CN109517872A - 红景天苷在保护干细胞活性中的应用 - Google Patents

红景天苷在保护干细胞活性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及红景天苷在保护干细胞活性、增殖以及氧损伤中的应用，本发明所述红景天苷可有效促进脂肪间充质干细胞的增殖、迁移和生存活性，并且联合低氧处理通过抗氧化，抗凋亡和抗炎机制保护脂肪间充质干细胞。通过将其制备成各种制剂，且红景天苷在制剂中的重量百分比大于10％，能对干细胞有良好的保护作用。

Description

红景天苷在保护干细胞活性中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及红景天在保护干细胞活性中的应用。
背景技术
当前，干细胞治疗作为一种新型的治疗方案受到人们的重视。干细胞是一类具有高度增殖、自我复制能力的多潜能细胞，在一定的诱导条件下，它可以分化成多种功能细胞，可用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。根据干细胞的来源，可以分为骨髓间充质干细胞(MSCs)、脂肪间充质干细胞(ASCs)及神经干细胞等。其中源于脂肪组织的干细胞具有储量丰富、获取简便、创伤小、患者易于接受的特点，从而成为众多实验室的关注焦点。
ASCs目前被广泛应用于组织工程、损伤修复以及自身免疫性疾病等领域，这源于ASCs所具备的以下特性：
1)能够在体内向组织损伤部位进行迁移；
2)具有多向分化潜能，如分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞和神经细胞等；
3)可作为组织工程的种子细胞；
4)在体液调节中发挥作用；
5)抗炎氧化作用，抵抗各种状态下的自由基损伤；
6)作为基因治疗的载体。
对ASCs增殖、迁移、分化和活性的研究，对于ASCs结构和功能及其在组织工程、临床医学和医药开发中的应用具有十分重要的意义。
红景天，景天科红景天属(Rhodiola)植物红景天的干燥根和根茎，为青藏高原特色名贵中药材，因其可明显增强机体对一系列化学、生物学以及身体应激源的抵抗力而被研究人员归为“适应原”性药物。红景天苷(Salidroside，Sal)为其有效活性成份之一。大量研究证实，红景天苷具有抗低氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、保肝等作用。上世纪70年代以来，人们陆续发现红景天苷在抗炎抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤、清除自由基和抗菌抗病毒等方面有独特疗效，部分中成药或保健品已进入临床试验。而在心血管领域，红景天苷还具有显著的促进一氧化氮合成、减少前列素积累、抑制线粒体通透性转换孔开放等功能，以及增强心肺系统的耐低氧能力。但至今其在干细胞药理和疗法等方面研究还较少。
中国专利CN101225374B提供了红景天及红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细胞中的应用，尤其是红景天苷与细胞生长因子FGF-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞，但局限于骨髓间充质干细胞，且是对干细胞定向分化肝细胞的作用，而对细胞增殖、迁移和活性的保护作用缺乏；CN103436555B公开了携带miR-122的小鼠脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，和携带miR-122的成人脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，但转基因干细胞株的过程比较复杂、周期较长，且临床应用还比较困难；CN104845933A公开了一种增强脂肪间充质干细胞免疫调节功能和迁移能力的方法，但使用TLR3激活剂Poly(I:C)主要限制于免疫调节功能，且效果有限。
根据发明人的资料检索，至今未发现红景天苷用于制备干细胞活性保护药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供红景天与低氧协同在改善干细胞增殖和迁移中的用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
红景天苷在保护干细胞活性、增殖以及氧损伤中的应用。
优选地，所述红景天苷在低氧条件下保护干细胞活性、增殖以及氧损伤中的应用。
优选地，所述低氧条件指氧气的体积含量为2-14％。
优选地，所述低氧条件指氧气的体积含量为5％。
优选地，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
优选地，将红景天苷添加到干细胞培养液中保护干细胞活性、增殖以及氧损伤，所述红景天苷在所述干细胞培养液中的浓度为1-400μM。
优选地，所述将红景天苷在所述干细胞培养液中的浓度为50μM。
本发明还提供一种红景天苷在制备保护干细胞活性、增殖以及氧损伤的制剂中的应用。
优选地，所述制剂为注射制剂、冻干粉针剂、乳剂、胶囊制剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂。
优选地，所述红景天苷在制剂中的重量百分含量大于10％。
本发明的有益效果在于：本发明所述红景天苷可有效促进脂肪间充质干细胞的增殖、迁移和生存活性，且红景天苷与低氧协同通过抗氧化，抗凋亡和抗炎机制保护脂肪间充质干细胞。通过将其制备成各种制剂，且红景天苷在制剂中的重量百分比大于10％，能对干细胞有良好的保护作用。
附图说明
图1为常氧与低氧条件下红景天苷不同浓度对干细胞存活性的影响示意图(其中图A为各组处理3天的干细胞存活性，图B为各组处理5天的干细胞存活性)。
图2为红景天苷、低氧及红景天苷联合低氧处理对干细胞增殖的影响示意图(其中图A表示各组BrdU阳性细胞表达情况；图B表示各组BrdU阳性细胞表达率)。
图3为红景天苷、低氧及红景天苷联合低氧处理对干细胞迁移的影响示意图(其中图A为倒置显微镜下的细胞迁移情况；图B表示干细胞迁移数)。
图4为红景天苷、低氧及红景天苷联合低氧处理对干细胞Akt、Erk1/2和LC3表达水平的影响示意图(其中图A-C分别表示干细胞中p-Akt、p-Erk1/2和LC3-II/LC3-I的表达水平)。
图5为红景天苷、低氧及红景天苷联合低氧处理对干细胞氧化损伤的保护作用示意图(其中图A、B表示各组经PBS或H2O2处理后的细胞凋亡率；图C表示经TUNEL染色流式细胞术的细胞凋亡结果；图D表示各组经PBS或H2O2处理后CAT酶的活性)。
图6为红景天苷、低氧及红景天苷联合低氧处理对干细胞氧化损伤的保护作用示意图(其中图A-C分别表示各组经PBS或H2O2处理后的p-p38MAPK、Bax/Bcl-2和caspase-9变化情况；图D表示各组经PBS或H2O2处理后p-NF-кB p65水平变化情况)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例以及附图对本发明做进一步的详细描述。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：红景天苷与低氧协同处理对干细胞生长存活性的影响
(1)脂肪间充质干细胞培养
将大鼠脂肪间充质干细胞(购自Biosciences Inc.广州，中国)分别接植在75cm2培养瓶，培养于基础培养基，添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％青霉素和链霉素溶液。将细胞培养在5％CO2、37℃。每两天更换一次培养基，在大约80％汇合时传代。
(2)细胞存活性的检测方法
取对数生长期的细胞接种于96孔板，密度为3×103/板，血清剥夺24小时。在培养基中添加用不同浓度的红景天苷(分别为0、25、50、100、200和400μM)，在常氧条件下(20％O2，5％CO2)和低氧(5％O2、5％CO2和89％N2)条件下分别培养1天、3天和5天。使用增强型CCK-8试剂盒(碧云天，上海，中国)检测细胞活性。简而言之，100μL CCK-8溶液添加到每个孔。37℃孵育2小时候检测A450值。试验重复3次。
(3)实验结果
结果如图1(A、B)所示(常氧与低氧条件下红景天苷浓度为0μM的实验组分别作为对照组)低氧不影响第1天的细胞存活性(数据未显示)；低氧第3天表现出存活性增加情况(如图1A所示)，到第5天才有显著影响(如图1B所示)。在常氧条件下，添加了红景天苷的实验组(红景天苷的浓度分别为25、50、100、200和400μM)的细胞存活性均高于对照组的细胞存活性，说明红景天苷能提高细胞的存活性。在低氧条件下，添加了红景天苷的实验组的细胞存活性均高于其对照组的细胞存活性，且低氧与红景天苷协同实验组的细胞存活性均高于单独添加红景天苷和单独低氧处理的实验组。
总之，低氧条件下细胞的存活性大于常氧条件下的细胞活性，且50μM的红景天苷对细胞存活性的影响最为明显，因此，红景天苷浓度为50μM是本发明的最佳实施例。
实施例2：红景天苷与低氧协同处理对干细胞生长增殖的影响
(1)细胞培养分组处理
将大鼠脂肪间充质干细胞(购自Biosciences Inc.广州，中国)分别接植在75cm2培养瓶，培养于基础培养基，添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％青霉素和链霉素溶液。将细胞培养在5％CO2、37℃。每两天更换一次培养基，在大约80％汇合时传代。将第3代脂肪间充质干细胞分为对照组NC(常氧条件+基础培养基)，NS(常氧条件+50μM红景天苷)，HC组(低氧5％O2+基础培养基)，和HS组(低氧5％O2+50μM红景天苷)，每组细胞培养5天后进行检测。
(2)细胞增殖的检测方法
将培养细胞生长在13毫米的圆形盖玻片，用10μM BrdU终浓度孵育1小时，细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟后，用PBS洗涤，再用0.1％的Triton X-100的穿透膜。用1M HCl在冰上孵育10min，2M HCl在室温下孵育10min，用2μm的盐酸在37℃孵育后20分钟，使细胞DNA变性后，用0.1μm硼酸钠缓冲液，在室温下孵育12min，然后洗涤三次。用0.1％的Triton X-100，2％BSA的PBS室温下封闭1h，用抗BrdU抗体在4℃孵育，用PBS洗净后，将二抗以1:500比例稀释，37℃下孵育1h；最后，进行细胞核染色。每个盖玻片用激光扫描共聚焦显微镜观察，然后进行计数，盲数。20×物镜显微镜下计数五个视野的BrdU阳性细胞与总细胞。
(3)实验结果
脂肪间充质干细胞的DNA合成活性用BrdU掺入检测评估。脱氧核糖核酸可被插入复制的DNA链中，因此可以用作衡量细胞增殖的指标。如图2A所示，NS组、HC组与HS组的BrdU阳性细胞表达均高于NC组；且如图2B所示，HS组，显示出最高的BrdU阳性率。BrdU掺入的结果与低氧联合红景天苷协同处理干细胞的结果一致，表明红景天苷和低氧协同能增强脂肪间充质干细胞增殖。
实施例3：红景天苷与低氧协同处理对脂肪间充质干细胞迁移能力的影响
(1)细胞培养分组
将大鼠脂肪间充质干细胞(购自Biosciences Inc.广州，中国)分别接植在75cm2培养瓶，培养于基础培养基，添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1％青霉素链霉素溶液。将细胞培养在5％CO2、37℃。每两天更换一次培养基，在大约80％汇合时传代。将第3代脂肪间充质干细胞分为对照组NC(常氧条件+基础培养基)，NS(常氧条件+50μM红景天苷)，HC组(低氧5％O2+基础培养基)，和HS组(低氧5％O2+50μM红景天苷)，每组细胞处理5天后进行检测。
(2)细胞迁移能力的检测方法
Transwell迁移实验采用Transwell小室。首先将细胞用胰蛋白酶消化，使其悬浮在含0.5％胎牛血清的培养基中，然后将细胞(30000细胞/cm2)接种在Transwell小室，放置于含10％胎牛血清的培养基中，37℃孵育12h，用棉签轻轻擦掉上面的细胞。Transwell小室过滤器用4％多聚甲醛固定30min，用超纯水冲洗，并用0.1％晶体紫染色20分钟，然后对迁移到下表面的细胞进行观察和拍照，倒置显微镜下可见细胞，最后分析其迁移率。
(3)实验结果
结果如图3所示，红景天苷(NS组)、低氧(HC组)和低氧+红景天苷(HS组)穿透Transwell小室的细胞数分别为NC组的(1.59±0.09)倍、(1.71±0.07)和(1.98±0.08)倍，且具有统计学意义。此外，脂肪间充质干细胞用低氧处理+红景天苷(HS组)较红景天苷(NS组)细胞数明显。总之，红景天苷和低氧单独处理均能提高脂肪间充质干细胞的迁移能力；但红景天苷与低氧协同处理较其单独处理提高脂肪间充质干细胞的迁移能力效果更佳。
实施例4：红景天苷与低氧协同处理与脂肪间充质干细胞Akt、Erk1/2和LC3表达水平的影响
(1)细胞分组处理
将第3代脂肪间充质干细胞分为对照组NC(常氧条件+基础培养基)，NS(常氧条件+50μM红景天苷)，HC组(低氧5％O2+基础培养基)，和HS组(低氧5％O2+50μM红景天苷)，每组细胞处理5天。
(2)检测方法
通过蛋白质印迹的方法检测，先用RIPA Buffer将细胞裂解，然后利用BCA法测定蛋白浓度。简而言之，蛋白质(15μG)是由10％的SDS-PAGE凝胶变性分离并电到PVDF膜。膜与抗β肌动蛋白孵育(1:1000)，抗Akt(1:2000)，p-Akt(Ser473，1:2000)，anti-Erk1/2(1:1000)，anti-p-Erk1/2(thr202/try204，1:1000)，anti-LC3α/B(1:1000)，一个TI的NF-κB-p65(1:1000)，anti-p-NF-κB-p65(ser536，1:1000)，anti-p38MAPK(1:1000)，anti-p-p38MAPK(1:1000)，anti-caspase-9(1:1000)，anti-cleaved-caspase-9(1:5000)，抗Bcl-2(1:1000)和Bax(1:1000)抗体(CST，美国)至少在4℃孵育16h，用羊抗兔IgG(1:2000，CST，美国)在室温下孵育1h。ECL显影。通过图像分析软件计算灰度值(美国国家卫生院)。
(3)实验结果
Akt、Erk1/2和LC3相关通路参与细胞存活和增殖，因此可以作为细胞增殖与存活检测指标，p-Akt及p-Erk1/2水平用磷酸化与总蛋白的比值表示。结果如图4(A、B)所示，红景天苷组(NC组)、低氧处理(HC组)与低氧+红景天苷处理(HS组)与对照组(NC组)相比均显示为p-Akt及p-Erk1/2增加，且低氧处理(HC组)与低氧+红景天苷处理(HS组)较对照组(NC组)具有显著改变；低氧和红景天苷联合处理(HS组)与低氧处理(HC组)比较，显示p-Akt及p-Erk1/2水平较高。如图4C所示，红景天苷(NC组)、低氧处理(HC组)或低氧+红景天苷处理(HS组)增加了LC3-II/LC3-I的比值。此外，低氧+红景天苷处理(HS组)比与红景天苷(NC组)或低氧处理(HC组)处理比较，p-Akt、p-Erk1/2和LC3-II/LC3-I显著增高。这些结果表明，低氧联合红景天苷处理能通过调节Akt和Erk1/2通路促进细胞增殖。此外，红景天苷和低氧可能协同增强脂肪间充质干细胞的自噬活性。
实施例5红景天苷与低氧协同处理对干细胞氧化损伤的保护作用
(1)细胞分组处理
将第3代脂肪间充质干细胞分为对照组NC(常氧条件+基础培养基)，NS(常氧条件+50μM红景天苷)，HC组(低氧5％O2+基础培养基)，和HS组(低氧5％O2+50μM红景天苷)，每组细胞培养5天后用PBS或H2O2处理24h。
(2)过氧化氢(H2O2)诱导的干细胞损伤方法
由400μM H2O2诱导24h使干细胞死亡，干细胞用4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用原位细胞凋亡检测试剂盒(罗氏、Switzerland)进行TUNEL染色，细胞用0.1％Triton-100溶液，TUNEL反应混合物孵育。最后，细胞核用1μg/mL DAPI染色。用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测Apoptosis(BD pharmingen，美国)。按照制造商的指示进行。细胞被用EDTA胰蛋白酶消化成单细胞悬液。染色后用流式细胞仪(FCM)在一个小时内检测细胞凋亡的情况。
(3)实验结果
如图5(A、B)所示，NC预处理后再用PBS处理显示(20.5±0.24％)的晚期凋亡率，而用400μM的H2O2处理可明显诱导更高的细胞凋亡率(33.6±1.62％)。红景天苷(NS组)与低氧(HC组)预处理均能抑制H2O2诱导的细胞凋亡，并且联合预处理(HS组)可进一步提高保护效果。TUNEL染色证实了流式细胞术的细胞凋亡结果(如图5C所示)。
对脂肪间充质干细胞的提取物进行了CAT活性测定。如图5D所示，在H2O2处理24小时导致CAT酶活性显著降低；而红景天苷(NS组)、低氧(HC组)或低氧+红景天苷(HS组)预处理均可减轻H2O2诱导的CAT失活。重要的是，在低氧+红景天苷(HS组)预处理和H2O2处理后，CAT酶活性的变化呈现出明显的变化，其水平较NS+H2O2和HC+H2O2组都高，说明低氧与红景天苷协同处理能减轻氧损伤。
采用Western blot法检测Bax/Bcl-2比值水平，p-p38MAPK和caspase-9的活性变化。结果发现，p-p38MAPK，Bax/Bcl-2和caspase-9在H2O2处理的各组有所增加，除了HS+H2O2组(图6A-C)。与NC+H2O2组相比，NS或HS预处理后经H2O2处理表现为Bax/Bcl-2比值，p-p38MAPK和活化的caspase-9水平显著降低，而HC+H2O2组无统计学差异(图6A-C)。
NF-κB的激活响应了H2O2刺激，表现为NF-κB p65的磷酸化。图6D表明在NC、NS或HC预处理后，用H2O2处理显著增加p-NF-кB p65。与NC+H2O2组相比，NS、HC或HS预处理后H2O2处理可显著减少在p-NF-кB p65水平，低氧+红景天苷(HS组)预处理具有最明显的抑制效果(图6D)。
上述实验结果表明，红景天苷和低氧协同预处理可协同抑制H2O2介导的细胞毒作用和NF-κB的激活，表明红景天苷和低氧通过抗氧化，抗凋亡和抗炎机制保护脂肪间充质干细胞。
实施例6
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成注射制剂，红景天苷在所述注射制剂中的重量百分含量为10％。
实施例7
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成冻干粉针剂，红景天苷在所述冻干粉针剂中的重量百分含量为10％。
实施例8
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成乳剂，红景天苷在所述乳剂中的重量百分含量为10％。
实施例9
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成胶囊制剂，红景天苷在所述胶囊制剂中的重量百分含量为10％。
实施例10
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成颗粒剂，红景天苷在所述颗粒剂中的重量百分含量为10％。
实施例11
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成散剂，红景天苷在所述散剂中的重量百分含量为10％。
实施例12
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成片剂，红景天苷在所述片剂中的重量百分含量为10％。
实施例13
取红景天苷为原料药，加入制备保护干细胞制剂的其他辅料，制备成丸剂，红景天苷在所述丸剂中的重量百分含量为10％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.红景天苷在保护干细胞活性、增殖以及氧损伤中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红景天苷在低氧条件下保护干细胞活性、增殖以及氧损伤中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述低氧条件指氧气的体积含量为2-14％。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述低氧条件指氧气的体积含量为5％。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将红景天苷添加到干细胞培养液中保护干细胞活性、增殖以及氧损伤，所述红景天苷在所述干细胞培养液中的浓度为1-400μM。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述将红景天苷在所述干细胞培养液中的浓度为50μM。
8.红景天苷在制备保护干细胞活性、增殖以及氧损伤的制剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为注射制剂、冻干粉针剂、乳剂、胶囊制剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述红景天苷在制剂中的重量百分含量大于10％。
CN201811354319.9A 2018-10-15 2018-11-14 红景天苷在保护干细胞活性中的应用 Active CN109517872B (zh)

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