CN107034183A - 制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的制备方法，其包括如下步骤：S1：提取自体脂肪组织；S2：利用所述自体脂肪组织制备原代脂肪干细胞；S3：利用所述原代脂肪干细胞制备第五代脂肪干细胞，并获得细胞培养上清液；S4：将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；S5：进行超滤浓缩后，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，得到所述自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉。本发明通过一系列的操作步骤，把自体脂肪干细胞培养上清内的活性因子混合物以冻干粉的形式保存下来，获得的因子完全来自于自体，使用安全可靠，排除了使用过程中过敏和感染外源性病原的可能性。

Description

制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法

技术领域

本发明涉及一种自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的制备方法，属于生物技术领域，特别是涉及一种自体来源的生物活性肽的制备方法，本方法可以有效制备高质量自体干细胞来源的生物活性肽。

背景技术

近年来随着科技的发展和生活水平的提高，人们对美容和抗衰老的需求爆发式增长。随之而诞生的美容抗衰老手段和方式也应运而生。包括曾经名噪一时的羊胎素、人胎盘素和干细胞抗衰老等。羊胎素和胎盘素虽然有不错的用户体验，但来源为异种和异体，涉及伦理问题和风险控制问题，使用需要谨慎价格也十分昂贵。

目前市场上干细胞美容的传统方式为注射干细胞，这些干细胞往往来自于流产胎儿、还有异体的围产组织，除了尖锐的伦理问题还有来源把控问题，感染病毒的阳性细胞注射到人体可以直接导致用户感染，因此异体干细胞的使用也一度收到质疑。

干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝脏生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)等，还能直接分泌胶原蛋白。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。

含干细胞生物活性肽的干细胞化妆品已经在多个国家上市，特别是在政策宽松、整形美容行业发达的韩国。但目前推出的干细胞生物活性肽类产品往往是在上清液中直接掺入化妆品基质制成，浓度低，市场普遍反映使用效果欠佳，甚至有过敏和干燥红肿。

液体状态下的干细胞生物活性肽溶液在室温保存时间短，不利于运输，浓度也低。并且异体来源的干细胞生物活性肽，干细胞种子虽然经过筛选，但仍然存在感染风险。还有一些产品是通过直接裂解干细胞或其它活性细胞直接获得，蛋白成分复杂，虽然浓度高，但无效蛋白多，对人体也将是代谢压力。比如公告号为CN106381284A的专利，采用了异体脐带来源的干细胞超声破碎收集蛋白和多肽，此类方法获得的大量蛋白质都为胞内蛋白，虽然浓度高，但绝大部分不具有对皮肤细胞调节或修复的因子功能，况且大规模异体获得的脐带干细胞仍然有感染风险。

此外除了使用异体干细胞有感染风险外，大量使用异种血清也是重要的风险因素，适用人群对胎牛蛋白等的过敏会直接导致使用感受下降，例如公布号为CN102465148 A的专利，使用了胎牛血清作为培养基主要成分，胎牛血清成分复杂，而且会直接进入产品，引起过敏风险。培养基除了需要不含有动物血清以外，一些有可能造成皮肤损伤的内含物也必须去除，比如常用的干细胞培养基指示剂酚红和避免培养过程污染的抗生素。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其包括如下步骤：

S1：提取自体脂肪组织；

S2：利用所述自体脂肪组织制备原代脂肪干细胞；

S3：利用所述原代脂肪干细胞制备第五代脂肪干细胞，并获得细胞培养上清液；选择第五代脂肪干细胞，是一种质量控制的方式，更稳定也使干细胞状态最佳的代数。代数往后的细胞干细胞特性会不佳。

S4：将所述细胞培养上清液进行离心，弃上清并收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；

S5：进行超滤浓缩后，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，得到所述自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉。

作为优选方案，所述自体脂肪组织的提取方法为：

在局部麻醉的状态下，在腰腹部皮下注射膨胀液后，利用66.5～93.1kPa的负压进行脂肪抽取。

作为优选方案，所述膨胀液包含如下重量或体积的各组分：

作为优选方案，所述原代脂肪干细胞的制备方法为：

去除自体脂肪组织中的膨胀液后，用生理盐水对自体脂肪组织进行洗涤；

加入II型胶原酶溶液，进行消化后，离心消化产物，去除上层脂肪组织，保留沉淀和部分中间层溶液，得到原代脂肪干细胞。

作为优选方案，所述第五代脂肪干细胞的制备方法为：

配制干细胞培养基；

将所述原代脂肪干细胞接种于干细胞培养基中，在37℃、5v/v％CO₂的条件下培养，在培养7天左右观察到细胞集落，并继续培养；

当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下观察细胞背景变透亮，细胞间隙变大，轻轻拍打瓶壁，加入5毫升完全培养基终止消化，并反复冲洗培养瓶底部，将细胞悬液转移到50毫升离心管中，混匀计数，按照1*10⁵密度继续接种传代，2～4天细胞密度达到80～85％时重复以上操作，获得大量第五代脂肪间充质干细胞。

作为优选方案，所述冻干保护剂包括右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸。

作为优选方案，步骤S5中所述的冷冻干燥的具体操作为：

在-30℃下预冷4h；

在-25℃的温度、5Pa的负压下，冷冻过夜后，在30℃的温度、5Pa的负压下干燥1h。

本发明使用自体脂肪干细胞作为生物活性肽的来源，避免异体的感染和过敏风险；无动物源性无酚红指示剂和抗生素的培养方法；通过超滤和真空冷冻抽干，使得生物活性肽以冻干粉形式保存，方便稀释、运输和配置。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

合理方式收集干细胞培养上清液，经过一系列处理，在保证回收率的情况下，获得的未变性的生物因子活性肽冻干粉。这种冻干粉在低温下可以长期保存，便于运输，成分稳定的批量冻干粉。在简单的溶解、稀释步骤下，能够获得目的浓度的生物活性肽溶液，用于皮肤修复、皮肤护理、保养的产品生产；

现有技术中的脐带间充质干细胞来源于异体脐带组织，非自体，属于同种异体来源。本专利所申请自体脂肪干细胞生物活性肽通过采集自身脂肪获得干细胞来源。脐带组织来源丰富，采集简单，但是异体干细胞来源的产物需要严格筛选异体干细胞种子，不合格的干细胞种子会带来感染风险。有研究表明，脂肪干细胞相较于其它来源干细胞，例如脐带干细胞、骨髓干细胞、牙髓干细胞等，分泌的生物活性肽更为丰富，含量更高。

相比于现有技术中的脐带干细胞生物活性肽使用的是细胞裂解物，裂解物中蛋白成分复杂，虽然浓度高，但大多为无活性的细胞结构蛋白，本发明技术使用收集干细胞上清，上清中含大量分泌因子，多为对皮肤修复生长至关重要的营养、修复、再生因子。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为使用贴壁试剂培养10天(图1a)和不使用贴壁试剂培养10天(图1b)的效果对比图；

图2为自体脂肪干细胞P0(图2a)和自体脂肪干细胞P5(图2b)的对比图；

图3为P5代自体脂肪干细胞流式细胞图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本实施例涉及一种制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，包括如下步骤：

1、吸脂术采集自体脂肪组织。局部麻醉状态下吸脂术采集自体腰腹部脂肪

25-50ml净脂肪，配置1000毫升膨胀液包含：1％利多卡因40毫升、1毫克肾上腺素、8.4％碳酸氢钠20毫升，并用乳酸林格液配齐1000毫升。在腰腹部皮下注射50毫升膨胀液后负压66.5～93.1kPa(500～700mmHg)抽取100毫升脂肪。

2、制备原代脂肪干细胞。

将脂肪组织在4℃和1000g条件下离心，去除膨胀液，并用生理盐水洗涤后，获得纯净脂肪组织。加入等体积6％质量体积比(即100mL溶液中6毫克)的Ⅱ型胶原酶溶液，在37℃水浴环境下消化30分钟，加入终止液后充分混匀并1000g(重力加速度)离心消化产物，去除上层脂肪组织，保留沉淀和部分中间层溶液，获得原代脂肪干细胞。其中的消化液的配方为：6％质量体积比的Ⅱ型胶原酶、2％人血清白蛋白(即以生理盐水为溶剂，100mL溶剂中含有6mg II型胶原酶，2ml人血清白蛋白)。终止液为20毫升ClinicMACS溶液。

3、培养稳定第五代脂肪干细胞。

①在培养原代脂肪干细胞前一天预处理75cm²培养瓶。稀释商品化贴壁试剂至1％，吸取5毫升包被培养瓶，在4℃环境下过夜，备用。使用贴壁试剂可以提高原代脂肪干细胞的接种成功数量，提高产量缩短生产时间(图1a)，不使用贴壁试剂会减少细胞贴壁，减少产量(图1b)。

②配制干细胞培养基。采用无酚红无血清培养法，将基础培养基和血清替代物按照10v/v％的比例混合，配制成无血清完全培养基。此步骤不添加动物血清和抗生素，部分人对动物血清可能会过敏，造成副作用，本步骤避免此类反应。部分人对细胞培养过程中添加的抗生素过敏，本步骤不使用抗生素，避免此类反应。

③原代脂肪干细胞接种。将获得的原代脂肪干细胞按照1*10⁶/cm²密度接种在步骤①获得的培养瓶中，放置在设定为37℃，5％(压力比)CO₂的细胞孵箱中。在72小时后更换培养基。在培养7天左右观察到细胞集落(见图2a)，并继续培养。

④脂肪干细胞传代。当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下观察细胞背景变透亮，细胞间隙变大，轻轻拍打瓶壁，加入5毫升完全培养基终止消化，并反复冲洗培养瓶底部，将细胞悬液转移到50毫升离心管中，混匀计数，按照1*10⁵密度继续接种传代，2～4天细胞密度达到80～85％时重复以上操作，已获得大量P5代脂肪间充质干细胞(见图2b)。其中的传代消化液为0.25wt％胰酶。

⑤脂肪干细胞检测。台盼蓝染色法检测活率大于95％；流式细胞术检测细胞阳性标志物(CD73、CD90、CD105)大于90％；阴性标志物(CD31、CD34、CD45、HLA-DR)小于5％；快速内毒素检测小于0.5EU；衣原体和支原体检测阴性。见图3。

4、收集预处理脂肪干细胞培养上清液。根据细胞状态和个体差异，最后获得P5代脂肪间充质干细胞数目将在2*10⁹，同时获得脂肪干细胞培养上清液10～15升。收集干细胞培养上清，通过高速离心去除不溶物质和悬浮细胞，离心条件为4℃和16000g(重力加速度)，时间25分钟，弃上清并收集上清溶液。此步骤去除游离染色质、悬浮细胞和不溶大分子。将获得的溶液通过0.22μm过滤器去除细菌和残余不溶物质。

5、在4℃冷房环境内对获得溶液进行超滤浓缩，选用孔径在0.2nm的超滤膜，操作压力为0.35Mpa，进行超滤，浓缩上清液体体积，将10L液体超滤至500-800ml,混匀后转入一个新容器，本步骤可以去除上清液中多余的水，和绝大多数无机盐，这些无机盐对蛋白质稳定、产品使用都会有明显的副作用；

6、将步骤5获得的上清液加入冻干保护剂并转移到真空冷冻干燥机器中。

①预冷冷冻干燥机。设定-30℃预冷4小时；

②设定稳定在-25℃，在5帕负压下，操作过夜，将中溶液成分冻干成粉末状。

③设定30℃，保持5帕负压，继续干燥1小时。

其中的冻干保护剂为1wt％右旋糖苷、0.5wt％海藻糖、1.5wt％甘露醇和0.5wt％精氨酸的混合物，其中，右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸质量比为0.01：0.5：1.5：0.5。

7、将步骤6获得的冻干粉末压塞装入西林瓶，贴以标签。

冻干操作对样品回收比例的影响如表1所示，其中，非冻干样本7天样本回收比例(E组)；冻干样本7天样本回收比例(F组)；

表1、液体4℃保存7天和冻干7天后溶解浓度对比(pg/ml)：

因子	处理前浓度	E组浓度	E组回收率	F组浓度	F组回收率
						PDGF	42.41	15.73	37.1％	33.70	79.5％
bFGF	154.29	63.86	41.4％	148.65	96.3％
						KGF	76.55	23.04	30.1％	45.75	59.8％
TGF-β1	122.31	45.60	37.3％	97.99	80.1％
						HGF	880.64	401.49	45.6％	684.32	77.7％
Fibronectin	2570.67	1290.65	50.2％	2319.93	90.2％
						VEGF	790.50	586.76	74.2％	620.64	78.5％
Type I collagen	856.21	268.33	31.3％	823.96	96.2％

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：提取自体脂肪组织；

S2：利用所述自体脂肪组织制备原代脂肪干细胞；

S3：利用所述原代脂肪干细胞制备第五代脂肪干细胞，并获得细胞培养上清液；

S4：将所述细胞培养上清液进行离心，收集上清溶液，并对所述上清溶液进行过滤；

S5：进行超滤浓缩后，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，得到所述自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉。

2.如权利要求1所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，所述自体脂肪组织的提取方法为：

在局部麻醉的状态下，在腰腹部皮下注射膨胀液后，利用66.5～93.1kPa的负压进行脂肪抽取。

3.如权利要求2所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，所述膨胀液包含如下重量或体积的各组分：

4.如权利要求1所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，所述原代脂肪干细胞的制备方法为：

去除自体脂肪组织中的膨胀液后，用生理盐水对自体脂肪组织进行洗涤；

加入II型胶原酶溶液，进行消化后，离心消化产物，去除上层脂肪组织，保留沉淀和部分中间层溶液，得到原代脂肪干细胞。

5.如权利要求1所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，所述第五代脂肪干细胞的制备方法为：

配制干细胞培养基；

将所述原代脂肪干细胞接种于干细胞培养基中，在37℃、5v/v％CO₂的条件下培养，在培养7天左右观察到细胞集落，并继续培养；

当细胞融合度达80～85％时，用生理盐水温和冲洗培养瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室温放置30秒，并在显微镜下观察细胞背景变透亮，细胞间隙变大，轻轻拍打瓶壁，加入5毫升完全培养基终止消化，并反复冲洗培养瓶底部，将细胞悬液转移到50毫升离心管中，混匀计数，按照1*10⁵密度继续接种传代，2～4天细胞密度达到80～85％时重复以上操作，获得大量第五代脂肪间充质干细胞。

6.如权利要求1所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸。

7.如权利要求1所述的制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法，其特征在于，步骤S5中所述的冷冻干燥的具体操作为：

在-30℃下预冷4h；

在-25℃的温度、5Pa的负压下，冷冻过夜后，在30℃的温度、5Pa的负压下干燥1h。