CN112426402A - 一种基于成纤维外泌体的敷贴及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于成纤维外泌体的敷贴及制备方法；由以下重量百分比的各组分组成：成纤维外泌体0.5％，成纤维细胞裂解液1*105/ml，余量为无菌胶原液。本发明还涉及制备方法，包括：成纤维外泌体的提取；成纤维细胞裂解液的提取；制备滋润营养精华液，‑4℃低温保存；将敷贴置于铝箔袋中，封口、低温保存。本发明将成纤维细胞外泌体、成纤维细胞裂解液、无菌胶原液按一定比例混合制备敷贴，使得各组分充分发挥各自作用以外，因为各组分之间有相互协同作用，将其效果达到了最优值，最终使得敷贴用于皮肤后，达到除皱、美容等作用。
Description
技术领域
本发明属于贴敷制备技术领域；尤其涉及一种基于成纤维外泌体的敷贴及制备方法。
背景技术
成纤维细胞是皱纹形成过程中最主要的效应细胞，是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维及有机基质，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。
胶原是动物结缔组织、皮、筋、健和骨中的主要成份,成熟的胶原是不溶于水的,但是在某些溶液中,一部分胶原可以被溶解,溶解的程度主要取决于原料的种类和动物的年龄。动物的年龄越小,它的存在量就越大,而在老龄动物中的量就比较少。故对可溶性胶原的看法,可视为它是一种还未成熟的胶原,是成熟胶原(即不溶性胶原)的前身。可溶性胶原富含人体必需的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，是细胞外基质中最重要的组成部分，具有强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度,在动物皮内可较长期存在而不改变形态,且抗原性较低。由于此，胶原在烧伤、创伤、美容、等医药卫生领域用途广泛。
外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中是细胞主动分泌的大小均一，直径为40-100nm，密度1.10-1.18g/ml的囊泡样小体。具有脂质双层膜结构，可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。外泌体中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能够作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，在免疫抗原呈递、肿瘤的生长于迁移、组织损伤的修复中有重要作用。
皱纹是由于皮肤真皮层内的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质缺失，无法支撑皮肤的正常架构，皮肤表皮层随之塌陷形成沟壑而形成的。而这几种重要物质，都是由成纤维细胞分泌而来的。也就是说，成纤维细胞是皱纹形成过程中最主要的效应细胞。胶原蛋白占皮肤干重的70-80％，有助于组织的稳定性和结构完整性。近年来，干细胞在面部整形方面得到广泛的应用，如自体成纤维细胞，通过体外分离、提取、培养、扩增，再局部注射，治疗后，皮肤厚度弹性明显改善，皮肤真皮层内的胶原蛋白含量也明显增加，从而达到除皱、美容等作用。且由于原材为自体耳后成纤维细胞，故不涉及伦理问题，取材方便。目前，关于自体成纤维细胞外泌体与无菌胶原液相结合的有效研究较少，使得自体成纤维细胞外泌体与无菌胶原液之间结合之后的益处无法得到体现，从而在一定程度上限制了自体成纤维细胞外泌体与无菌胶原液产物的作用发挥。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于成纤维外泌体的敷贴及制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种基于成纤维外泌体的敷贴，由以下重量百分比的各组分组成：
成纤维外泌体0.5％，
成纤维细胞裂解液0.5％，
余量为无菌胶原液。
优选地，所述无菌胶原液由以下重量百分比含量的各组分组成：2％的透明质酸钠、0.3％的黄原胶，余量为注射用水。
优选地，所述方法包括如下步骤：
步骤1，成纤维外泌体的提取；
步骤2，成纤维细胞裂解液的提取；
步骤3，在无菌环境中，将成纤维上清外泌体与成纤维细胞裂解液按照1:1的比例混匀，混匀过程全程在低温环境中进行，得滋润营养精华液，-4℃低温保存；
步骤4，在无菌环境中，将无菌胶原液附着于蚕丝布表层；附着好后的蚕丝布完全浸润入滋润营养精华液中，其中浸润时间为12h，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着了无菌胶原液的蚕丝布上，又使得滋润营养液不失去活性，浸润环境应保持在-4℃，即得基于成纤维外泌体的敷贴；
步骤5，将基于成纤维外泌体的敷贴置于铝箔袋中，封口、低温保存。
优选地，步骤1中，所述成纤维外泌体的提取的方法具体为：
(1)皮肤来源的成纤维细胞的获得：无菌条件下，取耳后微量皮肤，并采用真皮层组织贴块法处理，将组织接种于培养瓶中，加入适量成纤维细胞培养基，置于培养箱内培养，待细胞长满，进行传代；
(2)细胞扩增：在无菌条件下，当所述步骤(1)中细胞铺满培养瓶底部80％以上面积时，倒掉培养基，用生理盐水润洗2次后，加入消化液(具体为：加入0.25％的胰酶2-3ml，消化50s左后吸掉0.25％的胰酶，加入新的培养基终止消化，吹散贴壁细胞)1500rpm6min离心洗涤2次，进行传代，当细胞达到80％以上的融合时，重复以上操作
(3)外泌体分离纯化：在无菌条件下，用所述步骤(2)的P3-P5代的成纤维细胞培养到80％以上的融合时，取培养上清放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，将此上清先用100μm滤网过滤得到外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤后，得成纤维外泌体。
优选地，步骤2中，所述成纤维细胞裂解液的提取的具体步骤为：
取状态良好的的P3-P5代成纤维细胞，弃掉培养上清，加入注射用水反复涮洗两遍后弃掉上清，加入新的注射用水，放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，先用100μm滤网过滤，得到细胞裂解粗提液；再用0.22μm滤膜过滤，得成纤维细胞裂解液。
本发明具有以下优点：
本发明将成纤维细胞外泌体、成纤维细胞裂解液、无菌胶原液按一定比例混合制备敷贴，使得各组分充分发挥各自作用以外，因为各组分之间有相互协同作用，将其效果达到了最优值，最终使得敷贴用于皮肤后，达到除皱、美容等作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及一种基于成纤维外泌体的敷贴，由以下重量百分比的各组分组成：
成纤维外泌体0.5％，
成纤维细胞裂解液0.5％，
余量为无菌胶原液。
优选地，所述无菌胶原液由以下重量百分比含量的各组分组成：2％的透明质酸钠、0.3％的黄原胶，余量为注射用水。
优选地，所述方法包括如下步骤：
步骤1，成纤维外泌体的提取；
步骤2，成纤维细胞裂解液的提取；
步骤3，在无菌环境中，将成纤维上清外泌体与成纤维细胞裂解液按照1:1的比例混匀，混匀过程全程在低温环境中进行，得滋润营养精华液，-4℃低温保存；
步骤4，在无菌环境中，将无菌胶原液附着于蚕丝布表层；附着好后的蚕丝布完全浸润入滋润营养精华液中，其中浸润时间为12h，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着了无菌胶原液的蚕丝布上，又使得滋润营养液不失去活性，浸润环境应保持在-4℃，即得基于成纤维外泌体的敷贴；
步骤5，将基于成纤维外泌体的敷贴置于铝箔袋中，封口、低温保存。
步骤1中，所述成纤维外泌体的提取的方法具体为：
(1)皮肤来源的成纤维细胞的获得：无菌条件下，取耳后微量皮肤，并采用真皮层组织贴块法处理，将组织接种于培养瓶中，加入适量成纤维细胞培养基，置于培养箱内培养，待细胞长满，进行传代；
(2)细胞扩增：在无菌条件下，当所述步骤(1)中细胞铺满培养瓶底部80％以上面积时，倒掉培养基，用生理盐水润洗2次后，加入消化液(具体为：加入0.25％的胰酶2-3ml，消化50s左后吸掉0.25％的胰酶，加入新的培养基终止消化，吹散贴壁细胞)1500rpm6min离心洗涤2次，进行传代，当细胞达到80％以上的融合时，重复以上操作
(3)外泌体分离纯化：在无菌条件下，用所述步骤(2)的P3-P5代的成纤维细胞培养到80％以上的融合时，取培养上清放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，将此上清先用100μm滤网过滤得到外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤后，得成纤维外泌体。
优选地，步骤2中，所述成纤维细胞裂解液的提取的具体步骤为：
取状态良好的的P3-P5代成纤维细胞，弃掉培养上清，加入注射用水反复涮洗两遍后弃掉上清，加入新的注射用水，放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，先用100μm滤网过滤，得到细胞裂解粗提液；再用0.22μm滤膜过滤，得成纤维细胞裂解液。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明将成纤维细胞外泌体、成纤维细胞裂解液、无菌胶原液按一定比例混合制备敷贴，使得各组分充分发挥各自作用以外，因为各组分之间有相互协同作用，将其效果达到了最优值，最终使得敷贴用于皮肤后，达到除皱、美容等作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (5)
1.一种基于成纤维外泌体的敷贴，其特征在于，由以下重量百分比的各组分组成：
成纤维外泌体 0.5％，
成纤维细胞裂解液 0.5％，
余量为无菌胶原液。
2.如权利要求1所述的基于成纤维外泌体的敷贴，其特征在于，所述无菌胶原液由以下重量百分比含量的各组分组成：2％的透明质酸钠、0.3％的黄原胶，余量为注射用水。
3.一种如权利要求1所述的基于成纤维外泌体的敷贴的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，成纤维外泌体的提取；
步骤2，成纤维细胞裂解液的提取；
步骤3，在无菌环境中，将成纤维上清外泌体与成纤维细胞裂解液按照1:1的比例混匀，混匀过程全程在低温环境中进行，得滋润营养精华液，-4℃低温保存；
步骤4，在无菌环境中，将无菌胶原液附着于蚕丝布表层；附着好后的蚕丝布完全浸润入滋润营养精华液中，其中浸润时间为12h，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着了无菌胶原液的蚕丝布上，又使得滋润营养液不失去活性，浸润环境应保持在-4℃，即得基于成纤维外泌体的敷贴；
步骤5，将基于成纤维外泌体的敷贴置于铝箔袋中，封口、低温保存。
4.如权利要求3所述的基于成纤维外泌体的敷贴的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述成纤维外泌体的提取的方法具体为：
(1)皮肤来源的成纤维细胞的获得：无菌条件下，取耳后微量皮肤，并采用真皮层组织贴块法处理，将组织接种于培养瓶中，加入适量成纤维细胞培养基，置于培养箱内培养，待细胞长满，进行传代；
(2)细胞扩增：在无菌条件下，当所述步骤(1)中细胞铺满培养瓶底部80％以上面积时，倒掉培养基，用生理盐水润洗2次后，加入消化液1500rpm 6min离心洗涤2次，进行传代，当细胞达到80％以上的融合时，重复以上操作
(3)外泌体分离纯化：在无菌条件下，用所述步骤(2)的P3-P5代的成纤维细胞培养到80％以上的融合时，取培养上清放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm 10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，将此上清先用100μm滤网过滤得到外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤后，得成纤维外泌体。
5.如权利要求3所述的基于成纤维外泌体的敷贴的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述成纤维细胞裂解液的提取的具体步骤为：
取状态良好的的P3-P5代成纤维细胞，弃掉培养上清，加入注射用水反复涮洗两遍后弃掉上清，加入新的注射用水，放入-20℃，待液体全部冻住后，常温解冻，反复冻融2-3次后，离心2000rpm 10min，离心后将上清转移入新的离心管，再次离心2000rpm 10min；重复此步骤2-3次后得到上清，先用100μm滤网过滤，得到细胞裂解粗提液；再用0.22μm滤膜过滤，得成纤维细胞裂解液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210302 |