CN110279893A - 一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的制剂 - Google Patents

一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种外泌体冻干粉及其制备方法以及包含该外泌体冻干粉的制剂，该外泌体冻干粉的制备方法包括以下步骤：富血小板因子血浆的制备：采取自体血液，离心制得，外泌体制备；自取自体脂肪，制得脂肪间充质干细胞，对间充质干细胞进行培养，制得；冻干液制备：将富血小板因子血浆、和外泌体混匀，向其中加入海藻糖，混匀，制得；冷冻干燥：将冻干液进行冷冻干燥，制得。该制剂包括外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，该制剂可有效解决现有的美容制剂存在填充效果差，维持时间短以及免疫排斥反应大的问题。

Description

一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的 制剂
技术领域
本发明涉及冻干制剂技术领域，具体涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法以及包含该外泌体冻干粉的制剂。
背景技术
随着年龄的增长，面部会逐渐出现凹陷、皱纹、皮肤老化等情况，这对于天生爱美的人来说是个不小的打击，如何使自己的面部和肌肤恢复到年轻状态，也成了他们孜孜以求的目标，随之诞生了各种面部填充材料和技术，比如，玻尿酸、脐带血制成品等等，但是目前的大多数填充材料都存在维持时间短、填充效果差或免疫排斥反应大，导致患者感受性差的问题。
外泌体是由胞吐作用释放到细胞外的纳米级外脂质双层囊泡，可存在于多种类型的细胞外体液中，如血液、尿液、羊水、唾液、脑脊液甚至母乳。研究发现，外泌体中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞，从而改变其它细胞的功能。如：外泌体参与神经元通信、抗原呈递、免疫反应、器官发育和生殖等基本的生理过程的调控，还参与调控癌症进展、心血管疾病、炎症、神经退行性疾病、病毒感染和朊病毒传播等病理过程。由于外泌体具备一系列有益功效，如何将其应用于自体面部填充方面，便显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种外泌体冻干粉及其制备方法和包含该外泌体冻干粉的制剂，该冻干粉可有效解决现有的美容制剂存在填充效果差，维持时间短以及免疫排斥反应大的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1、一种外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体血液，于800～2000g/min条件下离心6～12min，然后吸取中间部分，将其于-40～-80℃条件下冻存3～8h，取出冻融后于2000～4000rpm/min条件下离心6～10min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得脂肪间充质干细胞，对脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至75～85％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养20～30h后，收集细胞培养上清液，将其于2～6℃，800～1200g离心力条件下离心10～20min，弃去沉淀，再对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于2～6℃，80000～120000g离心力条件下离心1～4h，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再进行孵育，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，富血小板因子血浆和混合液的体积比为1～3:1～3，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为40～70mM，外泌体中白蛋白质量浓度为200～500ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于35～40℃条件下平衡20～50min，然后在-60～-80℃条件下预速冻8～14h，再在-30～-60℃，5～15Pa条件下冷冻干燥20～48h，制得。
进一步地，步骤(1)中自体血液于1500g/min的条件下离心10min，吸取中间部分，将其置于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min。
进一步地，步骤(2)中取P3-P6代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液。
进一步地，步骤(2)中将细胞培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下进行超滤浓缩，收集浓缩液。
进一步地，步骤(2)中将浓缩液于4℃，100000g的离心力条件下离心3h，重复离心3次，收集沉淀，得外泌体。
进一步地，步骤(3)中向外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬后，溶液中海藻糖的物质的量浓度为50mM，外泌体中白蛋白的质量浓度为400ug/ml。
进一步地，步骤(3)中的孵育温度为4℃，孵育时间为2～3h，孵育时每隔0.5h震荡一次。
进一步地，步骤(3)中混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1。
进一步地，步骤(4)中将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后将冻干液于-80℃条件下预速冻12h，再于-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括玻尿酸、生理盐水和上述方法制得的外泌体冻干粉，所述冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.3-0.5:0.1-0.5:99.5-99.9。
采取上述方案所产生的有益效果为：
1、本发明中将脂肪干细胞外泌体与富血小板因子血浆和玻尿酸相互协同作用，有效提高填充效果，延长填充部位维持时间；将脂肪干细胞外泌体制成冻干粉的形式，方便储存、运输及使用。
脂肪干细胞分泌的外泌体使用后可被成纤维细胞吸收，从内部可促进成纤维细胞迁移、增殖和胶原合成，同时促进高糖环境下血管祖细胞增殖和血管形成，富血小板因子血浆携带有生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等成分，从成纤维细胞外部促进刺激成纤维细胞增殖及胶原蛋白再生，外泌体和富血小板因子血浆分别从内外协同作用与成纤维细胞，促进细胞分化再生；玻尿酸在本发明中既作为支架材料，起到支撑和锁水作用，又缓释作用，将外泌体和富血小板因子血浆粘附于填充部位，避免两者流失，使两者缓慢发挥作用，进而，提高填充效果，延长填充时间。
2、本发明中的外泌体、富血小板因子血浆均来自于自体，降低了使用后产生感染和排异反应的风险。
3、外泌体冻干过程中富血小板因子血浆和海藻糖协同作用，降低外泌体膜内的玻璃化转变温度，减少外泌体在冻干过程中破裂的数量，避免外泌体内携带的有效成分流失，进而提高填充效果。
具体实施方式
实施例1
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于800g/min条件下离心6min，然后吸取中间部分，将其于-40℃条件下冻存3h，取出冻融后于2000rpm/min条件下离心6min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P3代脂肪间充质干细胞，对P3代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至75％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养20h后，收集细胞培养上清液，将其于2℃，800g离心力条件下离心10min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于2℃，80000g离心力条件下离心1h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:3，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为40mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为200ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于35℃条件下平衡20min，然后在-60℃条件下预速冻8h，再在-30℃，5Pa条件下冷冻干燥20h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.3:0.1:99.9。
实施例2
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于2000g/min条件下离心12min，然后吸取中间部分，将其于-80℃条件下冻存8h，取出冻融后于4000rpm/min条件下离心10min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P6代脂肪间充质干细胞，对P6代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至85％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养30h后，收集细胞培养上清液，将其于6℃，1200g离心力条件下离心20min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于6℃，120000g离心力条件下离心4h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育3h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为3:1，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为70mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为500ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于40℃条件下平衡50min，然后在-80℃条件下预速冻14h，再在-60℃，15Pa条件下冷冻干燥48h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.5:0.5:99.5。
实施例3
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于1500g/min条件下离心10min，然后吸取中间部分，将其于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P4代脂肪间充质干细胞，对P4代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液，将其于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于4℃，100000g离心力条件下离心3h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为50mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为400ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后在-80℃条件下预速冻12h，再在-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.4:0.4:99.6。
对比例1
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P4代脂肪间充质干细胞，对P4代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液，将其于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于4℃，100000g离心力条件下离心3h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(2)冻干液制备：向步骤(1)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得冻干液；其中，重悬液中海藻糖物质的量浓度为50mM，外泌体中白蛋白质量浓度为400ug/ml；
(3)冷冻干燥：将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后在-80℃条件下预速冻12h，再在-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.4:0.4:99.6。
对比例2
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于1500g/min条件下离心10min，然后吸取中间部分，将其于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P4代脂肪间充质干细胞，对P4代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液，将其于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于4℃，100000g离心力条件下离心3h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和蔗糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1，混匀，得冻干液；其中，混合液中蔗糖物质的量浓度为50mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为400ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后在-80℃条件下预速冻12h，再在-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉和生理盐水，外泌体冻干粉和生理盐水的料液比为0.4:0.4:99.6。
对比例3
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于1500g/min条件下离心10min，然后吸取中间部分，将其于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P7代脂肪间充质干细胞，对P7代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至60％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液，将其于4℃，1500g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为50K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于4℃，140000g离心力条件下离心3h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为50mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为400ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后在-80℃条件下预速冻12h，再在-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.2:0.1:99.9。
对比例4
一种外泌体冻干粉，其制备方法包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆制备：采取自体外周血液，于1500g/min条件下离心10min，然后吸取中间部分，将其于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆，备用；
(2)外泌体制备：吸取自体脂肪，制得P4代脂肪间充质干细胞，对P4代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液，将其于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于4℃，100000g离心力条件下离心3h，浓缩液重复上述步骤离心3次，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再在4℃条件下孵育1h，孵育时每隔0.5h震荡一次，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为50mM，混合液中外泌体中白蛋白质量浓度为400ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后在-50℃条件下预速冻12h，再在-20℃，50Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
一种外泌体制剂，包括上述外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水，外泌体冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.4:0.4:99.6。
试验例
实验人员：随机寻找70位面部衰老程度相同的人，将其平均分成7组，每组10人。
使用制剂：实施例1-3和对比例1-4中的外泌体制剂；
使用方法：将实施例1-3和对比例1-4中的外泌体冻干粉和玻尿酸用生理盐水混匀，然后用微针、滚针或水管针采用点注式的方式注入体验者面部；
注射后观察体验者面部是否出现免疫排斥反应，并进行记录，具体结果见表1。其中，出现免疫排斥反应的症状为：面部皮肤出现红肿、溃烂。
注射7天、30天、180天、360天和720天后观察体验者的面部状态，并采用+记录体验者的面部状态，具体结果见表2。
其中，+代表：面部皮肤出现皱纹、松弛、凹陷症状，恢复为原来的状态；
++代表：面部皮肤饱满度下降，薄弱部位出现皱纹；
+++代表：面部皮肤饱满度下降，弹性减弱；
++++代表：面部皮肤光滑度及弹性度下降；
+++++代表：面部皮肤状态饱满，光滑水润有弹性。
表1：免疫排斥反应记录表
每组人数(人) 出现排斥反应人数(人)
实施例1 10 0
实施例2 10 0
实施例3 10 0
对比例1 10 0
对比例2 10 0
对比例3 10 0
对比例4 10 0
通过上表得知，注射实施例1-3和对比例1-4中的外泌体制剂后，无人员出现免疫排斥反应。
表2：皮肤状态统计表
7天 30天 180天 360天 540天 720天
实施例1 +++++ +++++ +++++ +++++ ++++ +++
实施例2 +++++ +++++ +++++ +++++ ++++ +++
实施例3 +++++ +++++ +++++ +++++ ++++ ++++
对比例1 +++++ +++++ +++ ++ + +
对比例2 +++++ +++++ +++ ++ + +
对比例3 +++++ +++++ ++++ +++ ++ +
对比例4 +++++ +++++ ++++ +++ ++ +
通过上表得知，本发明1-3中的外泌体制剂对于面部填充均具有很好的效果，填充后无免疫排斥反应，且至少维持2年以上的时间，尤其是实施例3中的外泌体制剂，填充效果最好，维持时间最长。

Claims (10)

1.一种外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)富血小板因子血浆的制备：采取自体血液，于800～2000g/min条件下离心6～12min，然后吸取中间部分，将其于-40～-80℃条件下冻存3～8h，取出冻融后于2000～4000rpm/min条件下离心6～10min，去除底部固体碎片，得富血小板因子血浆；
(2)外泌体的制备：吸取自体脂肪，制得脂肪间充质干细胞，对脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至75～85％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养20～30h后，收集细胞培养上清液，将其于2～6℃，800～1200g离心力条件下离心10～20min，弃去沉淀，再对其进行超滤浓缩，收集浓缩液，将浓缩液于2～6℃，80000～120000g离心力条件下离心1～4h，收集沉淀，得外泌体；
(3)冻干液的制备：向步骤(2)中制得的外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬，再进行孵育，得混合液，向混合液中加入步骤(1)制得的富血小板因子血浆，富血小板因子血浆和混合液的体积比为1～3:1～3，混匀，得冻干液；其中，混合液中海藻糖物质的量浓度为40～70mM，外泌体中白蛋白质量浓度为200～500ug/ml；
(4)冷冻干燥：将冻干液于35～40℃条件下平衡20～50min，然后在-60～-80℃条件下预速冻8～14h，再在-30～-60℃，5～15Pa条件下冷冻干燥20～48h，制得。
2.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中自体血液于1500g/min的条件下离心10min，吸取中间部分，将其置于-80℃条件下冻存6h，取出冻融后于3000rpm/min条件下离心8min。
3.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中取P3-P6代脂肪间充质干细胞进行培养，待细胞融合度长至80％时，用生理盐水对细胞清洗，然后将细胞转入无血清培养基中培养24h后，收集细胞培养上清液。
4.如权利要求1或3所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将细胞培养上清液于4℃，1000g离心力条件下离心15min，弃去沉淀，再在载流量为100K条件下进行超滤浓缩，收集浓缩液。
5.如权利要求4所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将浓缩液于4℃，100000g的离心力条件下离心3h，重复离心3次，收集沉淀，得外泌体。
6.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中向外泌体中加入生理盐水和海藻糖重悬后，溶液中海藻糖的物质的量浓度为50mM，外泌体中白蛋白的质量浓度为400ug/ml。
7.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的孵育温度为4℃，孵育时间为2～3h，孵育时每隔0.5h震荡一次。
8.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中混合液和富血小板因子血浆的体积比为1:1。
9.如权利要求1所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(4)中将冻干液于37℃条件下平衡30min，然后将冻干液于-80℃条件下预速冻12h，再于-50℃，10Pa条件下冷冻干燥24h，制得。
10.一种外泌体制剂，其特征在于，包括玻尿酸、生理盐水和采用权利要求1-9中任一项方法制得的外泌体冻干粉，所述冻干粉、玻尿酸和生理盐水的料液比为0.3-0.5:0.1-0.5:99.5-99.9。
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