL的2.0ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到1.0ug/mLBDDE溶液

f：取5mL的1.0ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到0.5ug/mLBDDE溶液

g：取5mL的0.5ug/mLBDDE溶液纯化水定容至10ml，得到0.25ug/mLBDDE溶液

5.2标准曲线制作

精密量取各浓度标准溶液20uL加10uL的125mmol/L尼克酰胺溶液混合，在37℃下水浴120min。离心甩下壁上水分，向其中加入0.1mL的15％苯乙酮溶液和0.1mL的1mol/L氢氧化钾溶液，混匀后置冰上10min。加入0.5mL甲酸溶液，在60℃下水浴5min，随后在冰上冷却。在室温下10-15min后，用多功能酶标仪测定荧光值，激发和发射波长分别为370nm和430nm。

5.3样品测定

精密称取80.8mg交联透明质酸钠凝胶样品(根据交联透明质酸钠凝胶的密度(1.01g/mL)计算所称取样品的体积)，然后加等体积的透明质酸酶溶液，水浴摇床37℃，70r/min，24小时后获得交联透明质酸钠凝胶酶解液。移取交联透明质酸钠凝胶酶解液20ul加10ul的125mmol/L尼克酰胺溶液混合，其余操作同“5.2标准曲线制作”。

5.4回收率实验

精密量取交联透明质酸钠凝胶酶解液10uL，平行取6份。向其中的3份分别加入4.0ug/mL的标准溶液10uL，向另外的3份分别加入1.0ug/mL的标准溶液10uL，混匀，分别加10uL的125mmol/L尼克酰胺溶液混合，其余操作同“5.2标准曲线制作”。

5.5精密度实验

2.0ug/mL的标准溶液重复测定5次，计算结果的RSD％。

3.交联透明质酸钠溶胀度计算方法

1目的

溶胀度是体现水凝胶亲水性能的重要的物理参数，本方法定量测定交联透明质酸钠凝胶的溶胀度。

2原理

交联透明质酸钠凝胶保留了透明质酸钠与水亲和的性质。交联透明质酸钠的饱和水凝胶的含水量多少与交联透明质酸钠的密度(即交联透明质酸钠凝胶三维网格的大小)呈正相关。溶胀度是评价交联透明质酸钠凝胶的结构的量化指标。在80℃的温度下烘干至恒重时，滴加水至膨胀后，分别测得烘干后质量m₁与膨胀后质量m₂。通过公式Q＝(m₂-m₁)/m₁计算其溶胀度。

3仪器

干燥箱、培养皿、电子天平

4实验方法

4.1分别将约0.2g交联透明质酸钠凝胶置于两个培养皿上。

4.2将两个培养皿放入干燥箱中，调节温度至80℃，至恒重。

4.3称重，烘干后的交联透明质酸钠凝胶质量m₁。

4.4滴加水至膨胀，除去多余的水分，测得膨胀后的交联透明质酸钠的质量m₂。

4.5根据溶胀度计算公式Q＝(m₂-m₁)/m₁计算溶胀度。

说明书附图

图1透明质酸凝胶的化学交联反应

图2透明质酸凝胶的化学交联反应

图3实施例1，实施例3推挤力试验

图4实施例1-4的酶降解试验

具体实施方式

实施例1透明质酸凝胶微球的制备

a.别取1g透明质酸或其盐(平均分子量120万)和80uL的二乙烯基砜置于pH13的碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的溶液浓度25％，在25℃温度下反应24h，获得一次交联凝胶；

b.反应完成后，将30mL含有1，4-丁二醇二缩水甘油醚(10uL)的水溶液中倒入步骤a的凝胶中，25℃浸泡反应10h，获得二次交联凝胶；

c.将凝胶挤压透过不锈钢滤膜，获得理想粒径的凝胶微球。

d.洗涤、过滤后，除去交联剂小分子，调节pH值至中性，即获得理想交联凝胶微球。凝胶的溶胀度为9，交联剂残留量测定低于0.4ug/g。。

e.将凝胶微球与含有1％透明质酸的磷酸盐缓冲液(每1000mL含有NaH2PO4·2H2O45mg，Na2HPO4·12H2O0.56g，NaCl8.5g)混合，配制成注射凝胶溶胶，透明质酸的有效含量2％。灌装，高压蒸汽灭菌，即得。

实施例2透明质酸凝胶微球的制备

a.分别取1g透明质酸或其盐(平均分子量120万)和0.5ml的1，4-丁二醇二缩水甘油醚置于pH13的碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的溶液浓度15％，在60℃温度下反应24h，获得一次交联凝胶，其化学交联反应方程参见附图1；

b.反应完成后，将30mL含有二乙烯基砜(0.2ml)的水溶液中倒入步骤a的凝胶中，60℃浸泡反应10h，获得二次交联凝胶，其化学交联反应方程参见附图2；

c.将凝胶挤压过膜，获得理想粒径的凝胶微球。

d.洗涤、过滤后，除去交联剂小分子，调节pH值至中性，即获得理想交联凝胶微球。凝胶的溶胀度测定为12，交联剂残留量测定低于0.4ug/g。

e.将凝胶微球与含有1％透明质酸的磷酸盐缓冲液(每1000mL含有NaH₂PO₄·2H₂O45mg，Na₂HPO₄·12H₂O0.56g，NaCl8.5g)混合，配制成注射凝胶溶胶，透明质酸的有效含量2％。灌装，高压蒸汽灭菌，即得。

实施例3双层凝胶微球的制备

a.取纯化后的胶原10g加适量醋酸(10％)溶解后，缓慢滴加0.1％的NaOH中和，形成胶冻状，通过微孔挤压制成10-100um的微球，干燥后辐射交联制成交联微球。

b.透明质酸或其盐100g和交联剂1溶解在碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的浓度10％～40％，在20～100℃温度下反应一段时间，获得一次交联凝胶，调节PH为中性；

c.在(b)中制备的凝胶中加入(a)法制备的胶原交联微球，充分混合后投入加入含有交联剂2的水溶液中，在20～100℃温度下浸泡反应一段时间，获得二次交联双层凝胶；

d.挤压破碎、洗涤、过滤后得即得双层交联透明质酸凝胶微球；

e.将凝胶微球与一定浓度的透明质或胶原酸磷酸盐缓冲液混合均匀，湿热灭菌既获得可注射制剂。

实施例4透明质酸凝胶微球的制备

a.分别取1g透明质酸或其盐(平均分子量120万)和150uL的二乙烯基砜置于pH13的碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的溶液浓度25％，在40℃温度下反应24h，获得一次交联凝胶；

b.反应完成后，将30mL含有1，4-丁二醇二缩水甘油醚(100uL)的水溶液中倒入步骤a的凝胶中，40℃浸泡反应10h，获得二次交联凝胶；

c.将凝胶挤压透过不锈钢滤膜，获得理想粒径的凝胶微球。

d.洗涤、过滤后，除去交联剂小分子，调节pH值至中性，即获得理想交联凝胶微球。凝胶的溶胀度为15，交联剂残留量测定低于0.3ug/g。。

e.将凝胶微球与含有1％透明质酸的磷酸盐缓冲液(每1000mL含有NaH₂PO₄·2H₂O45mg，Na₂HPO₄·12H₂O0.56g，NaCl8.5g)混合，配制成注射凝胶溶胶，透明质酸的有效含量2％。灌装，高压蒸汽灭菌，即得。

实施例5四种实施例中产品的酶降解试验

考察凝胶的耐酶解性能，是交联凝胶产品的考察指标之一，这个指标直接关系到凝胶作为组织填充剂填充效果，以及有效填充时间。

本文采用硫酸咔哇法测定HA的葡萄糖醛酸含量，其原理为：HA在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，成为单糖，单糖在强酸条件下与咔哇显色呈桃红色。在波长530nm左右处和一定浓度范围内，其吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

操作步骤

a.硼砂硫酸试剂配制：称取四硼酸钠4.77g，溶于浓硫酸(AR)500mL中即得；咔唑试剂配制：称取咔唑0.125g，溶于无水乙醇(AR)100mL中，置于棕色试剂瓶中冰箱内保存。

b.透明质酸酶溶液的配制：根据产品外包装上显示酶活性单位，配制50units/mL(取均值)，用pH7.4磷酸盐缓冲液，要保证水的纯净，蒸馏水。

c.标准曲线的制作：精密称取透明质酸钠20mg，置于100mL量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。精密量取标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别加入20mL量瓶中，加水稀释至刻度，得20、40、60、80、100ug/mL浓度的对照品溶液(可多配制几个浓度，检测时去除误差较大的浓度)。取6只具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸液5mL，置冰浴中冷至4℃左右。不同浓度的对照品溶液各1.0mL加人试管中，先轻轻振摇，再充分混匀，并不断用冰浴冷却，将试管置沸水中加热10min，置水中冷至室温。加入咔唑试剂0.2mL，混匀，沸水浴中再加热15min，冷至室温。在530nm处测定吸光度A，以吸光度对浓度c作图即可绘出标准曲线或作直线回归数据处理，计算出y和x的线性回归方程。

d.将实施例1，2，3，4中的样品用酶溶液配制成HA浓度均为2mg/mL，置于37℃条件下培养，每隔24小时1毫升上层澄清液，咔唑法测交联凝胶的降解曲线。

试验结果分析：如图4所示，凝胶在酶溶度50units/mL下的降解曲线。实施例4凝胶溶胀度15，酶降解速度最慢，在六天后，仅降解3％。

实施例6，实施例2中产品的推挤力试验

通过推挤力试验，了解交联透明质酸钠凝胶实际使用时的状况，以作为产品品质的评估指标之一。本试验以恒定的速度推动注射器推进杆，实验时，安装上注射针，模拟实际使用情况。以恒定速度推动推进杆，注射器中的样品经由针头被推挤出。得到推挤力曲线。由推挤力曲线可以看出样品挤出过程中推挤力的变化，推挤力小，样品容易被挤出，推挤力大，样品不容易被挤出；另外，推挤力的高低落差大，表明样品有分散不均或聚集浓缩现象，这样也会影响注射时的适手性。

检测仪器为万能材料试验机；实验方法为样品于测试前须冷藏2-10℃保存，测试前测试验品在室温25℃放置2h，样品测试前在1ml注射器中装入凝胶样品，并安装上27G注射针，万能试验机的推动速度设定为30mm/min。

从图3推挤力实验中可以看出，样品的推挤力均在6-8N左右，有利于操作人员的实施治疗。

Claims (4)

1.一种交联透明质酸凝胶微球，其特征在于交联透明质酸凝胶微球是双层球，其中内球为交联胶原，外球为交联透明质酸凝胶，具体制备方法包括：

(a)取纯化后的胶原加适量酸溶解后中和，形成胶冻状，微孔挤压制成10-100μm的微球，干燥后辐射交联制成交联微球；

(b)透明质酸或其盐和交联剂1溶解在碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的浓度10％～40％，在20～100℃温度下反应一段时间，获得一次交联凝胶，调节pH为中性；

(c)在(b)中制备的凝胶中加入(a)法制备的胶原交联微球，充分混合后投入加入含有交联剂2的水溶液中，在20～100℃温度下浸泡反应一段时间，获得二次交联双层凝胶；

(d)挤压破碎、洗涤、过滤后得即得交联透明质酸凝胶微球；

其中，交联剂1和交联剂2选自双环氧基化合物、二乙烯基砜，两种交联剂用量均在透明质酸的0.1％～10％w/w。

2.根据权利要求1所述的交联透明质酸凝胶微球，其特征在于双环氧基化合物为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

3.一种交联透明质酸凝胶微球的制备方法，其特征在于制备方法包括：

(a)取纯化后的胶原加适量酸溶解后中和，形成胶冻状，微孔挤压制成10-100μm的微球，干燥后辐射交联制成交联微球；

(b)透明质酸或其盐和交联剂1溶解在碱溶液中，搅拌均匀，透明质酸的浓度10％～40％，在20～100℃温度下反应一段时间，获得一次交联凝胶，调节pH为中性；

(c)在(b)中制备的凝胶中加入(a)法制备的胶原交联微球，充分混合后投入加入含有交联剂2的水溶液中，在20～100℃温度下浸泡反应一段时间，获得二次交联双层凝胶；

(d)挤压破碎、洗涤、过滤后得即得交联透明质酸凝胶微球；

其中，交联剂1和交联剂2选自双环氧基化合物、二乙烯基砜，两种交联剂用量均在透明质酸的0.1％～10％w/w。

4.根据权利要求3所述的交联透明质酸凝胶微球的制备方法，其特征在于双环氧基化合物为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。