CN110179826A - 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法 - Google Patents

人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110179826A
CN110179826A CN201910455752.XA CN201910455752A CN110179826A CN 110179826 A CN110179826 A CN 110179826A CN 201910455752 A CN201910455752 A CN 201910455752A CN 110179826 A CN110179826 A CN 110179826A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
umbilical cord
final concentration
human umbilical
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910455752.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110179826B (zh
Inventor
刘韦成
朱霞
朱子豪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Wuzhou Runda Biomedical Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Wuzhou Runda Biomedical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Wuzhou Runda Biomedical Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Wuzhou Runda Biomedical Technology Co Ltd
Priority to CN201910455752.XA priority Critical patent/CN110179826B/zh
Publication of CN110179826A publication Critical patent/CN110179826A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110179826B publication Critical patent/CN110179826B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法，该方法以临床孕妇产后丢弃的脐带组织为材料，获得有医学价值的人脐带间充质干细胞以及人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡，产品均一性良好、生产效率高，利于大规模生产，且避免了医学伦理问题。该方法在人脐带间充质干细胞培养及扩增过程中严格操作流程，全过程在百万级细胞实验室进行且未使用抗生素，避免了可能造成的干细胞性状改变以及对人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡品质的影响，引发组织过敏反应；使用优化的无血清人脐带间充质干细胞培养基，避免动物源血液成分混入悬液造成人体组织过敏；微囊泡悬液制备的冻干粉便于保存，为后续产品制作提供便利。

Description

人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法。
背景技术
人脐带间充质干细胞具有组织修复，免疫调节等生物学功能，但是因为人脐带间充质干细胞外用可能造成皮肤毛孔、皮脂腺等堵塞造成局部皮肤炎症甚至皮肤过敏、以及长期异常分化和成瘤等风险，造成其在整形美容外科尤其在皮肤修复临床应用受限。人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡是人脐带间充质干细胞在特殊诱导状态下产生能够有效模拟人脐带间充质干细胞功能膜性球状结构，因为微囊泡内含有人脐带间充质干细胞分泌的所有生物活性物质，因此能够发挥同人脐带间充质干细胞相同的生物学功能，同时避免人脐带间充质干细胞可能造成的皮肤过敏，异常分化甚至成瘤风险，具有在整形美容外科尤其在皮肤修复临床应用的巨大潜力。
然而，现有技术仅仅只能在实验室进行人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡的制备及研究，无法满足大规模生产需要。现有制备技术主要存在以下几个方面的缺陷：
(1)现有生产人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡过程大多应用含有动物血清培养基保证细胞活力，但是会造成动物源血液成分混入悬液造成人体组织过敏，影响产品临床应用，少数应用无血清培养基因为细胞活力受影响，获取微囊泡效率较低，产品均一性受到影响造成无法应用大规模生产。
(2)现有技术为了避免污染，在微囊泡制备过程使用抗生素应用于培养基，可能影响细胞状态及微囊泡制备。
(3)目前人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制备通常采用P3细胞制备，生成微囊泡总量有限，不利于大规模生产以及产品均一性控制。细胞进行传代使用胰蛋白酶，可能造成外源性蛋白污染影响后续微囊泡生成品质。
(4)现有技术制备微囊泡均以悬液形式保存，然而，常温保存状态下的微囊泡及囊泡内活性成分极易降解，即使在低温保存状态，悬液所含的微囊泡及囊泡内的活性成分依然会降解，因此，微囊泡悬液无法长期保存的问题限制了其应用范围。
发明内容
针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法，其中微囊泡是人脐带间充质干细胞经诱导产生的保留了人脐带间充质干细胞功能膜性球状结构，该方法利用临床孕妇产后直接丢弃的脐带组织为材料，获得有部分医学价值的人脐带间充质干细胞以及人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡，该方法操作简单，避免了医学伦理问题，获得的产品均一性良好、生产效率高，利于大规模生产。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，所述方法包括：
步骤1、获取原代人脐带间充质干细胞；
步骤2、人脐带间充质干细胞的培养及扩增；
步骤3、以步骤2的人脐带间充质干细胞为材料制备干细胞因子微囊泡悬液；
所述步骤1中以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理人脐带，并用含抗生素的干细胞培养基培养初期原代人脐带间充质干细胞；
所述步骤2中以不含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理细胞，并用不含抗生素的干细胞培养基培养人脐带间充质干细胞。
进一步地，所述步骤1的含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中庆大霉素终浓度50μg/ml、两性霉素B终浓度2.5μg/ml、青霉素终浓度100U/ml、链霉素终浓度100μg/ml。
进一步地，所述步骤1的含抗生素的干细胞培养基中庆大霉素终浓度50μg/ml、两性霉素B终浓度2.5μg/ml、青霉素终浓度100U/ml、链霉素终浓度100μg/ml；所述含抗生素的干细胞培养基选自MesenCultTM-ACF Plus Medium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCultTM-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，其中转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm/L。
进一步地，所述步骤1中获取原代人脐带间充质干细胞的具体操作为：
(1)无菌获取足月儿脐带，置于4℃含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中保存备用；
(2)在百万层级细胞实验室内，以无菌手术器械去除脐带两端，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤脐带组织内残留血液，再将脐带置于含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中纵行剖开去除脐血管和羊膜组织，剩余组织用含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗；
(3)将剩余组织剪碎，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤，离心去上清后，加入终浓度为20g/LⅣ型胶原酶37℃培养箱消化12h，4℃200g匀速离心3min，弃上清；再加入终浓度20g/L不含Ca2+、Mg2+的胰酶，37℃、5％CO2细胞培养箱消化15min；
(4)以DMEM/F12培养基重悬终止消化，补足量含抗生素的干细胞培养基，重悬后置于细胞培养箱继续培养5天；所述DMEM/F12培养基中添加终浓度为50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清；
(5)以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗细胞4-8次，补足量含抗生素的干细胞培养基继续培养；待融合度至80％后，完全丢弃培养基，以4℃含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次，再以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次；
(6)以Animal Component-Free Enzymatic Dissociation Solution 37℃、5％CO2消化直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起，再以Animal Component-Free EnzymeInhibition Solution终止消化。
进一步地，所述步骤2的不含抗生素的干细胞培养基选自MesenCultTM-ACF PlusMedium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCultTM-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm/L。
进一步地，所述步骤2中人脐带间充质干细胞的培养及扩增具体操作为：
(1)步骤1的原代人脐带间充质干细胞接种于不含抗生素的干细胞培养基中传代培养；
(2)选取P5代细胞，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞；
(3)消化直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起，终止消化，细胞于不含抗生素的干细胞培养基中继续培养；
(4)直到细胞生长融合度至80％，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水以及不含抗生素的DMEM/F12基础培养基分别依次冲洗细胞，然后补足不含抗生素的DMEM/F12基础培养基继续培养24-48h，收集所有DMEM/F12基础培养基，离心收集上清液，去除脱离贴壁细胞以及死亡细胞。
更进一步地，所述步骤(3)以Animal Component-Free Enzymatic DissociationSolution消化，以Animal Component-Free Enzyme Inhibition Solution终止消化。
进一步地，所述步骤3的具体操作为：
(1)将步骤2的上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃6000×g离心30min，收集上清液，去除细胞碎片组织；
(2)将所有上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃120000×g离心80min，完全移除上清，再以4℃不含抗生素的无菌医用生理盐水重悬洗涤沉淀；
(3)将所有重悬液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃100000×g离心60min，完全移除上清，再以4℃含冻存保护剂成分的无抗生素无菌医用生理盐水重悬沉淀直至重悬液体澄清，调整蛋白浓度为0.5mg/ml，过滤获取干细胞因子微囊泡悬液；按质量浓度计，所述含冻存保护剂成分无抗生素无菌医用生理盐水中海藻糖终浓度为5％，甘氨酸终浓度为0.25％，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度为0.5％。
一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉，所述冻干粉由上述任一项所述人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液冻干制备而成。
进一步地，所述冻干粉是通过如下方法制备的：
(1)将上述任一项所述的人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液分装于无菌、无热源、无过敏源、医用硼硅玻璃管制注射剂瓶中，半压塞，移入无菌百万级细胞间的冻干机上，1小时内降温至-40℃以下并维持1小时；
(2)无菌百万级细胞间内抽真空，压力8Pa；然后升温至-5℃，保温5小时，完成升华干燥过程；
(3)继续升温至28℃，保温2小时，完成解析干燥过程；
(4)冻干结束后，真空状态下无菌完成全压塞，成品取出冻干机，完成无菌外包装全轧盖，即制备得到人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液冻干粉，4℃保存。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明的技术方案利用临床孕妇产后直接丢弃的脐带组织为材料，获得有部分医学价值的人脐带间充质干细胞以及人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡，有效避免医学伦理问题。
(2)本发明的方法制定最佳制备人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液时间，最大限度提升每批次人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液产量，便于后续大规模生产时进行质量控制以及降低成本，步骤明确，操作简单高效，成本低廉；制备的人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡稳定性高，生产效率高，产品均一性良好，利于大规模生产。
(3)本发明优化了原代人脐带间充质干细胞获取步骤，此步骤中使用的医用无菌注射级别生理盐水和初期原代人脐带间充质干细胞培养所使用的干细胞培养基均用抗生素处理，从而使自P1细胞起干细胞培养以及扩增过程均使用完全不含任何抗生素成分的无菌医用生理盐水和干细胞培养基，防止抗生素影响后续微囊泡的生成以及品质；本发明在所有干细胞培养过程采用MesenCultTM-ACF Plus Medium(添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L)或者成分优化及无血清人脐带间充质干细胞专用级培养基进行培养，在保证细胞良好状态以及不影响微囊泡生成基础上，避免外源性致敏源比如动物血清对人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡及其冻干粉产品的影响；同时优化了细胞传代技术，采用AnimalComponent-Free Enzymatic Dissociation Solution及Animal Component-Free EnzymeInhibition Solution消化传代细胞，避免外源性蛋白例如胰酶等对人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡及其冻干粉产品影响；在全部细胞培养过程中(脐带处理、初期原代人脐带间充质干细胞获取以及培养除外)严格操作流程，均在百万级细胞实验室进行全过程，从而保证自P1人脐带间充质干细胞起干细胞培养扩增过程均使用完全不含任何抗生素成分的无菌医用生理盐水和干细胞培养基，避免使用抗生素可能造成干细胞性状改变以及可能影响到人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂品质，造成人体组织过敏反应。因此，该方法无污染、无致热源性、无感染源性、无致敏原性，为人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂在医美以及整形行业项目的广泛使用提供充分的安全保障。
(4)本发明制备的人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉产品稳定性良好，便于常温进行保存运输，也可放置4℃冰箱长期保存。
附图说明
图1为实施例1中原代人脐带间充质干细胞传代培养5天后细胞生长情况示意图。
图2为实施例1中原代人脐带间充质干细胞传代培养2周后细胞生长情况示意图。
图3为实施例1中P5代人脐带间充质干细胞特征性表面分子表达情况，其中图3A、图3B、图3C分别表明培养P5代人脐带间充质干细胞表面标志CD29、CD44、CD105(人脐带间充质干细胞表面标志)均高表达，图3D、3E分别表明培养P5代人脐带间充质干细胞表面标志CD34、HLA-DR(人造血干细胞表面标志)均不表达。
图4为实施例1中培养P5代人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡扫描电镜图。
具体实施方式
下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。实施例中Animal Component-Free Enzymatic Dissociation Solution和AnimalComponent-Free Enzyme Inhibition Solution均购自stemcell technologies公司。
实施例1：
1、获取原代人脐带间充质干细胞
(1)无菌获取足月儿脐带，置于4℃且装有无菌注射级别生理盐水的无菌袋中，其中无菌注射级别生理盐水中含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将无菌袋放置于无菌储存钢瓶4℃保存，并迅速运送至百万层级细胞实验室进行分离制备；
(2)将脐带置于培养皿内放在细胞操作台内，以无菌手术器械去除脐带两端各5cm长度，以4℃生理盐水洗涤脐带组织内残留血液，再将脐带置于4℃医用无菌注射级别生理盐水纵行剖开，去除脐血管，完整去除羊膜组织，再用4℃医用无菌注射级别生理盐水充分冲洗剩余间充质组织8次，每次浸泡2分钟。本步骤中医用无菌注射级别生理盐水均含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
(3)将间充质组织以无菌器械剪碎成0.8-1.5mm3组织块，以4℃的医用无菌注射级别生理盐水重悬洗涤三次，4℃200g匀速离心3min，弃上清，加入终浓度20g/LⅣ型胶原酶37℃培养箱消化12h，4℃200g匀速离心3min，弃上清，加入终浓度20g/L不含Ca2+、Mg2+胰酶37℃、5％CO2细胞培养箱消化15min。本步骤中医用无菌注射级别生理盐水均含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。本实施例中配制胰酶时，采用的是不含Ca2+、Mg2+离子的D-Hanks液。
(4)以4℃含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、体积浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基2ml重悬终止消化，细胞计数后补足4℃的MesenCultTM-ACF Plus Medium(添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L)或者无血清人脐带间充质干细胞培养基以2000细胞/cm2重悬后37℃、5％CO2细胞培养箱继续培养，其中无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，其中转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm/L；MesenCultTM-ACF Plus Medium和无血清人脐带间充质干细胞培养基中均含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
(5)初期原代人脐带间充质干细胞完全贴壁生长(大约5天)，细胞生长情况如图1所示，以4℃且含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素医用无菌注射级别生理盐水冲洗细胞6次，补足4℃的MesenCultTM-ACF Plus Medium(添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L)或者无血清人脐带间充质干细胞培养基(与步骤(4)培养基相同)继续37℃、5％CO2细胞培养箱培养，待融合度至80％后(大约2周时间)，细胞生长情况如图2所示，完全丢弃培养基，以4℃且含50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次。再以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次。
(6)再以Animal Component-Free Enzymatic Dissociation Solution 37℃、5％CO2培养箱消化数分钟直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起(或者边缘光滑)即为消化完毕标准(每分钟要观察)，再以Animal Component-Free Enzyme Inhibition Solution终止消化。
2、人脐带间充质干细胞的培养
(1)细胞计数后以补足量4℃干细胞培养基，以2000细胞/cm2重悬后置37℃、5％CO2细胞培养箱继续培养。记为P1代细胞。每次细胞生长融合度至80％后进行扩增，后续每次细胞传代之前均用不含抗生素4℃无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次。
其中干细胞培养基包括含L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L的MesenCultTM-ACF PlusMedium和无血清人脐带间充质干细胞培养基，无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，其中转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm/L。所有配置好培养基均放置4℃保存，应在2周内使用。
(2)选取P5代细胞，生长融合度至80％后(大约2周时间)，彻底丢弃干细胞培养基，以4℃无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次。再以Animal Component-Free EnzymaticDissociation Solution 37℃培养箱消化数分钟直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起(或者边缘光滑)即为消化完毕标准(每分钟要观察)，再以Animal Component-FreeEnzyme Inhibition Solution终止消化，细胞计数后补足量4℃干细胞培养基以8000细胞/cm2重悬后置37℃、5％CO2细胞培养箱继续培养。
(3)直到细胞生长融合度至80％(大约2周时间)，完全丢弃培养基，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水以及DMEM/F12基础培养基分别依次冲洗细胞三次，取部分细胞进行流式细胞术检测人脐带间充质干细胞特征性表面分子表达(图3)，然后补足4℃DMEM/F12基础培养基继续37℃、5％CO2细胞培养箱培养24-48h。该步骤中所用的DMEM/F12基础培养基不含任何抗生素成分、不含任何动物血清成分、不含任何外来蛋白成分以及可能对人体组织造成伤害成分，DMEM/F12基础培养基厂家为ThermoFisher SCIENTIFIC。
(4)收集所有DMEM/F12基础培养基，无菌级操作间，高速离心机4℃，1800×g离心8min，收集上清液，去除脱离贴壁细胞以及死亡细胞。
3、制备干细胞因子微囊泡悬液
(1)将所有上清液无菌分装高速离心管，无菌级操作间，高速离心机4℃，6000×g离心30min，收集上清液，去除细胞碎片组织。
(2)将所有上清液无菌分装高速离心管，无菌级操作间，高速离心机4℃，120000×g离心80min，完全移除上清，再以4℃无菌医用生理盐水重悬洗涤沉淀。
(3)将所有重悬液无菌分装于50ml高速离心管中，在无菌级操作间的高速离心机中4℃、100000×g离心60min，完全移除上清获得微囊泡沉淀物；每管沉淀物均以1ml的4℃无菌医用生理盐水(包含冻存保护剂成分：按质量浓度计，海藻糖终浓度5％、甘氨酸终浓度0.25％、L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度0.5％)轻柔重悬直至重悬液体澄清，收集混合所有重悬液体后，调整其蛋白浓度为0.5mg/ml；然后采用Millipore专用0.22μm滤器过滤(可以考虑再次用0.45mm超滤膜去除直径大于450mm微囊泡)获得微囊泡悬液(如图4)，其扫描电镜结果显示形态大小符合要求。
4、干细胞因子微囊泡悬液冻干粉的制备
(1)按照500μl装量将混匀重悬液体分装于2ml无菌、无热源、无过敏源、医用硼硅玻璃管制注射剂瓶中，开始使用半压塞，将所有样品移入冻干机，通过1小时降温至-40℃以下并维持1小时。
(2)无菌百万级细胞间内抽真空，压力8Pa；然后升温至-5℃，保温5小时，完成升华干燥过程。
(3)继续升温至28℃，保温2小时，完成解析干燥过程。
(4)冻干结束后真空状态硼硅玻璃管无菌完成全压塞，所有成品取出冻干机，完成无菌外包装全轧盖，即制备得到人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉，放置4℃冰箱长期保存。
实施例2：冻干粉的稳定性测试
将在4℃冰箱保存半年后的冻干粉用无菌生理盐水溶解，浓度为0.22mg/mL，无菌生理盐水总量为1ml；同时，以制备完成的冻干粉立即溶于无菌生理盐水形成的溶液(浓度为0.25mg/mL，总量为1ml)为对照，ELISA法检测三种代表性人脐带间充质干细胞因子的表达水平，如表1所示。
表1 ELISA法检测人脐带间充质干细胞分泌代表细胞因子VEGF、GEF、FGF浓度
注：本实施例中每次溶解冻干粉制备冻干粉检测试剂时，均使用无菌生理盐水为溶剂，无菌生理盐水总量为1ml。
表1数据表明，通过本方案制备的人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉性质稳定，所包含的干细胞因子成分经过较长时间储存依然保持稳定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，包括但不限于将本技术流程应用于人脐带血干细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞以及骨髓间充质干细胞等用以制备相应干细胞来源的干细胞因子微囊泡极其冻干粉产品，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1、获取原代人脐带间充质干细胞；
步骤2、人脐带间充质干细胞的培养及扩增；
步骤3、以步骤2的人脐带间充质干细胞为材料制备干细胞因子微囊泡悬液；
所述步骤1中以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理人脐带，并用含抗生素的干细胞培养基培养初期原代人脐带间充质干细胞；
所述步骤2中以不含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水处理细胞，并用不含抗生素的干细胞培养基培养人脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤1的含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中庆大霉素终浓度50μg/ml、两性霉素B终浓度2.5μg/ml、青霉素终浓度100 U/ml、链霉素终浓度100μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤1的含抗生素的干细胞培养基中庆大霉素终浓度50μg/ml、两性霉素B终浓度2.5μg/ml、青霉素终浓度100U/ml、链霉素终浓度100μg/ml；所述含抗生素的干细胞培养基选自MesenCultTM-ACF Plus Medium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCultTM-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，其中转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH7.4，渗透压浓度338mOsm/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤1中获取原代人脐带间充质干细胞的具体操作为：
(1)无菌获取足月儿脐带，置于4℃含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中保存备用；
(2)在百万层级细胞实验室内，以无菌手术器械去除脐带两端，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤脐带组织内残留血液，再将脐带置于含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水中纵行剖开去除脐血管和羊膜组织，剩余组织用含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗；
(3)将剩余组织剪碎，以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水洗涤，离心去上清后，加入终浓度为20g/LⅣ型胶原酶37℃培养箱消化12h，4℃200g匀速离心3min，弃上清；再加入终浓度20g/L不含Ca2+、Mg2+的胰酶，37℃、5％CO2细胞培养箱消化15min；
(4)以DMEM/F12培养基重悬终止消化，补足量含抗生素的干细胞培养基，重悬后置于细胞培养箱继续培养5天；所述DMEM/F12培养基中添加终浓度为50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清；
(5)以含抗生素的医用无菌注射级别生理盐水冲洗细胞4-8次，补足量含抗生素的干细胞培养基继续培养；待融合度至80％后，完全丢弃培养基，以4℃含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次，再以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞三次；
(6)以Animal Component-Free Enzymatic Dissociation Solution 37℃、5％ CO2消化直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起，再以Animal Component-Free EnzymeInhibition Solution终止消化。
5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤2的不含抗生素的干细胞培养基选自MesenCultTM-ACF PlusMedium或无血清人脐带间充质干细胞培养基，所述MesenCultTM-ACF Plus Medium添加L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L；所述无血清人脐带间充质干细胞培养基以DMEM/F12培养基作为基础培养基，转化生长因子β1终浓度2.2μg/L，人胰岛素终浓度19.5mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度66mg/L，转铁蛋白终浓度10.8mg/L，亚硒酸钠终浓度15μg/L，人纤维母细胞生长因子2终浓度98μg/L，碳酸氢钠终浓度546mg/L，NODAL终浓度98μg/L，L-谷氨酰胺终浓度2mmol/L，pH 7.4，渗透压浓度338mOsm/L。
6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤2中人脐带间充质干细胞的培养及扩增具体操作为：
(1)步骤1的原代人脐带间充质干细胞接种于不含抗生素的干细胞培养基中传代培养；
(2)选取P5代细胞，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水冲洗细胞；
(3)消化直至显微镜下观察贴壁细胞80％完全漂起，终止消化，细胞于不含抗生素的干细胞培养基中继续培养；
(4)直到细胞生长融合度至80％，以4℃不含抗生素的无菌医用注射级别生理盐水以及不含抗生素的DMEM/F12基础培养基分别依次冲洗细胞，然后补足不含抗生素的DMEM/F12基础培养基继续培养24-48h，收集所有DMEM/F12基础培养基，离心收集上清液，去除脱离贴壁细胞以及死亡细胞。
7.根据权利要求6所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)以Animal Component-Free Enzymatic DissociationSolution消化，以Animal Component-Free Enzyme Inhibition Solution终止消化。
8.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：
(1)将步骤2的上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃6000×g离心30min，收集上清液，去除细胞碎片组织；
(2)将所有上清液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃120000×g离心80min，完全移除上清，再以4℃不含抗生素的无菌医用生理盐水重悬洗涤沉淀；
(3)将所有重悬液无菌分装于一次性的无菌、无致热源、无过敏源的超高速低温离心管，无菌级操作间4℃100000×g离心60min，完全移除上清，再以4℃含冻存保护剂成分的无抗生素无菌医用生理盐水重悬沉淀直至重悬液体澄清，调整蛋白浓度为0.5mg/ml，过滤获取干细胞因子微囊泡悬液；按质量浓度计，所述含冻存保护剂成分无抗生素无菌医用生理盐水中海藻糖终浓度为5％，甘氨酸终浓度为0.25％，L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁终浓度为0.5％。
9.一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉，其特征在于，所述冻干粉由权利要求1-8任一项所述人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液冻干制备而成。
10.根据权利要求9所述的一种人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡冻干粉，其特征在于，所述冻干粉是通过如下方法制备的：
(1)将权利要求1-8任一项所述的人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液分装于无菌、无热源、无过敏源、医用硼硅玻璃管制注射剂瓶中，半压塞，移入无菌百万级细胞间的冻干机上，1小时内降温至-40℃以下并维持1小时；
(2)无菌百万级细胞间内抽真空，压力8Pa；然后升温至-5℃，保温5小时，完成升华干燥过程；
(3)继续升温至28℃，保温2小时，完成解析干燥过程；
(4)冻干结束后，真空状态下无菌完成全压塞，成品取出冻干机，完成无菌外包装全轧盖，即制备得到人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡悬液冻干粉，4℃保存。
CN201910455752.XA 2019-05-29 2019-05-29 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法 Active CN110179826B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910455752.XA CN110179826B (zh) 2019-05-29 2019-05-29 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910455752.XA CN110179826B (zh) 2019-05-29 2019-05-29 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110179826A true CN110179826A (zh) 2019-08-30
CN110179826B CN110179826B (zh) 2021-08-31

Family

ID=67718393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910455752.XA Active CN110179826B (zh) 2019-05-29 2019-05-29 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110179826B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808804A (zh) * 2020-07-13 2020-10-23 沈阳三禾生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法
CN111888379A (zh) * 2020-08-17 2020-11-06 济宁医学院附属医院 干细胞来源的微囊泡在制备修复瘢痕的制剂中的应用
CN111893093A (zh) * 2020-08-03 2020-11-06 沈阳三禾生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法
CN112300984A (zh) * 2020-09-21 2021-02-02 四川大学华西医院 一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控
CN114081900A (zh) * 2021-02-24 2022-02-25 济宁医学院附属医院 间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101984048A (zh) * 2010-11-24 2011-03-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种培养间充质干细胞的培养基
CA2842296A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Ospedale Pediatrico Bambino Gesu' Microvesicles isolated from mesenchymal stem cells for use as immunosuppressive agents
CN101854941B (zh) * 2007-10-29 2013-03-27 弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司 衍生自干细胞的微泡(MVs)用于制备用于受损或损伤组织或器官的内皮/上皮再生的药物的用途、以及相关体外和体内方法
CN103243071A (zh) * 2013-05-09 2013-08-14 陈云燕 一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基
CN106109496A (zh) * 2016-07-06 2016-11-16 广东科玮生物技术股份有限公司 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法
CN106367386A (zh) * 2016-10-14 2017-02-01 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法
CN108251360A (zh) * 2017-12-25 2018-07-06 西安组织工程与再生医学研究所 一种人间充质干细胞无血清培养基及其配制方法
CN108309822A (zh) * 2018-02-26 2018-07-24 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法
CN109468272A (zh) * 2018-02-06 2019-03-15 西安东澳生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101854941B (zh) * 2007-10-29 2013-03-27 弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司 衍生自干细胞的微泡(MVs)用于制备用于受损或损伤组织或器官的内皮/上皮再生的药物的用途、以及相关体外和体内方法
CN101984048A (zh) * 2010-11-24 2011-03-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种培养间充质干细胞的培养基
CA2842296A1 (en) * 2011-07-28 2013-01-31 Ospedale Pediatrico Bambino Gesu' Microvesicles isolated from mesenchymal stem cells for use as immunosuppressive agents
CN103243071A (zh) * 2013-05-09 2013-08-14 陈云燕 一种临床级人间充质干细胞无血清完全培养基
CN106109496A (zh) * 2016-07-06 2016-11-16 广东科玮生物技术股份有限公司 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法
CN106367386A (zh) * 2016-10-14 2017-02-01 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法
CN108251360A (zh) * 2017-12-25 2018-07-06 西安组织工程与再生医学研究所 一种人间充质干细胞无血清培养基及其配制方法
CN109468272A (zh) * 2018-02-06 2019-03-15 西安东澳生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法及应用
CN108309822A (zh) * 2018-02-26 2018-07-24 福建省银丰干细胞工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘斌: "《细胞培养》", 31 January 2018 *
刘湄漪等: "间充质干细胞旁分泌作用的研究进展", 《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808804A (zh) * 2020-07-13 2020-10-23 沈阳三禾生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法
CN111893093A (zh) * 2020-08-03 2020-11-06 沈阳三禾生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法
CN111888379A (zh) * 2020-08-17 2020-11-06 济宁医学院附属医院 干细胞来源的微囊泡在制备修复瘢痕的制剂中的应用
CN112300984A (zh) * 2020-09-21 2021-02-02 四川大学华西医院 一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控
CN114081900A (zh) * 2021-02-24 2022-02-25 济宁医学院附属医院 间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110179826B (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110179826A (zh) 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
CN106754674B (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN103352026B (zh) 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法
CN110693909A (zh) 一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备
CN106434557B (zh) 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法
CN110564682B (zh) 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN107022521A (zh) 壁蜕膜组织冻存、复苏及分离培养间充质干细胞的方法
CN105238751A (zh) 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
CN104946585A (zh) 一种人间充质干细胞培养液上清的生产方法及冻干方法及应用
CN105820998A (zh) 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法
CN104312970A (zh) 一种细胞治疗用临床治疗级表皮干细胞应用人类细胞外基质筛选及规模化培养制备方法
CN108653327A (zh) 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法
CN108348555A (zh) 细胞扩增方法和治疗组合物
CN106038598A (zh) 人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法
CN104523753A (zh) 人脐带间充质干细胞培养上清活性因子及细胞裂解液的制备方法、产品与应用
CN106421920A (zh) 一种脂肪填充物及其制备方法
CN108315297A (zh) 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法
CN103898049A (zh) 一种活细胞精华液产品及其制备方法和应用
CN108642002A (zh) 一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法
CN110613737A (zh) 一种子宫内膜干细胞制剂的制备方法及其应用
CN102146359A (zh) 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法
WO2021098025A1 (zh) 一种体外激活脂肪干细胞转化成原软骨细胞的方法
CN107779430A (zh) 脐带间充质干细胞上清液的收集方法
CN105462913A (zh) 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法
CN104830762A (zh) 脂肪原始间充质干细胞的增殖培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant