CN117224742A - 一种人源的3d生物墨水及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人源的3D生物墨水及其制备方法和用途，具体地，本发明提供一种胎盘组织脱细胞细胞外基质及其制备方法，以及由此制得的生物墨水，及其在再生医学与组织工程中的用途。本发明制得的生物墨水具有良好的可打印性以及机械性能，可用于0.26mm甚至更细的打印针头，适用于打印具有更高精细度的结构；能够在37℃交联固化；具有良好的生物相容性，能够模拟特定细胞类型的体内微环境。
Description
技术领域
本发明属于再生医学与组织工程中的生物材料领域，具体涉及一种人源的3D生物墨水及其制备方法和用途，更具体的，本发明涉及从人胎盘中提取细胞外基质制备成生物打印墨水的方法，以及由此制备得到的生物墨水及其在再生医学与组织工程中的用途。
背景技术
随着3D生物打印技术的发展，将干细胞或功能细胞与3D生物打印墨水相混合，按照预先设定好的程序，通过挤出、喷墨、光刻等打印方式构建出具有特定形状和机械特性的人造组织和器官，并用于组织损伤修复甚至是器官移植，已经成为再生医学发展的新道路。在3D打印领域，3D生物打印墨水(bioink)扮演着最重要的角色，开发出一种对细胞无毒害作用、维持细胞活性、具有良好的机械性能、可降解、无免疫原性的材料，是3D生物打印的核心问题。现在用于3D打印的材料主要有两类，一类是天然生物材料，主要有胶原、壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白、透明质酸、明胶、琼脂糖、丝素蛋白等；另一类则是人工合成材料，包括聚氨酯、聚乙二醇、聚乳酸等。
从制造角度来说，为了保证更好的成形精度，需要更高的墨水浓度或交联密度，而这会对细胞的迁移增值造成很大的影响，同时高浓度的生物墨水也会增加打印的难度。然而，低浓度的墨水难以定形。由于需要在墨水中混入细胞，因而很多用于处理凝胶及增强凝胶强度或活性的方法不具有生物兼容性。理想的生物墨水要求合适的黏度、足够的强度、良好的生物兼容性及降解性。迄今为止找到一种合适的生物墨水仍然是一个巨大的挑战。
发明内容
现有用于3D打印的材料一个共同点是模拟细胞外基质(Extra Cellular Matrix，ECM)的结构与功能。天然ECM的组成与结构是复杂的，它包含多种蛋白质、糖胺聚糖等，具有与细胞进行相互作用的结构域，提供调控细胞命运的重要信号。所以，很难使用一种或几种组分来完全模拟天然ECM在结构、动力学、生物相容性和功能方面的性质，迄今也没有天然或合成材料可以完全重现天然ECM的所有特征。理想的bioink应该为细胞提供与其来源组织相似的原始微环境，因此，来源于组织脱细胞后的ECM(Organ-derived decellularizedECM，dECM)可以作为理想的bioink。
dECM来源比较丰富，比如心脏、真皮、膀胱、肝脏、血管、肌肉、软骨、脂肪等。物种方面，包括了牛、猪、山羊、大鼠/小鼠、兔、人等。dECM作为bioink已被证实具有良好的促进细胞贴附、生长、迁移、增殖的能力，在组织损伤修复与再造上也表现出来巨大的潜力。但作为一种天然产物，其免疫原性的问题不可以忽略，特别是异种来源，容易引起免疫排斥反应，对于临床应用存在着不可忽视的风险。即使是同种异体来源的dECM，如何尽量降低其免疫原性以满足临床需求，是切实需要解决的问题。
运用组织工程的手段在体外构建组织器官，最大的问题是血运的建立。一旦能通过人工的手段或诱导机体自身新生血管，将加快组织损伤修复的速度，促进功能的恢复。运用物理混合、化学修饰等手段将血管内皮生长因子(VEGF)等促进血管生成的信号分子结合到生物材料中去，以提高材料促进血管生成的能力，是最常见的策略。而理论上经过脱细胞后的细胞外基质本身应该结合有多种生长因子与细胞因子，特别是那些来自于血供丰富的组织器官的ECM，最典型的莫过于Matrigel。由于其富含多种生长因子与细胞因子，在干细胞、早期胚胎培养方面效果显著。
胎盘是人体内重要的免疫豁免区，可同时被母体和胎儿的免疫系统耐受，自身长期处于免疫抑制状态，这主要是因为胎盘的主要细胞类型不表达主要组织相容性复合体HLA-A，HLA-B类分子。因此，我们推测胎盘来源的ECM对人体应当具有更低的免疫原性。同时，作为重要的营养交换器官，胎盘是一个巨大的血窦，具有丰富的血管、绒毛，也含有大量的生长因子、细胞因子，所以胎盘来源的ECM可能更促进血管的新生。
现在的人胎盘ECM提取技术主要是组织匀浆技术(即将整个组织或器官直接进行粉碎化匀浆处理，然后离心洗涤去除上清，再加入SDS脱细胞，之后去除洗涤SDS，再进行酶解)，该技术具有两个主要缺点：一是不能有效分离除去血液成分、细胞内组分，这造成了潜在的免疫原性；二是这种技术在操作时容易造成原材料的浪费，减少得率。
因此，本发明采用灌流技术进行脱细胞处理，同时在所有制备操作中都尽量保持蛋白质的活性，进一步制备出了人胎盘来源生物打印墨水(human placenta derivedbioink，hp-bioink)，具有良好的生物活性，并表现出促进血管生成的特性，为3D打印的临床化研究提供了一种理想的打印材料。
在一个方面，本发明提供一种脱细胞细胞外基质，其通过下述方法制备得到：
(1)将哺乳动物胎盘组织进行脱细胞处理；
(2)将依照步骤(1)处理得到的脱细胞胎盘组织粉碎，酶解；
(3)将依照步骤(2)处理得到的材料离心并收集上清，透析，干燥，即得所述脱细胞细胞外基质。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述脱细胞处理是指分别用肝素钠溶液、SDS溶液(或EDTA溶液、脱氧胆酸钠溶液或月桂酸酯溶液)、DNase和RNase的Tris-HCl溶液、TritonX-100溶液以及PBS溶液(或去离子水)灌流处理所述哺乳动物胎盘。
在一些实施方案中，所述肝素钠溶液的浓度为100-100000U/L(例如，100U/L，500U/L，1000U/L，5000U/L，10000U/L，50000U/L或100000U/L)；优选用肝素钠溶液灌流处理1-2天。
在一些实施方案中，采用1-5个(例如，1、2、3、4或5个)浓度梯度对所述哺乳动物胎盘用SDS溶液灌流处理，优选的SDS溶液浓度梯度为5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05、0.025％、0.001％和0.01％中的任意3个(例如0.1％、0.01％和0.001％)；优选每个浓度下灌流处理1-5天(例如，3天)。
在一些实施方案中，所述DNase的浓度为10-100U/L(例如，10U/L，20U/L，30U/L，40U/L，50U/L，60U/L，70U/L，80U/L，90U/L或200U/L)。在一些实施方案中，RNase的浓度为1-20U/L(例如，1U/L，2U/L，5U/L，10U/L，15U/L或20U/L)。在一些实施方案中，用DNase和RNase的Tris-HCl溶液灌流处理10h-2天(例如，24h)。
在一些实施方案中，所述Triton X-100的浓度为0.05％-0.5％(例如0.1％)；优选用Triton X-100溶液灌流处理1-3天(例如，1天)。
在一些实施方案中，所述PBS溶液pH为7.0-7.5；优选用PBS溶液(或去离子水)灌流处理3天。
在一些实施方案中，上述各溶液灌流速度为0.5-50mL/min(例如，0.5mL/min，1mL/min，5mL/min，10mL/min，20mL/min，30mL/min，40mL/min或50mL/min)。
在一些实施方案中，在步骤(1)前，还包括去除所述哺乳动物胎盘母面羊膜、绒毛膜的步骤。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述酶解条件为：将粉碎的脱细胞胎盘组织加入0.1-1M醋酸溶液中，用胃蛋白酶处理。
在一些实施方案中，醋酸溶液的用量为每1g组织加入10mL-100mL醋酸溶液(例如10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，60mL，70mL，80mL，90mL或100mL)。
在一些实施方案中，所述胃蛋白酶的用量为每1g组织加入0.01-0.1g胃蛋白酶(例如0.01g，0.05g或0.1g)。
在一些实施方案中，在0-10℃(例如约4℃)下进行所述酶解，优选地，酶解1-5天(例如3天)。
在一些实施方案中，步骤(3)中所述离心条件为：10000-100000rpm(例如，50000rpm)，温度0-10℃。
在一些实施方案中，所述透析条件为：用截留量为1-30kDa(例如，3kDa)的透析膜在0-10℃(例如，约4℃)下处理1-7天(例如，5天)；优选地，每1-24小时(例如，12小时)换液一次。
在一些实施方案中，所述干燥为冻干。
在一些实施方案中，还包括对所述材料进行灭菌的步骤，优选地，采用紫外线灭菌处理。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
在另一个方面，本发明提供一种生物墨水，其通过以下方法制备得到：
将前文任一项所述的脱细胞细胞外基质制成浓度为0.8％-5％(例如，0.8％-3％或3％-5％，再例如1％，2％，3％，4％或5％)的具有生理pH和渗透压的溶液，即得所述生物墨水。
在一些实施方案中，所述生物墨水的pH为中性(例如7.0-7.4)。
在一些实施方案中，用PBS溶液调节所述生物墨水的渗透压至280-320mosm/L。
在一些实施方案中，所述生物墨水在25-38℃(例如，约25℃)固化。
在一些实施方案中，所述生物墨水中未额外添加具有交联固化功能的材料。
在一些实施方案中，所述生物墨水中还添加具有交联固化功能的材料。
在一些实施方案中，所述具有交联固化功能的材料选自NHS-PEG-NHS、alginate/Ca2+、谷氨酰胺转移酶和京尼平，优选为NHS-PEG-NHS。
在一些实施方案中，所述具有交联固化功能的材料的浓度为0.1％-1％，优选为0.25％。
在另一个方面，本发明提供一种生物打印平台，其包含前文任一项所述的生物墨水。
在一些实施方案中，所述脱细胞细胞外基质浓度为3％-5％，例如3％，4％或5％)。
在一些实施方案中，所述脱细胞细胞外基质浓度为0.8％-3％，例如1％，2％或3％；进一步优选地，所述生物打印平台进一步含有悬浮介质，优所述悬浮介质例如选自海藻酸钠、聚丙烯酸酯、黄原胶中的一种或多种，优选为海藻酸钠-黄原胶。
在另一个方面，本发明提供一种用于制备生物墨水的配套元件，其包含前文任一项所述的脱细胞细胞外基质，任选的，其进一步包括添加剂、缓冲溶液、溶剂、中和溶液及其任意组合。
在另一个方面，本发明提供一种配套元件，其包含前文任一项所述的生物墨水、生物打印平台或配套元件，任选的，其进一步包括导管或注射器。
在另一个方面，本发明提供一种3D打印方法，其包括前文任一项所述的生物墨水、生物打印平台或配套元件进行打印的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括将细胞加入所述生物墨水中的步骤。
在一些实施方案中，所述细胞选自MSC(例如，人脐带来源的间充质干细胞)和HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞)。
在一些实施方案中，所述方法还包括在打印前或打印对温度进行调节的步骤；优选地，在约4℃进行打印；优选地，在打印完成后调整温度至约37℃。
在另一个方面，本发明提供一种组织构建体，其通过前文所述的3D打印方法制备得到。
在一些实施方案中，所述组织选自神经组织、软骨组织、骨骼肌肉组织、肝脏组织、脂肪组织、血管组织、皮肤组织和角膜组织。
附图说明
图1说明了本发明的一般性制备流程，可表述为：胎盘预处理-灌流脱细胞-酶解-离心-透析-冻干-重溶-打印。依次为(A)预处理；(B)灌流；(C)酶解；(D)离心；(E)透析；(F)冻干；(G)重溶；(H)打印。其中图B为灌流结束脱细胞完成后的胎盘组织；图D为离心前(右)与离心后(左)的hp-bioink的对比；图F为冻干后的hp-bioink海绵；图G为重溶并调节pH为中性后的hp-bioink，左为低温流体状态，右为37℃固化后的状态。
图2显示灌流设备连接示意图。
图3显示灌流系统处理所得脱细胞胎盘组织宏观形貌。
图4显示灌流系统处理所得脱细胞胎盘组织染色与扫描电镜分析结果。
图5显示扫描电子显微镜拍摄的hp-bioink的微观结构图，放大倍数10000×。
图6显示hp-bioink在中性条件下随温度的升高而交联固化。
图7流变学测试显示hp-bioink随温度升高而交联。
图8流变学测试说明不同浓度hp-bioink均具有温度敏感性。
图9显示hp-bioink打印时的出丝情况。
图10显示使用hp-bioink打印的10mm×10mm的五层正方形模型。
图11显示在黄原胶-海藻酸钠悬浮浴体系中打印的网格图案(A，1％hp-bioink)与交通锥模型(B，2％hp-bioink)。
图12显示在hp-bioink中进行3D培养的HUVEC的生长状况。
图13显示1％hp-bioink与不同交联剂体系混合的细胞培养情况。
图14显示hp-bioink载细胞打印的能力。
图15显示使用5％hp-bioink打印的支架用于小鼠皮下移植。
图16显示hp-bioink支架在体内支持单核细胞浸润与血管生成。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中适用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，下面提供本说明书中的相关术语的定义和理解。当本说明书中给出的定义与本领域技术人员所通常理解的含义相冲突时，以本说明书中的定义为准。
如本文中所使用的，术语“生物墨水”是指可3D打印的细胞相容性材料。所述生物墨水可在0-37℃经针头挤出而后胶化或固化。其可配制成适用于喷墨式、激光烧断式或容积成型式等3D打印设备。
如本文中所使用的，术语“约”当用于可度量的数值时，如质量、剂量、时间、温度等时，意指包括具体量的±10％，±5％，±1％，±0.5％甚至±0.1％的变化范围。
如本文中所使用的，术语“细胞外基质”或“ECM”是指组织中细胞外的高分子。这些组织在体内发挥多种功能，例如构成基底膜、器官骨架、肌腱和韧带结构等。常见的细胞外基质分子有胶原蛋白、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、弹性蛋白、硫酸软骨素以及透明质酸等。
在本文中，如无特别说明，涉及hp-bioink/SDS/NHS-PEG-NHS/CaCl2/TG/Alginate/Genipin/明胶浓度的百分数(％)均指质量体积比(W/V，1％＝10mg/mL)；涉及Triton X-100/乙腈/酒精/乙醇/甲酸/水合氯醛溶液的百分数(％)均指体积比(V/V)。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。实施例中未指明其来源的试剂、试剂盒或仪器均为市场上商购可得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例一人胎盘hp-bioink的制备流程
本发明人胎盘hp-bioink一般性制备流程如图1所示。具体包括以下步骤：
1.新鲜的胎盘由身体健康、无传染性疾病的孕妇分娩所得，事先取得知情同意；
2.新鲜的胎盘立即放进肝素钠溶液中洗涤以去除血污，肝素钠的浓度为500U/L；
3.剪去母面羊膜、绒毛膜，剪去一部分脐带，保留合适的长度，长度可以为15cm；
4.将胎盘放于盛有肝素钠溶液与双抗溶液的容器A中，准备盛有肝素钠溶液与双抗溶液的容器B，肝素钠的浓度为500U/L，100×双抗浓度1％；
5.搭建灌流系统(图2)，包括两台蠕动泵(一台引导灌流液，一台引导废液)、PU软管、毛细管、直通接头、废液缸。管道连接顺序为：灌流液(容器B)-PU软管-蠕动泵-毛细管-脐动脉，灌流液(容器B)-PU软管-蠕动泵-脐静脉，废液(容器A)-PU软管-蠕动泵-废液缸；
6.连接好灌流系统后，进行灌流，灌流速度为10mL/min，灌流肝素钠溶液总体积为20L；
7.肝素钠溶液处理完毕后，进行SDS(十二烷基硫酸钠)溶液灌流处理，灌流速度为10mL/min。灌流液为梯度溶液，每个梯度灌流3天，共3种浓度，浓度是0.1％、0.01％、0.001％；
然后用含有脱氧核糖核酸酶(DNase)(50U/mL)和核糖核酸酶(RNase)(1U/mL)的Tris-HCl(10mM，pH＝7.6)溶液灌注胎盘24h；
8.随后进行Triton X-100溶液处理，浓度为0.1％，灌流速度为10mL/min，灌流时间为24h；
9.Triton X-100溶液处理后，可以用PBS溶液(磷酸盐缓冲液)或者去离子水进行灌流洗涤处理，灌流速度为10mL/min，灌流时间为3天；
10.脱完细胞的胎盘组织应为白色，洗涤后进行剪碎处理，先剪去脐带，再剪去剩余的绒毛膜、羊膜。将绒毛组织剪成小块，大小为1×1×1cm3(图3显示通过本发明灌流系统处理，获得结构完整的脱细胞胎盘支架；图4通过组织染色与扫描电镜观察脱细胞组织微观形貌与DNA残留，说明本发明灌流系统对胎盘脱细胞较为彻底)；
11.将处理好的组织放入0.1～1M醋酸溶液中，比例为1g组织(湿重)加入10mL醋酸溶液。再加入胃蛋白酶，比例为1g组织(湿重)加入0.1g胃蛋白酶。低温搅拌处理，温度为4℃，转速为300rpm，处理时间为3天；
12.将酶解好的材料低温离心处理，转速为50000rpm，收集上清；
13.收集上清后，用去离子水进行透析，透析膜的截留量为3kDa，为了加快透析速率，可进行搅拌，搅拌速度为300rpm。透析处理在低温进行，温度为4℃，每隔12h换液一次，处理时间为5天。
14.对透析完的材料进行冻干处理，冻干时间为24h；
15.冻干后的材料进行紫外灭菌处理，放入无菌台内，暴露在紫外灯下2h；
16.将材料溶解在0.5M醋酸溶液中，终浓度为30mg/mL，此时制得酸性hp-bioink；
17.加入10M NaOH调节酸性hp-bioink到中性，再加入1/10hp-bioink体积的10×PBS调节渗透压，此时制得最终使用的hp-bioink，4℃保存，0～24h内使用。
实施例二
为进一步对材料的性质与组成进行鉴定，使用扫描电子显微镜进行微观结构的分析表征，具体实施方式如下。
1.将中和后的浓度为1％(质量/体积)，即10mg/mL的hp-bioink放入样品瓶，置于37℃培养箱30min以交联固化；
2.将固化后的hp-bioink放入2.5％的戊二醛溶液中固定2h，然后放入PBS中洗涤30min；
3.放入梯度乙醇溶液中进行脱水，浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％、100％，每个梯度10min；
4.临界点干燥1h；
5.喷金3.5nm厚；
6.使用扫描电子显微镜进行观察，其微观形貌如图5，可见其具有胶原纤维结构，疏松多孔。
实施例三
为确定hp-bioink的具体成分组成，使用质谱仪进行成分鉴定，具体实施方式如下：
1.SDS-PAGE电泳样品检测实验
每个样品取30μg，采用12％SDS-PAGE进行分离。分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色。具体操作如下：
1)固定2小时；
2)染色12小时；
3)水洗至背景清晰；
4)染色后的凝胶应用ImageScanner扫描仪进行扫描，扫描模式为灰度模式，光密度值为300dpi；
5)分子量由上到下分别为：116、66.2、45、35、25、18.4(kDa)；
2.酶解和质谱鉴定操作步骤
试剂：
脱色液：15mM铁氰化钾混合50mM硫代硫酸钠；
脱水液1：50％的乙腈水溶液；
脱水液2：100％乙腈；
还原液1：10mM DTT与25mM NH4HCO3的水溶液；
还原液2：50mM碘乙酰胺与25mM NH4HCO3的水溶液；
吸胀液：25mM NH4HCO3的水溶液；
酶解覆盖液：25mM NH4HCO3与10％乙腈的水溶液；
酶解工作液：含0.02μg/μL胰蛋白酶的酶解覆盖液；
肽段萃取液：含5％TFA与67％乙腈的水溶液。
蛋白质酶解参考[Katayama H.,Nagasu T.,Oda Y.,Improvement of in-geldigestion protocol for peptide mass fingerprinting by matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,Rapid Communicationsin Mass Spectrometry,15,1416-1421]的方法进行。
1)将切取的蛋白条带转入0.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次；
2)加入脱色液，脱色30min；
3)吸出脱色液，加入脱水液1，脱水30min；
4)吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min，真空冻干；
5)冻干的胶块加入50μL还原液1，57℃温浴1h；
6)吸出液体，加入50μl还原液2，室温放置30min；
7)吸出液体，加入吸胀液，10min；
8)吸出吸胀液，加入脱水液1，脱水30min；
9)吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min；
10)吸出脱水液2，加入10μl酶解工作液，吸胀30min；
11)加入20μl酶解覆盖液，37℃水浴酶解16h；
12)酶解后上清转移至另一新离心管中；
13)加入50μl肽段萃取液于剩下的胶中，37℃水浴30min，5000g离心5min，合并上清，冻干后待做液质联用。
3.质谱操作及数据库检索
1)将冻干的多肽样品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A(0.1％甲酸与2％乙腈的水溶液)中；
2)在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-UltraTM2D系统(AB SCIEX)进行，溶解后的样品以2μl/min的流速上样到C18预柱上(100μmx 3cm,C18,3μm,)，然后保持流速冲洗脱盐10min。分析柱是C18反相色谱柱(75μm x 15cm,C18,3μm,/>ChromXPEksigent)，实验所用梯度为90min内流动相B(0.1％甲酸与98％乙腈的水溶液)由5％升高至35％；
3)质谱采用TripleTOF5600系统(AB SCIEX)结合纳升喷雾III离子源(AB SCIEX,USA)，喷雾电压为2.5kV，气帘气压为30PSI，雾化气压为5PSI，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(IDA，Information Dependent Analysis)，一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离(CID)，动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽；
4)数据处理采用Mascot 2.3软件(Matrix Science)进行，数据库为人-Uniprot-Homo数据库，酶为胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2；固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M)；MS容差为±10ppm，MSMS容差为±0.6Da，Protein score C.I.％大于95％为鉴定成功。
质谱统计结果如表1所示，可以看出其主要成分为纤维蛋白原、胶原蛋白等ECM主要成分，说明hp-bioink的成分保留了ECM的主要成分。
表1质谱鉴定结果
实施例四
为进一步说明hp-bioink具有可打印性，即可以顺利挤出，并能顺利固化交联，所以进行交联的测试，具体实施方式如下：
交联固化测试
1)将中和后的hp-bioink放入样品瓶，并置于37℃培养箱，固化交联30min；
2)观察交联结果。
根据图6可以看出，hp-bioink在低温条件下(4℃)不能迅速交联固化，在37℃条件下可以交联固化，这样的材料符合3D打印的需求。
实施例五
为进一步说明hp-bioink随温度变化的力学性质，进行流变力学检测手段进行表征。具体实施方式如下：
流变学测试
1)低温制备1％、2％、3％、4％、5％的中性hp-bioink溶液；
2)使用Anton-Paar MCR302平行板流变仪进行测试；
3)测试参数为：振荡模式-温度扫描，振幅1％，频率1Hz，扫描温度0-40℃，升温速度0.5℃/min；
4)使用OriginPro 2017处理数据并作图。
如图7，通过流变学测试可知，hp-bioink在25℃之前状态稳定，损耗模量大于储能模量，属于流体的性质，在25℃左右储能模量迅速增大，变成固体。说明该hp-bioink具有温度敏感性，这与大分子蛋白的活性有关。如图8，统计了在4℃与37℃状态下不同浓度hp-bioink的模量，说明1％、2％、3％、4％、5％的hp-bioink均能响应温度变化而交联。
为进一步验证该hp-bioink是否可以顺利打印挤出成型，使用3D生物打印机进行打印测试，具体实施方式如下：
1.将制备的5％中性hp-bioink转移至3D打印机的料仓针筒中，使用如下打印参数进行打印：
打印针头直径0.26mm；打印速度10mm/s；打印层厚0.3mm；出丝间距0.5mm；打印仓温度4℃；打印平台30℃；打印模型为10mm×10mm正方形，打印5层。
2.按照以上参数进行打印，并将打印好的材料置于37℃固化交联。
打印结果如图9、图10，可以看出来，该hp-bioink可以顺利出丝，并能进行打印，可最终成型固化。
实施例六
我们针对3％以下浓度的hp-bioink开发了悬浮浴打印系统，用于低浓度hp-bioink的打印，甚至进行了载细胞打印。对于低浓度hp-bioink的打印测试，我们选取了自制的网格图案模型以及在开源网站上共享的交通锥模型(https://www.thingiverse.com/thing:623204/files)。使用PBS重悬的悬浮浴支持介质，hp-bioink浓度为1％、2％，保持低温。
打印结果如图11，我们使用了直径150μm的针头与1％hp-bioink打印出了精细的网格结构，出丝均匀且精细，网孔大小一直整体保真度较高。然后，我们使用2％hp-bioink打印出了交通锥模型，可以看出，紧密打印的丝与丝之间形成了融合的界面，使得整体打印模型完整光滑。这说明在悬浮浴体系中可以实现低浓度hp-bioink(小于3％)的打印。
实施例七
为进一步说明该hp-bioink作为3D生打印墨水的生物活性，使用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在hp-bioink中进行3D培养，具体实施方式如下：
HUVEC在hp-bioink中的3D培养(材料为灭菌后的hp-bioink冻干海绵重新溶解制得)：
1)精确称量样品，按所需浓度制备，一般为1％-2％，即10-20mg/mL，本次实验使用1％的hp-bioink；
2)加入0.5M醋酸溶解，4℃过夜即可；
3)充分溶解后，应该是均匀、透明或半透明的状态，无任何杂质或不溶解的部分，如有气泡，应进行离心处理，3000rpm，5min即可；
4)在混入细胞前，在冰上用10M NaOH调pH到中性，并加入1/10体积的10×PBS以调节至正常渗透压；
5)加入细胞混匀，注意不要掺入气泡，细胞浓度为5×106/mL材料；
6)将混合好的细胞与基质加入到培养皿，置于37℃培养箱30min让其交联固化；
7)取出培养皿，缓慢加入预热好的培养基，再转移至培养箱培养；
8)培养1、3、5天后，使用Live/Dead试剂染色并在激光共聚焦显微镜下观察细胞生长情况。
根据图12可以说明HUVEC在hp-bioink里生长状态良好，并能自组装形成血管结构，说明该hp-bioink生物活性高，利于细胞的生长与组装。
实施例八
为了测试hp-bioink对不同交联系统的兼容性并探究出高活性的交联体系，我们测试了在加入0.25％NHS-PEG-NHS/1％alginate/2.5mg/mL谷氨酰胺转移酶(Transglutaminase，TG)/0.5mM京尼平(Genipin)后1％hp-bioink的缩胶情况与细胞活率(1％hp-bioink作为空白对照)。其具体步骤如下：
1)对于融合度到90％的HUVEC细胞，吸去培养基，PBS冲洗一遍；
2)加入0.25％胰蛋白酶消化细胞3min；
3)加入培养基终止消化，离心3min(1,200rpm)后，吸去上清备用；
4)将材料加入到离心管中，与细胞轻轻混匀，避免产生气泡，避免剪切力过大。若产生气泡，可用微型离心机，5,000rpm离心1～3min除泡。所有材料均保持在冰上预冷，混合细胞的操作也保持在低温进行。0.25％NHS-PEG-NHS+1％hp-bioink、2.5mg/mL TG+1％hp-bioink、0.5mM genipin+1％hp-bioink与1％hp-bioink组一样在使用前用NaOH调节pH至中性。HUVEC细胞在水凝胶中的终浓度为5×106个/mL；
5)将10μL的细胞悬液滴加到12孔板皿底，保持圆球形状(每孔3个)。然后转移到37℃培养箱中交联30min。对于1％alginate组，在转移前加入含有0.15％CaCl2的PBS溶液进行交联；
6)交联完成后，每孔加入1mL培养基(对于1％alginate组，先吸去CaCl2溶液后，再加入培养基)，然后转移至37℃培养箱培养；
7)24h后，对细胞进行LIVE/DEADTM染色鉴定：吸去样本孔中培养基后，加入含0.5μL/mL钙黄绿素(Calcein AM)与2μL/mL溴化乙锭(Ethidium bromide)的PBS溶液，染色20min。再用PBS洗涤10min；
8)将样本放在荧光显微镜下观察并拍摄照片，使用ImageJ(NIH，USA)软件进行分析统计细胞活率。结果如图13所示，在培养24h后，hp-bioink组出现明显的缩胶现象；2.5mg/mL的TG酶并没有阻止缩胶的发生；京尼平与Alg/Ca2+虽然都固定住了hp-bioink的形貌，但是细胞凋亡过多；只有NHS-PEG-NHS在实现交联hp-bioink的同时还保持了较高的细胞活率(～87％，n＝3)。因此我们得到了一种能保持hp-bioink高生物活性的交联增强体系：hp-bioink+0.25％NHS-PEG-NHS。
实施例九
为了验证hp-bioink载细胞打印的能力，我们采用实施例八中的交联体系(1％bioink+0.25％NHS-PEG-NHS)混合2×106/mL的MSC细胞在悬浮浴中(黄原胶-海藻酸钠体系)进行打印。
结果如图14所示，打印后的丝结构保持完整，且在24h后保持了83.7％的细胞活率。说明hp-bioink可以支持载细胞打印，并保持较高的细胞活率。
实施例十
为了鉴定hp-bioink的体内生物活性，采取小鼠皮下移植生物3D打印支架的方法进行。对于小鼠皮下移植实验，涉及到3D打印移植支架与皮下移植两部分，具体如下：
移植支架使用5％hp-bioink与5％明胶(gelatin)分别进行打印，5％hp-bioink打印。对于5％gelatin的打印，具体如下：
1)Gelatin粉末置于超净工作台中，紫外灯照射2h以灭菌；
2)加入无菌的PBS溶解gelatin，终浓度为5％，放在50℃烘箱内可加快溶解，溶解时间为0.5～2h；
3)待gelatin完全溶解后，离心除泡后转移至打印料筒，安装针头与尾堵；
4)设定打印喷头温度为18～22℃，设定打印平台温度为4℃，将料筒安装到喷头中，并加载喷头到打印臂上。让gelatin在设定的温度条件下静置30min；
5)导入5mm×5mm的方形网格模型，设定为打印两层，出丝直径250μm，丝间距250μm，旋转角度90°，打印速度10mm/s，出丝气压0.05bar；
6)打印完成后将支架转移至4℃冰箱，加入4℃预冷的含有15mM EDC与6mM NHS的PBS溶液，4℃过夜交联。对于打印的hp-bioink支架，平台温度为30℃，打印完后将支架转移到37℃培养箱交联30min，然后再转移到4℃冰箱，加入4℃预冷的含有15mM EDC与6mM NHS的PBS溶液，4℃过夜交联；
7)交联后用PBS洗涤3次，每次10min，将残留的EDC/NHS彻底洗涤出去；
8)将支架放到75％酒精中浸泡消毒1h；
9)使用生理盐水洗涤3次，每次10min，然后保存在生理盐水中，封口膜密封，放在4℃冰箱备用。
对于皮下移植实验，选用雄性8周龄、体重在22-28g的C57小鼠共24只。小鼠被随机分为两组，移植hp-bioink支架的作为实验组，移植gelatin支架的作为对照组，每组12只小鼠。
1)首先对小鼠进行承重，然后按照10μL/g的剂量在小鼠腹腔注射5％水合氯醛以进行麻醉；
2)使用电动剃毛刀将小鼠背部皮肤上的毛发剃去，区域大小为3cm×2cm，然后涂抹少许脱毛膏进一步脱除背部移植区域毛发。使用酒精棉擦拭以去除残留试剂并消毒；
3)使用剪刀将手术区域皮肤剪开，开口长度在8-10mm；
4)用镊子将3D打印的支架从生理盐水中取出，放入开口内侧皮肤下面；
5)用缝合针进行创口缝合，将手术完的小鼠放到热台上维持体温；
6)给小鼠做好标记，并记录实验内容。待确认小鼠苏醒后将其放回鼠笼；
7)术后每天观察小鼠健康状态，在第一、二、四周对小鼠进行安乐死，并取背部支架所在处皮肤进行检测。
结果如图15所示，在植入后第一周，3D打印支架均保持完整。如图15(A、B)所示，HE染色结果表明，在第一周时，就有大量的单核细胞浸润到bioink支架中去，且随着植入时间的延长，单核细胞密度呈现倍增的趋势(Week 1：479.7/mm2，Week 2：1,418.1/mm2，Week 4：3,341.4/mm2,n＝3)。然而Gelatin对照组并无任何单核细胞的浸润，我们推测这是因为明胶在共价交联后结构更加致密导致的。尽管明胶在第二周就出现了因为材料降解而导致的空洞，但依然没有任何细胞在上面粘附驻留。同时，在第四周时，我们观察到了少量的CD68+/CD206+的细胞(图16E)，这表明bioink支架驱动了巨噬细胞由M1向M2型的极化转变，这对于机体损伤修复至关重要。
更重要的是，在第二周我们观察到了hp-bioink支架内有血管生成(图16A)。在第四周，可以看到bioink支架内部分布了大量的血管。并且此时支架的形貌还是完整的，而明胶对照组有些已经完全降解。我们统计了hp-bioink支架内的平均血管生成密度，第四周比第二周增加了一倍多的数目(Week 2：33.2/mm2，Week 4：71.2/mm2,n＝4)(图16C)。Hp-bioink支架不仅能诱导血管浸入，而且血管发育似乎具有功能，可以看到血管直径增大，并且血管腔内有大量的红细胞(图16A)。通过免疫染色，我们发现在第四周的hp-bioink支架中存在大量的CD31+/CD34+细胞，进一步确定了在支架内部有血管生成(图16E)。与此同时，明胶支架在第二周不仅没有单核细胞浸润，也没有血管内皮细胞浸入，在第四周就基本降解完全(图16A、D)。
这些体内实验的结果表明，hp-bioink支架在体内环境下不仅能驱动巨噬细胞的极化，还能够诱导血管生成，具有优良的体内生物活性。对比明胶这种传统的医用生物材料，具有较为明显的生物活性优势。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.一种脱细胞细胞外基质，其通过下述方法制备得到：
(1)将哺乳动物胎盘组织进行脱细胞处理；
(2)将依照步骤(1)处理得到的脱细胞胎盘组织粉碎，酶解；
(3)将依照步骤(2)处理得到的材料离心并收集上清，透析，干燥，即得所述脱细胞细胞外基质。
2.权利要求1的脱细胞细胞外基质，其中，步骤(1)中所述脱细胞处理是指分别用肝素钠溶液、SDS溶液(或EDTA溶液、脱氧胆酸钠溶液或月桂酸酯溶液)、DNase和RNase的Tris-HCl溶液、Triton X-100溶液以及PBS溶液(或去离子水)灌流处理所述哺乳动物胎盘；
优选地，所述肝素钠溶液的浓度为100-100000U/L(例如，100U/L，500U/L，1000U/L，5000U/L，10000U/L，50000U/L或100000U/L)；优选用肝素钠溶液灌流处理1-2天；
优选地，采用1-5个(例如，1、2、3、4或5个)浓度梯度对所述哺乳动物胎盘用SDS溶液灌流处理，优选的SDS溶液浓度梯度为5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05、0.025％、0.001％和0.01％中的任意3个(例如0.1％、0.01％和0.001％)；优选每个浓度下灌流处理1-5天(例如，3天)；
优选地，所述DNase的浓度为10-100U/L(例如，10U/L，20U/L，30U/L，40U/L，50U/L，60U/L，70U/L，80U/L，90U/L或200U/L)；优选地，RNase的浓度为1-20U/L(例如，1U/L，2U/L，5U/L，10U/L，15U/L或20U/L)；优选地，用DNase和RNase的Tris-HCl溶液灌流处理10h-2天(例如，24h)；
优选地，所述Triton X-100的浓度为0.05％-0.5％(例如0.1％)；优选用Triton X-100溶液灌流处理1-3天(例如，1天)；
优选地，所述PBS溶液pH为7.0-7.5；优选用PBS溶液(或去离子水)灌流处理3天；
优选地，上述各溶液灌流速度为0.5-50mL/min(例如，0.5mL/min，1mL/min，5mL/min，10mL/min，20mL/min，30mL/min，40mL/min或50mL/min)；
优选地，在步骤(1)前，还包括去除所述哺乳动物胎盘母面羊膜、绒毛膜的步骤。
3.权利要求1或2的脱细胞细胞外基质，其中，步骤(2)中所述酶解条件为：将粉碎的脱细胞胎盘组织加入0.1-1M醋酸溶液中，用胃蛋白酶处理；
优选地，醋酸溶液的用量为每1g组织加入10mL-100mL醋酸溶液(例如10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，60mL，70mL，80mL，90mL或100mL)；
优选地，所述胃蛋白酶的用量为每1g组织加入0.01-0.1g胃蛋白酶(例如0.01g，0.05g或0.1g)；
优选地，在0-10℃(例如约4℃)下进行所述酶解；
优选地，酶解1-5天(例如3天)。
4.权利要求1-3任一项的脱细胞细胞外基质，其中，步骤(3)中所述离心条件为：10000-100000rpm(例如，50000rpm)，温度0-10℃；
优选地，所述透析条件为：用截留量为1-30KDa(例如，3kDa)的透析膜在0-10℃(例如，约4℃)下处理1-7天(例如，5天)；优选地，每1-24小时(例如，12小时)换液一次；
优选地，所述干燥为冻干；
优选地，还包括对所述材料进行灭菌的步骤，优选地，采用紫外线灭菌处理。
5.权利要求1-4任一项的脱细胞细胞外基质，其中，所述哺乳动物为人。
6.一种生物墨水，其通过以下方法制备得到：
将权利要求1-5任一项所述的脱细胞细胞外基质制成浓度为0.8％-5％(例如，0.8％-3％或3％-5％，再例如1％，2％，3％，4％或5％)的具有生理pH和渗透压的溶液，即得所述生物墨水；
优选地，所述生物墨水的pH为中性(例如7.0-7.4)；
优选地，用PBS溶液调节所述生物墨水的渗透压至280-320mosm/L；
优选地，所述生物墨水在25-38℃(例如，约25℃)固化；
优选地，所述生物墨水中未额外添加具有交联固化功能的材料；
优选地，所述生物墨水中还添加具有交联固化功能的材料；
优选地，所述具有交联固化功能的材料选自NHS-PEG-NHS、alginate/Ca2+、谷氨酰胺转移酶和京尼平，优选为NHS-PEG-NHS；
优选地，所述具有交联固化功能的材料的浓度为0.1％-1％，优选为0.25％。
7.一种生物打印平台，其包含权利要求6所述的生物墨水；
优选地，所述脱细胞细胞外基质浓度为3％-5％，例如3％，4％或5％)；
优选地，所述脱细胞细胞外基质浓度为0.8％-3％，例如1％，2％或3％；进一步优选地，所述生物打印平台进一步含有悬浮介质，优所述悬浮介质例如选自海藻酸钠、聚丙烯酸酯、黄原胶中的一种或多种，优选为海藻酸钠-黄原胶。
8.一种用于制备生物墨水的配套元件，其包含权利要求1-5任一项的脱细胞细胞外基质，任选的，其进一步包括添加剂、缓冲溶液、溶剂、中和溶液及其任意组合。
9.一种配套元件，其包含权利要求6所述的生物墨水、权利要求7所述的生物打印平台或权利要求8所述的配套元件，任选的，其进一步包括导管或注射器。
10.一种3D打印方法，其包括使用权利要求6任一项所述的生物墨水、权利要求7所述的生物打印平台或权利要求8所述的配套元件进行打印的步骤；
优选地，所述方法还包括将细胞加入所述生物墨水中的步骤；优选地，所述细胞选自MSC(例如，人脐带来源的间充质干细胞)和HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞)；
优选地，所述方法还包括在打印前或打印对温度进行调节的步骤；优选地，在约4℃进行打印；优选地，在打印完成后调整温度至约37℃。
11.一种组织构建体，其通过权利要求10的方法制备得到；优选地，所述组织选自神经组织、软骨组织、骨骼肌肉组织、肝脏组织、脂肪组织、血管组织、皮肤组织和角膜组织。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN117224742A true CN117224742A (zh) | 2023-12-15 |
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