CN101854941B - 衍生自干细胞的微泡(MVs)用于制备用于受损或损伤组织或器官的内皮/上皮再生的药物的用途、以及相关体外和体内方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及衍生自干细胞的微泡(MVs)用于制备用于受损组织或器官的内皮/上皮再生的药物，和/或用于抑制由细胞生长抑制剂诱导的凋亡的用途。微泡由其获得的干细胞优选选自内皮祖细胞(EPCs)、间充质干细胞(MSCs)、肾祖细胞CD133+、成人肝干细胞(HLSC)及其任何组合。微泡可以在体外和体内应用中使用，例如受损组织或器官的再生，以及肾损伤和肝损伤特别是急性肾衰竭(ARF)和急性肝衰竭(AHF)的治疗。

Description

衍生自干细胞的微泡(MVs)用于制备用于受损或损伤组织或器官的内皮/上皮再生的药物的用途、以及相关体外和体内方法
本发明一般包括在组织再生领域中，并且特别地它涉及内皮和上皮再生。
在复杂器官中，内皮和上皮区室之间的串扰(cross-talk)在分化、功能和修复中相关。在损伤后，形态修复和功能恢复依赖于内皮和上皮细胞二者的再生，进而恢复细胞间相互作用。
内皮细胞源于外胚层胚层，并且代表血液和血管壁之间的第一个界面。它们代表1％的整体体重，具有关于动脉约28m2的表面和在毛细管中具有280m2的表面。已知血管内皮具有广泛范围的生物活性，例如介质分泌、物理应激测知、血管调节(vasoregulation)、炎性细胞粘附和外渗的神经元-体液控制和调节。
上皮细胞源于内胚层胚层，并大量存在于大多数器官，其中它们获得特定功能。在肾中，上皮细胞已经分化成特定结构(具有再吸收和分泌原尿的特化功能的近和远端肾小管细胞以及具有调节选择渗透性的特化功能的肾小球上皮细胞)。在肝中，上皮细胞主要构成肝小叶的解剖功能单位。这种结构特化产生胆红素和胆汁盐，这尤其是特定新合成产物。在胰腺中，几种类型的上皮细胞特化分泌和处理不同激素(即用于胰岛素分泌的β细胞)。
上皮和内皮细胞是关于几种损伤机制的靶，所述损伤机制可以导致急性或慢性器官功能障碍。在器官水平上的修复过程依赖于内皮和上皮细胞在损伤位点处去分化、增殖且最后迁移以及最终再分化的能力，从而确保完全的形态和功能恢复。例如，在急性肾小管坏死后，这是缺血或中毒事件后的临床相关事件，修复事件需要增殖和最后分化成2种细胞类型的成熟细胞(1，2)。在肾小球疾病中，从损伤的恢复与肾小球结构的血管重塑基本上相关。更详细地，已显示在肾小球疾病的再生期过程中发生的新血管发生还影响足状突细胞的功能恢复，所述足状突细胞是调节肾小球选择渗透性的高度分化的上皮细胞(3)。在急性血管损伤的许多模型中，内皮细胞的再生对组织和切割功能恢复有帮助，这也与器官的上皮功能组分修复相关。骨髓衍生的间充质干细胞和内皮祖细胞(EPCs)通过粘附分子信号优先召募至血管缺血位点(4，5)。
迄今为止，治疗内皮/上皮损害或损伤的现有方法已基于下述的使用：1)作用于2种细胞类型中的两者或之一的生长因子；2)使用间充质干细胞或EPC的细胞治疗。然而，现有方法具有许多缺点。
生长因子的使用具有高生产成本和需要获得不同生长因子合适组合的生物效应的缺点。干细胞治疗的使用具有给出关于所施用细胞的控制丧失的固有危险，在它们已植入接受者中后，具有潜在的致瘤危险或不适当分化。例如，已在肾小球肾炎的实验模型中报告在损伤肾小球内的脂肪形成分化(6)。
本发明人目前已发现衍生自干细胞的微泡(MVs)代表超过现有方法用于治疗内皮/上皮损害或损伤的有利替代方法，因为它们的使用不具有上述缺点。此外，衍生自干细胞的微泡具有再生内皮和上皮组织损害或损伤的能力的事实是完全未预料到的。事实上，在现有技术(7)中已知衍生自内皮祖细胞(EPCs)的微泡能够促进来自内皮细胞的血管发生和毛细血管样结构形成。例如从WO2005121369还已知来自供体细胞的微泡或合成微泡能够用于修饰与微泡接触的细胞。一般地，修饰至少部分通过微泡的RNA实现，但它也可以通过微泡的脂质组分、微泡的膜相关肽或微泡的细胞溶质肽实现。
然而，从未公开或暗示衍生自许多类型干细胞包括EPCs的微泡促进内皮和上皮组织再生的组合能力。
由于其再生能力，在本发明中使用的干细胞衍生的MVs可以用于组织修复，特别是用于在组织损害或损伤后的内皮/上皮再生。在本发明内采用的MVs可以用于体外和体内应用。
关于体内应用，干细胞衍生的MVs已显示共享许多共同生物效应，这使得它们特别适合于在人应用中用作药物用于肾和肝修复，特别是用于治疗急性肾衰竭(ARF)和急性肝衰竭(AHF)。事实上，在本发明中采用的MVs已显示在从急性肾小管损伤的恢复，从急性肾小球肾炎的恢复，以及在促进肾小球毛细血管再生和肝细胞增殖中有效，从而在ARF和AHF治疗中具有极大利益。
肾在急性损伤发作后恢复的能力对在医院背景下的患者发病率和死亡率具有关键影响(8，9)。当例如在脓毒症中暴露于内源细胞因子，暴露于内源或外源毒素例如肌红蛋白或氨基糖苷和放射造影剂、或肾缺血发作时，肾小管细胞对损伤特别敏感(10)。从急性肾损伤恢复依赖于肾小管再生且再次获得正常功能的能力(2)。患者年龄和损伤严重度可能制约恢复。在肾损伤的严重或反复发作后，恢复可以受损或甚至失败，导致关于长期透析的需求和患者死亡率的增加(11)。肾小管上皮细胞的坏死和丧失是急性肾衰竭(ARF)中的最常见事件，并且在急性肾衰竭后肾功能的恢复依赖于坏死肾小管细胞由功能肾小管上皮的替换(2)。上皮和内皮再生的缺乏或减少可能诱发管-间质瘢痕形成和慢性肾疾病。关于对于肾损伤的生理学应答的研究表明在创伤已发生后，肾小管细胞去分化并且获得间充质表型。去分化细胞随后迁移到其中肾小管细胞经历坏死、凋亡或脱离伴随肾小管基底膜剥落的区域。这个过程随后为细胞增殖并且最终为其后续分化成具有组织完整性恢复的功能上皮细胞(2)。还已暗示肾的间质包含能够促成肾修复的成人肾干细胞(12)。肾小球损伤通常随后为发展为硬化病变，因为肾小球细胞具有就肾小管而言的有限再生。毛细血管丧失是发展为晚期肾衰竭的几种不同肾小球疾病中的常见事件(13)。
因此，本发明的一个方面是干细胞衍生的微泡用于制备用于内皮/上皮再生的药物的用途。
在一个优选实施方案中，药物针对肾损伤例如急性肾衰竭(ARE)的治疗。
在另一个优选实施方案中，药物针对肝损伤例如急性肝衰竭(AHF)的治疗。
考虑到干细胞衍生的微泡(MV)抑制凋亡且促进细胞增殖的能力，这些MVs也特别适合于用于抑制由细胞生长抑制剂诱导的凋亡，从而减少癌症化学治疗的副作用。
因此，本发明的另一个方面是干细胞衍生的微泡用于制备用于抑制由细胞生长抑制剂诱导的凋亡的药物的用途。
细胞生长抑制剂是例如紫杉醇、来那度胺(Lenalidomide)、Pomalidomide、表柔比星、5FU、舒尼替尼(Sunitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、卡纽替尼(Canertinib)、环磷酰胺、羟基红比霉素、来那度胺/地塞米松、Pomalidomide/地塞米松、卡铂、米托蒽醌(mitoxantron)、奥沙利铂、多西他赛、长春烯碱(vinorelbin)。
本发明的药物适当地通过静脉内输注进行施用，并且它可以以适合于施用包括在约30至120μg/kg接受者体重之间的微泡量的剂型制备。接受者是能够实现内皮/上皮再生需要治疗的任何患者，例如受ARF或AHF影响的人。
如本文所使用的，表达“衍生自干细胞的微泡(MV)”指至少部分衍生自干细胞的膜颗粒。依次，术语“干细胞”包括任何未分化或部分未分化的细胞，其能够增殖(自我更新)和分化(可塑)，从而替换已达到其生命周期终点的特化细胞谱系的成熟细胞。如在本说明书中使用的，术语“干细胞”包括具有无限自我更新能力和多能可塑性的干细胞，以及具有多潜能或单向可塑性和在某些情况下有限自我更新能力的祖细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，在本发明中使用的干细胞衍生的MVs衍生自选自内皮祖细胞(EPCs)、间充质干细胞(MSCs)、肾祖细胞CD133+、成人肝干细胞(HLSC)的干细胞。
在本发明中使用的衍生自干细胞的微泡一般是球形形状的，并且具有在100nm至5μm、更一般地0.2至1μm范围内的直径。如果颗粒形状不是球形的，那么上述值指颗粒的最大尺度。
本发明中使用的微泡得自其的干细胞可以如在说明书的实验部分中所述的进行分离。微泡(MVs)随后可以如在说明书的实验部分中公开的通过超速离心得自经分离的干细胞的上清液。
经分离的MVs随后可以通过在极低温度一般在-80℃下，在具有一种或更多种冷冻保护剂的悬浮液中冷冻贮存直至使用。合适的冷冻保护物质是例如二甲亚砜(DMSO)和甘油。DMSO以1％细胞悬浮液体积浓度的使用确保细胞的良好保存和对再输注患者的有限毒性效应。可以引用的其他物质是细胞外冷冻保护剂，即在细胞表面上作用的高分子量物质，形成减少细胞内脱水的紧密屏障。可以引用羟乙基淀粉作为例子。经分离的MVs随后可以用于制备药物。
本发明人在体外和体内对经分离的干细胞衍生的MVs进行测试。在体内执行的实验包括鼠类中毒ARF模型和通过静脉内注射抗Thy-1抗体诱导的大鼠肾小球肾炎的实验模型。
下述实验部分提供仅用于举例说明。
材料与方法
细胞制备
内皮祖细胞(EPCs)、间充质干细胞(MSCs)和CD133肾祖细胞的分 离和表征
EPC通过密度离心从来自健康供体的外周血单核细胞分离，并且在纤连蛋白包被(coated)的培养瓶上在内皮细胞基本培养基-2(Clonetics，Biowhittaker，Walkersville，MD)中铺平板，所述培养基补充有5％FBS、VEGF、FGF-2、EGF和胰岛素样生长因子-1。如先前所述，通过FACS、蛋白质印迹、基因微阵列分析和在Matrigel包被平板上的血管生成性质的功能评估来研究内皮特性(5)。如先前所述分离且培养人间充质干细胞(hMSCs)(4)。如先前所述获得来自8周大小鼠股骨和胫骨的鼠类MSCs(mMSCs)(14)。细胞以20-40x106细胞/9.5cm2的密度在α-MEM(Invitrogen，Paisley，Scotland)中铺平板，所述α-MEM补充有10％FCS、10％马血清(两者都来自Euroclone，Wetherby，UK)、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100IU/mL青霉素(全部来自Sigma，St Louis，MO，USA)。在72小时后去除非贴壁细胞群体，并且用新鲜培养基将贴壁层洗涤1次。细胞具有典型的纺锤形外观，并且通过间充质干细胞标记的表达和分化成骨细胞和脂肪细胞的能力证实MSC表型，如所述的(14)。肾祖细胞得自从手术摘除肾获得的皮质正常部分。在解剖和经由分级系列的网孔后，使用MACS系统(MiltenyiBiotec，Auburn，California)，通过磁性细胞分选从肾小管部分中分离CD133+细胞。在60％DMEM LG(Invitrogen、Paisly、United Kingdom)、40％MCDB-201，伴随1x胰岛素-转铁蛋白-硒、1x亚油酸2-磷酸盐、10-9M地塞米松、10-4抗坏血酸2-磷酸盐、100U青霉素、1,000U链霉素、10ng/ml EGF和10ng/ml PDGF-BB(全部来自Sigma-Aldrich，St.Louis，Missoury)以及2％FCS(EuroClone，Wetherby，United Kingdom)的存在下，CD133+细胞在纤连蛋白上铺平板(12)。所选择的细胞缺乏造血标记的表达，并且表达PAX-2——胚胎肾标记，暗示其肾起源。肾组织衍生的CD133+细胞和个别细胞的克隆能够在体外扩增以及有限自我更新和分化成上皮或内皮细胞。在FGF-4(10ng/ml)和HGF(20ng/ml)(Sigma)的存在下获得体外上皮分化。在Endothelial Cell AttachmentFactor(Sigma)上在具有VEGF(10ng/ml)(Sigma)和10％FCS的EBM培养基(Cambrex Bio Science，Baltimore，Maryland)中培养细胞获得内皮分化(12)。在SCID小鼠中的皮下植入后，未分化细胞形成表达肾上皮标记的肾小管结构。
MVs从干细胞中的分离和表征
MVs得自在剥夺FCS的培养基中培养的不同祖细胞培养物的上清液(7)。在2,000g下离心20分钟去除碎片后，将无细胞上清液在100,000g(Beckman Coulter Optima L-90K超离心机)下在4℃下离心1小时，在无血清培养基中洗涤，并且提交在相同条件下的二次超速离心。根据制造商的说明书(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)通过鲎(Limulus)试验排除内毒素污染。所获得的MVs如下进行分析：
FACS分析：MVs的大小通过FACS(Becton Dickinson)进行测定。不同大小(1、2、3、4、6、10和15μm，Molecular Probes，Invitrogen)的珠用作大小标记，并且使用用于FSC和SSC参数的对数尺度执行分析。
扫描和透射电子显微镜检查：MVs在Karnowski固定剂中加以固定，在乙醇中脱水，在玻璃表面上干燥，并且通过喷射包被用金进行包被。样品在扫描Jeol T300电子显微镜中进行检查。经由次级电子在15-25mm的工作距离和20-25kV的加速电压下获得图像。根据标准操作对Karnovsky’s固定、四氧化锇后固定和在环氧树脂中包埋的组织执行透射电子显微镜检查。超薄切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行染色，并且用JEM 1010电子显微镜进行检查。
基因阵列分析：用于研究凋亡的人GEarray试剂盒(GEArray Q seriesHuman Apoptosis，SuperArray Inc.，Bethesda，MD)用于表征在用MVs处理的肾小管细胞中的基因表达。从不同实验汇集的RNA用作模板用于生物素化探针合成。使用碱性磷酸酶底物CDP-Star通过化学发光信号检测基因表达，并且根据制造商的指导直接获得。使用Quantity one程序(Life Science)执行密度计分析，并且用GEArray分析仪程序分析来分析原始数据。
体内模型
鼠类中毒ARF模型
通过肌内注射7.5ml/kg体重的50％甘油溶液(Sigma，St.Louis，MO)在C57B1/6小鼠中诱导急性中毒肾小管损伤，如先前所述(14)。通过测定血清肌酸酐和尿素水平(Beckman Instruments Inc.，Fullerton，CA)来评估肾功能。肾小管损伤的峰值在甘油注射后3天发生(14)。在距离ARF诱导3、6、10和15天后处死小鼠，以便评估最大损伤和肾小管再生时期。肾进行福尔马林固定和石蜡包埋用于组织学和免疫组织化学分析。
Thy-1肾小球肾炎的实验模型
通过在第0天时将250μg/100g重量的抗Thy1-1抗体(Ab)静脉内施用到6周大雌性Lewis大鼠的股静脉内诱导肾小球肾炎(GN)。对照动物接受相同体积的盐水注射代替抗Thy1.1 Ab。在第2天时，当已可检测出蛋白尿时，将30μg EPC衍生的MVs注射到对侧股静脉中。对照动物接受相同量的仅媒介物(经修饰的M199培养基Hepes加上1％DMSO)的注射。每天评估蛋白尿、血清和尿肌酸酐/尿素(24小时尿液采集)。小鼠在下述天数D4、D7、D14时处死。每个实验组包括9只大鼠。
体外实验
人肾小管细胞分离和培养
人TEC(PTEC)的原代培养物得自通过手术操作从受肾癌影响的患者中摘除的肾(15)。通过用杂交Adeno5/SV40病毒感染产生的PTEC永生化细胞系用于证实且扩展用原代肾小管细胞执行的实验。细胞用包含10％FCS(Hyclone，Logan，Utah)和2mM谷氨酰胺(GIBCO)的RPMI 1640(GIBCO，Grand Island，NY)生长。
细胞增殖测定
细胞以8000细胞/孔种植到96孔板内在包含10％FCS的DMEM培养基中，并且使得贴壁。使用ELISA试剂盒(Roche Applied Science)，作为掺入细胞DNA内的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)检测DNA合成。简言之，将10μM BrdU加入细胞，在含或不含10％FCS的DMEM中温育18小时。细胞随后用0.5M乙醇/HCl固定，并且与核酸酶一起温育以消化DNA。使用抗BrdU过氧化物酶缀合的mAb检测掺入DNA内的BrdU，并且用可溶性生色底物显现。光密度用ELISA阅读器在405nm下进行测量。
凋亡测定
使用TUNEL测定分析(ApopTag Oncor，Gaithersburg，MD)评估凋亡。在不同促凋亡刺激后，使细胞悬浮于PBS中，在溶于PBS pH 7.4中的1％低聚甲醛中于4℃固定15分钟，在PBS中洗涤2次，随后在预冷却的乙醇-乙酸2∶1中于-20℃后固定5分钟。样品用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)进行处理。细胞随后用具有荧光素的加温抗地高辛配基缀合物进行处理，并且在室温下温育30分钟。在包含1μg/ml碘化丙啶的培养基中固定样品，并且通过免疫荧光分析细胞。结果表示为与红色荧光发出细胞(总细胞)比较的绿色荧光发出细胞(凋亡细胞)百分比。
半胱天冬酶3-8-9活性的检测
基于在从由半胱天冬酶识别的标记底物DEVD-pNA切割后生色团对硝基苯胺盐(pNA)的分光光度计测量检测，通过ELISA(Chemicon，Temecula，CA)评估半胱天冬酶3-8-9的活性。用合适反应缓冲液稀释肾小管裂解物，并且以50M的终浓度加入DEVD-pNA。样品随后在自动化ELISA阅读器中在405nm波长下进行分析。每次实验一式三份地执行。
FACS分析
对于FACS分析，用EDTA使细胞从组织培养板脱离，用1x PBS洗涤2次，并且在4℃下用针对不同分子的一抗或无关对照抗体染色1小时。细胞与Alexa Fluor缀合的二抗于4℃温育45分钟。细胞在1％低聚甲醛中固定，并且实施FACS分析(Becton Dickinson，Mountain View，CA)。
蛋白质印迹分析
对于蛋白质印迹分析，用EDTA使细胞脱离，并且用包含1％Triton-X-100、10μM/ml亮抑酶肽、10μM苯甲基磺酰氯(PMSF)和100U/ml抑肽酶的50mM Tris-HCl裂解缓冲液进行裂解。在肾小管裂解物在15000xg下离心后，通过Bradford法测量上清液的蛋白质含量：对30μg蛋白质/泳道实施十二烷基硫酸钠(SDS)-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，并且电印迹到硝酸纤维素膜滤纸(filter)上。印迹随后用5％脱脂乳在20mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl加上0.1％Tween中封闭。膜在4℃下与以500ng/ml浓度针对Akt、P-Akt、Bcl-xL(全部来自Santa Cruz Biotechnology)或Pax-2的抗体温育过夜。在用0.1％Tween充分洗涤后，印迹用HRP缀合的蛋白质A(200ng/ml，Amersham，Buckingamshire，UK)RT染色1小时，再次用0.1％Tween洗涤，用ECL检测试剂(Amersham)显色，并且暴光于X-Omat胶片(Eastman Kodak，Rochester，NY)。
经上皮电阻(TER)的评估
经上皮电阻(TER)用作上皮极性指示。细胞在胶原包被的聚碳酸酯膜(Corning Costar Corp.，Cambridge，MA)上在transwells中铺平板，并且允许在加入不同刺激前达到汇合。上皮伏特-欧姆仪(EVOM；WorldPrecision Instruments，Inc.，Sarasota，FL)用于测定TER值，如先前所述(12)。所有测量一式三份地执行，并且对于膜面积进行标准化。
FITC缀合的白蛋白摄取的检测
在肾小管细胞与50mg/ml FITC缀合的人白蛋白在37℃下温育2小时后研究蛋白质摄取。在FITC-白蛋白攻击后，细胞用冰冷的PBS充分洗涤3次，并且通过FACS进行分析。
迁移和形态发生测定
迁移作为肾小管细胞在其下迁移到在汇合单层中产生的伤口内的速度进行评估，以便模拟物理应激条件。在Nikon倒置显微镜下在密封封闭温箱中在37℃下观察细胞运动性。使用Micro-Image分析系统(CastiImaging srl，Venezia，Italy)，在以30分钟间隔数字保存不同图像后分析迁移。通过标记超过30个细胞的核位置/视野评估细胞迁移。速度平均值计算为在观察起点和终点之间的直线距离除以观察时间的比。在所选择的实验中和对于形态发生测定，将分散的肾小管细胞种植到先前用20μg/ml纤连蛋白、IV型胶原或Matrigel包被的板上。
PTEC在SCID小鼠中的皮下Matrigel植入
执行PTEC在Matrigel塞中的皮下植入，以评估干细胞衍生的MVs在体内的肾小管产生(tubulogenic)效应。简言之，除去生长因子的Matrigel(Becton Dickinson)维持在-20℃下直至使用，并且仅在植入前即刻在4℃下过夜解冻。使5000细胞重悬浮于不含FCS的250μl新鲜培养基中，并且在不同刺激的存在下，使用冷却吸管端固定至在冰上的500μl Matrigel。将所有样品s.c.植入SCID小鼠的后肢内。1周后，处死小鼠，并且回收Matrigel塞用于检查。
内皮-肾小管夹心共培养
为了检查与不同刺激温育的HMEC对肾小管活力的作用，应用共培养模型。HMEC在24孔板上在标准培养条件下铺平板24小时。随后在10μg/ml EPC衍生MVs的存在或不存在下，对HMEC实施血清剥夺24或48小时。在上述条件下温育后，抽取培养基，通过1x PBS充分洗涤贴壁细胞，并且用RPMI 1∶1稀释的200ul生长因子减少Matrigel；(BD)用作覆盖，并且允许在37℃下30分钟胶化。其后，向每个孔中加入1x104肾小管细胞，以完成夹心共培养。共培养在血清剥夺的条件下温育另外24至48小时。在温育结束时，对肾小管细胞实施基于XTT的测定(Sigma)数据作为3次不同实验的平均值±SD给出。
免疫荧光和免疫细胞化学
使用下述抗体执行细胞荧光分析，抗体全部是FITC或PE缀合的：抗CD133-1单克隆Ab(mAb)(Miltenyi Biotec)、抗CD44和抗人HLAI类mAbs(Sigma)、抗CD31和抗CD105mAbs(Serotec Inc，Oxford，United Kingdom)、抗KDR mAb(R&D System、Minneapolis，Minnesota)；抗Muc-18mAb(Chemicon International，Temecula，California)、抗CD29、抗-CD33、抗-CD34、抗-CD45、抗-CD73、抗-CD90、抗-CD 117mAbs(Becton Dickinson，San Jose，California)。抗VE钙粘蛋白mAb由Guido Tarone(University of Torino)友情提供。FITC或PE小鼠未免疫同种型IgG(Dako，Copenhagen，Denmark)用作对照。对在腔室玻片上培养的细胞执行间接免疫荧光，在包含2％蔗糖的4％低聚甲醛中固定，并且需要时用Hepes-Triton-X 100Buffer进行渗透化处理。还对在液氮中速冻的人或小鼠组织执行免疫荧光，以3-μm切片切割，并且在包含2％蔗糖的3.5％低聚甲醛中固定。使用下述抗体：抗Na-Cl共转运蛋白、抗氨肽酶A和抗碱性磷酸酶多克隆山羊Abs(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，California)、兔抗紧密连接蛋白(ZO)-1多克隆Ab(Santa Cruz Biotechnology)、山羊抗VWF和兔抗Pan-Cytokeratin Abs(Sigma)、抗波形蛋白和抗E钙粘蛋白mAbs(Dako)、抗EMA mAb(Chemicon International)、多克隆兔抗PAX2Ab(Covance，Princeton，New Jersey)PE-缀合的抗CD133(Miltenyi Biotec)和抗增殖细胞核抗原(PCNA)、FITC缀合的抗HLA I和抗钙粘蛋白D-28K mAbs(Sigma)。对照小鼠、兔或山羊未免疫免疫球蛋白用作对照。需要时，FITC缀合的抗小鼠、兔或山羊IgG(Sigma)用作二抗。如所述的(7)对在10％缓冲福尔马林中固定且在石蜡中包埋的组织执行免疫细胞化学。使用Leika TCS SP2型号共焦显微镜(Heidelberg，Germany)执行共焦显微镜检查。加入Hoechst 33258染料(Sigma)用于核染色。
统计分析
不同实验操作的所有数据表示为平均值±SD。适当时，通过ANOVA用纽科二氏(Newmann-Keuls)多重比较检验执行统计分析。
结果
MVs的特征
用1、2、4和6μm珠作为关于衍生自人EPC、MSC和CD133肾祖细胞MVs的大小内部标准的FACS分析用于测定其大小，并且证实衍生自不同干细胞/祖细胞群体的MVs具有相似大小。观察到的大多数MVs低于与1μm珠对应的FSC信号(图1A)。扫描和透射电子显微镜检查显示MVs的球形形态，并且证实其大小在0.2-1μm之间(图1B)。经由次级电子在15-25mm的工作距离和20-30kV的加速电压下获得图像。通过FACS分析，MVs显示已知由相应干细胞/祖细胞质膜表达的粘附分子的表达(图1C)。EPC、MSC衍生的MVs和驻留肾CD133+祖细胞共享CD44、CD29的表达，但对于ICAM-1、α4整联蛋白和α5整联蛋白的表达不同。这些结果指出MVs在其表面上表达它们源于其的细胞质膜的几个决定簇。先前已显示粘附分子的表达在MVs掺入靶细胞中是有帮助的。
MVs对肾细胞的体外生物效应
肾小管损伤是缺血或中毒起源的急性肾衰竭(ARF)的标志。此外，已显示小管周毛细血管的内皮细胞损害促成在缺血后的肾损害延伸(16)。因此我们研究从干细胞中释放的MVs对近端肾小管上皮细胞系(PTEC)的作用。
衍生自鼠类间充质干细胞(mMSCs)的MVs抑制由顺铂诱导的PTEC凋 亡
发现就与仅媒介物一起温育的对照而言，PTEC与增加剂量的衍生自鼠类间充质干细胞(mMSCs)的MVs一起温育显著减少由顺铂诱导的凋亡。MVs与RNA酶一起温育取消(abrogate)对凋亡的抗性。所获得的结果显示于图2中。通过TUNEL测定作为与0.5μg/ml顺铂24小时温育后的凋亡细胞百分比(黑色柱)评估凋亡。PTEC与仅媒介物或各种剂量的MVs一起温育。阴影柱显示未用顺铂处理的对照。结果表示为3次实验的平均值±1SD。执行用Dunnet’s多重比较检验的方差分析：*MVs与仅媒介物比较p＜0.05。
通过用MVs处理的PTECs的PCNA(增殖细胞核抗原)表达指示细胞 增殖的诱导
衍生自mMSC的MVs诱导经由PTECs的PCNA表达。5x104细胞/孔肾小管细胞在DMEM+5％BSA中与10μg/ml MVs或仅媒介物一起温育24小时，并且通过共焦显微镜检查评估PCNA的表达。所获得的结果显示关于在无血清培养基中培养的PTEC中PCNA核染色的不存在，和在与衍生自mMSC的MVs温育后通过PTEC的PCNA核表达。执行3次实验，结果相似。
衍生自人成人肾祖细胞CD133+的MVs能够抑制由顺铂诱导的PTECs 凋亡并且支持肾小管上皮细胞增殖
就与仅媒介物一起温育的对照而言，PTEC与衍生自成人肾祖细胞CD133+的不同剂量(1、5和10μg/ml)MVs一起温育显著抑制由顺铂诱导的凋亡(图3)。通过TUNEL测定作为与0.5μg/ml顺铂24小时温育后的凋亡细胞百分比(黑色柱)评估凋亡。PTEC与仅媒介物或各种剂量的MVs一起温育。阴影柱显示未用顺铂处理的对照。结果表示为3次实验的平均值±1SD。执行用Dunnet’s多重比较检验的方差分析：*MVs与仅媒介物比较p＜0.05。
衍生自人肾祖细胞CD133 + 的MVs能够诱导PTECs的细胞增殖
就对照而言，PTEC与衍生自人肾祖细胞CD133+的2个不同剂量MVs(15和30μg/ml)一起温育48小时显著促进肾小管上皮细胞的细胞增殖。8000细胞/孔与10μM BrdU一起加入96孔板内，在DMEM中与仅媒介物或不同剂量的MVs一起温育。细胞随后用0.5M乙醇/HCl固定，并且与核酸酶一起温育以消化DNA。使用抗BrdU过氧化物酶缀合的mAb检测掺入DNA内的BrdU，并且用可溶性生色底物显现。光密度用ELISA阅读器在405nm下进行测量。结果表示为3次实验的平均值±1SD。结果在图4中举例说明。
与MVs一起温育在48小时温育后诱导经由PTEC的PAX2和波形蛋白 表达，指出获得未成熟表型的PTEC去分化
衍生自人肾祖细胞CD133的MVs诱导PTECs的去分化。5x104细胞/孔PTECs在DMEM+5％BSA中与衍生自人肾祖细胞CD133的10μg/ml MVs或仅媒介物一起温育24小时，并且通过共焦显微镜检查评估PAX2和波形蛋白的表达。
用衍生自MSC或HLSC的MVs处理的人肝细胞的细胞增殖和凋亡测定
衍生自间充质干细胞(MSC)或成人肝干细胞(HLSC)的MVs能够支持人肝细胞的增殖；
就与仅媒介物一起温育的对照而言，肝细胞与衍生自MSC或HLSC的不同剂量(10、25和50μg/ml)MV一起温育72小时促进细胞增殖。如图5中所示，5000细胞/孔与10μM BrdU一起加入96孔板内，在DMEM中与仅媒介物或不同剂量的MV一起温育。细胞随后用0.5M乙醇/HCl固定，并且与核酸酶一起温育以消化DNA。使用抗BrdU过氧化物酶缀合的mAb检测掺入DNA内的BrdU，并且用可溶性生色底物显现。光密度用ELISA阅读器在405nm下进行测量。结果表示为3次实验的平均值±1SD。执行用Dunnet’s多重比较检验的方差分析：*MVs与仅媒介物比较p＜0.05。结果明确显示来自MSC和HLSC的MVs能够刺激成熟人肝细胞的体外增殖，暗示对肝再生的潜在作用。
用衍生自HLSC的MVs处理的人肾小管细胞的凋亡测定
如先前所述使用TUNEL测定分析来评估人肾小管上皮细胞的凋亡。简言之，对细胞实施末端脱氧核苷酰转移酶[TdT]介导的切口末端标记(TUNEL)测定分析，使用顺铂(2μg/ml)作为用于诱导凋亡的阳性对照。细胞在PBS中洗涤，在溶于PBS，pH 7.4中的1％低聚甲醛中固定，与TdT酶和地高辛配基-dNTP一起温育，在PBS中洗涤，并且用溶于PBS中的抗地高辛配基-FITC抗体和用碘化丙啶(1μg/ml)复染。通过倒置UV显微镜检查显现在凋亡细胞中的FITC标记DNA片段。通过使用摄像机获得的图像的数字分析计数细胞，阳性凋亡细胞表示为在10X倒置显微镜视野中计数的总细胞百分比。在这个测定中使用的MVs浓度是10、15、30μg/ml，持续48小时。
图6显示在10、15、30μg/ml下用来自HLSC的MVs刺激的人肾小管上皮细胞的凋亡百分比。衍生自HLSCs的MVs以剂量依赖性方式刺激人肾小管上皮细胞的增殖，这是原代细胞培养物，限制于极少代。刺激增殖的MVs浓度是：10、15、30μg/ml。在由顺铂诱导的凋亡的情况下，衍生自HLSCs的MVs在刺激增殖的相同浓度下抑制人肾小管上皮细胞的凋亡。
EPC衍生的MV对PTEC发挥增殖和抗凋亡作用
PTEC与增加剂量的MVs(1-5μg/ml)一起温育。MVs在温育12小时后诱导增殖效应，在24-48小时后在PTEC中具有进一步增加(图7)。MV诱导的增殖在1μg/ml的剂量下显著增加，并且在50μg/ml的剂量下到达峰值(图7)。图7显示由MVs对PTEC诱导的增殖作用。数据来自基于XTT分析的PTEC时间过程增殖测定。MVs在考虑的所有时间点(12、24、48小时)下诱导显著剂量依赖性的增殖增加。数据表示为3次不同实验的平均值±SD。执行具有纽科二氏多重比较检验的ANOVA。
我们研究MVs对在不同有害条件下培养的PTEC的抗凋亡作用。如由TUNEL测定显示的(图8)，MVs显著减少在血清剥夺条件下、与5μg/ml顺铂、1μg/ml FK506或炎性细胞因子(20ng/ml TNF-α和20ng/ml IFN-γ)培养的PTEC凋亡。图8举例说明执行的TUNEL测定结果，显示10μg/ml MVs对暴露于血清剥夺(媒介物/FCS-)、顺铂(CIS5μg/ml)、FK 506(1μg/ml)或炎性细胞因子(septic：20ng/ml TNF-α和20ng/ml IFN-γ)的PTEC的抗凋亡作用。数据表示为3次不同实验的平均值±SD。执行具有纽科二氏多重比较检验的ANOVA。
基因阵列分析证实MVs调节编码线粒体和死亡受体凋亡途径分子的基因表达。特别地，MVs诱导抗凋亡Bcl-xL、Bcl-2和FLIP的上调，以及几种促凋亡基因例如Fas、Fas-配体(Fas-L)、Bax、TNF和TRAIL的下调。此外，在肾小管上皮细胞中在炎症损伤过程中超表达的CD40基因是下调的，暗示MVs对PTEC的抗炎作用。CD40的下调通过FACS分析加以证实。图9显示在10μg/ml MVs的存在或不存在下，用顺铂(5μg/ml)刺激的PTECs的基因阵列分析结果。基因表达变化百分比涉及PTEC凋亡。结果作为就仅顺铂而言，在暴露于顺铂+MVs的PTEC中的基因表达密度计分析之间的比给出。看家基因(β-肌动蛋白，GAPDH)用作关于密度计分析的参考。执行3次实验，结果相似。
与10ng/ml MVs一起温育诱导在顺铂处理的iTEC中半胱天冬酶3-8和9活性的显著减少。这些结果指出线粒体和受体介导的凋亡途径的伴随抑制。图10显示ELISA测定结果，显示在顺铂处理24小时的PTEC上由10μg/ml MVs诱导的半胱天冬酶3-8和9活性中的显著减少。数据表示为3次不同实验的平均值±SD。执行具有纽科二氏多重比较检验的ANOVA。
在共培养模型中评估内皮产生因子对PTEC存活的旁分泌作用，所述共培养模型特征在于通过Matrigel与PTEC上层分开的内皮细胞层。在10μg/ml MVs的存在或不存在下，通过血清剥夺24或48小时诱导内皮损伤，随后为在其上种植PTEC的生长因子减少Matrigel的分层。在不存在MVs的情况下，在24和48小时后PTEC活力显著减少。相比之下，用MVs的内皮刺激阻止活力减少。这些结果暗示MVs刺激促进PTEC存活的内皮细胞的旁分泌作用。所获得的结果在图11中举例说明，涉及在内皮-PTEC共培养模型中的PTEC活力评估。在10μg/ml MVs的存在或不存在下，通过血清剥夺24或48小时诱导内皮损伤，随后为在其上种植PTEC的生长因子减少Matrigel的分层。数据表示为3次不同实验的平均值±SD。执行具有纽科二氏多重比较检验的ANOVA。
我们研究MVs对在10μg/ml MVs的存在下不含FCS培养24小时的人PTEC中的间充质标记波形蛋白和Pax-2——胚胎肾中存在的蛋白质表达的作用。MVs诱导PTEC中的波形蛋白和Pax-2表达。5x104细胞/孔PTEC在DMEM+5％BSA中与衍生自EPC的10μg/ml MVs一起温育24小时，并且通过共焦显微镜检查评估PAX2和波形蛋白的表达。
MV诱导PTEC迁移
我们评估在纤连蛋白、IV型胶原或Matrigel包被板上种植的分散PTEC的活动性，模拟其中PTEC应迁移以重新建立的肾小管完整性的微观环境。我们通过对分散PTEC的时滞显微镜检查研究MVs对细胞迁移的作用。发现与PTEC的自发运动性对应的基线迁移速率对于整个观察期(12小时)维持稳定，从不超过3-4μm/小时。MVs诱导自发性迁移的显著增加，这在早至2小时时达到峰值，并且在所有观察期自始至终对所有细胞外基质保持显著较高。图12显示MVs对在细胞外基质上培养的PTEC迁移的作用。与10μg/ml MSP一起温育显著增加在板上培养的PTEC迁移，所述板先前用20μg/ml人纤连蛋白、IV型胶原或进行包被。数据作为3次不同实验的速度平均值(μm/小时)±SD给出。
MVs维持在顺铂处理PTEC的上皮单层中的功能完整性
给顺铂处理PTEC添加MVs重新建立细胞极性，如通过经上皮抵抗力分析评估的。图13显示MVs对顺铂诱导的经上皮电阻(TER)改变的作用。在不同实验条件下PTEC TER——细胞极性标记的分析：顺铂(CIS 5μg/ml)显著减少TER值，(CIS与媒介物比较*p＜0.05)，而MVs(10或50μg/ml)恢复正常TER值。数据作为3次不同实验的平均TER值±SD给出。TER值对于在实验操作中使用的膜面积进行标准化。执行具有纽科二氏多重比较检验的ANOVA。
此外，在MVs的存在下，顺铂处理的PTEC保存完全分化小管的一般分子例如碱性磷酸酶和氨肽酶A的表达，并且重新建立内皮受体megalin的存在，可能负责维持这些细胞内在化FITC标记白蛋白的能力的现象。通过免疫荧光研究由MV处理的PTEC的内吞受体megalin的表达，通过比较在5μg/ml顺铂或5μg/ml顺铂+10μg/ml MVs的存在下的megalin表达。放大率x100。核用0.5mg/ml Hoechst进行复染。执行3次实验，结果相似。
图14显示MVs对FITC-白蛋白通过PTECs内在化的作用。在PTEC单层与50mg/ml FITC缀合的人白蛋白在37℃下温育2小时后研究蛋白质摄取。在FITC-白蛋白攻击后，PTEC用冰冷的PBS充分洗涤3次，并且通过FACS进行分析。黑色曲线显示就对照(空心曲线)而言的白蛋白内在化。A显示经由5μg/ml顺铂处理PTEC的FITC-白蛋白摄取；B显示经由用10μg/ml MVs刺激的5μg/ml顺铂处理PTEC的FITC-白蛋白摄取。执行Kolomogorov Smirnov统计分析。执行3次实验，具有相似结果。
MVs诱导在Matrigel包被板上培养的PTEC的分支形态发生和在体内的 肾小管发生
在Matrigel包被板上不含FCS培养24小时的PTECs形成囊样(Cyst-like)结构。10μg/ml MVs的添加导致PTECs的分支形态发生。将PTECs皮下注射到SCID小鼠中的Matrigel塞内。这些细胞自发形成低数目的肾小管样结构，其在10μg/ml MVs的存在下显著增加。相比之下，顺铂完全抑制分支形态发生，触发由MV刺激恢复的凋亡。在10μg/ml MVs的存在或不存在下，评估在Matrigel包被板上培养的PTECs形态发生。在24小时后，未受刺激的PTECs形成囊样结构，而MVs诱导分散和分支形态发生。还评估皮下注射到SCID小鼠中的Matrigel塞内的PTEC的体内肾小管发生。未受刺激的细胞仅形成少数肾小管样结构，其在10μg/ml的存在下显著增加。
MVs在体内的肾小管发生作用是剂量依赖性的。图15显示MV诱导的体内肾小管发生的定量。在用不同剂量MVs处理且皮下注射到小鼠中的PTEC的10个非连续Matrigel切片(x100放大率)中执行肾小管样结构的计数。7天后处死小鼠，并且通过荧光显微镜检查观察Matrigel塞。数据表达为在3次不同实验中计数的肾小管样结构平均数目/视野(放大率x100)。巨噬细胞刺激蛋白质(MSP 10ng/ml)——关于PTEC的营养因子用作阳性对照。
淋巴细胞与PTEC单层的减少粘附
细胞因子处理的PTEC增强淋巴细胞粘附，模拟在ARF过程中在体内发生的炎症反应。给用细胞因子刺激的PTEC添加MVs显著抑制与PTEC的淋巴细胞粘附，暗示MVs的抗炎作用。
图16：在10μg/ml MVs的存在或不存在下，PTEC单层与仅媒介物或炎性细胞因子(20ng/ml TNF-α和20ng/mlIFN-γ)一起温育6小时。在PTEC单层的充分洗涤后，加入1x104PKH2标记的人淋巴细胞，并且在轻轻搅拌的条件下在37℃下温育1小时。通过经由PBS的3次洗涤去除非贴壁细胞，并且通过荧光显微镜检查在x100放大率下计数贴壁细胞，并且表示为细胞数目/视野。数据是3次不同实验的平均值±SD。
衍生自EPC的MVs能够诱导肾小球内皮细胞(GECs)的细胞增殖和体 外血管发生。
衍生自EPC的MV能够诱导肾小球内皮细胞(GEC)的细胞增殖和体外血管发生。就对照而言，GEC与衍生自EPC的不同剂量MV(10、15和30μg/ml)一起温育48小时显著促进GEC的细胞增殖。如图17中所示，GEC(在96孔板内8000细胞/孔)与10μM BrdU一起加入，在DMEM中与仅媒介物或不同剂量的MV一起温育。细胞随后用0.5M乙醇/HCl固定，并且与核酸酶一起温育以消化DNA。使用抗BrdU过氧化物酶缀合的mAb检测掺入DNA内的BrdU，并且用可溶性生色底物显现。光密度用ELISA阅读器在405nm下进行测量。结果表示为3次实验的平均值±1SD。
此外，不同剂量的MV(10、15和30μg/ml)诱导在Matrigel上温育6小时的GEC中的体外血管发生。
MVs对肾修复的体内生物效应
MVs促进实验诱导的急性肾小管损伤的再生
为了测定衍生自来自C57/BL6小鼠成年骨髓的MSCs的MVs是否能够促进从急性肾损伤的恢复，用高渗甘油的肌内注射在雌性C57/BL6小鼠中诱导ARF。甘油诱导肌溶解和溶血，从而使组织特别是肾暴露于大量肌红蛋白和血红蛋白。在这个鼠类模型中，如通过血清肌酸酐和BUN测量的，肾功能在甘油施用后1-4天之间是损伤的。在我们的设置中，7.5ml/kg甘油的肌内注射诱导血清肌酸酐和BUN的显著增加，这在第3天时达到峰值，在第10天时降低，并且在第21天时标准化。就给予盐水的甘油处理的小鼠而言，在接受甘油后第3天时，衍生自MSC或1x106MSCs的MV的静脉内注射在第5天时显著减少血清肌酸酐和BUN(图18和图19)。
图18显示MVs保护甘油处理的小鼠免于肾功能衰退。在未处理(黑色柱)或在第3天时用6μg MVs(白色柱)或1X106MSC(阴影柱)处理的用甘油诱导ARF的小鼠中的血液尿素氮(BUN)评估。结果表示为3次个别实验的平均值±SD，并且执行ANOVA：*p＜0.05
图19涉及在具有甘油诱导ARF、未处理(黑色柱)或在第3天时用6μg MVs(白色柱)或1X106MSC(阴影柱)处理的小鼠中的肌酸酐评估。结果表示为3次个别实验的平均值±SD，并且执行ANOVA：*p＜0.05
在具有甘油诱导ARF的小鼠中在第5天时显著的肾小管上皮损伤是显而易见的。在具有甘油诱导ARF的小鼠中观察到的形态改变包括空泡形成、刷状缘丧失和肾小管上皮细胞的广泛坏死和肾小管透明管型形成。当MVs注射到甘油处理小鼠中时，肾小管病变由于肾小管再生而较不严重，并且管再表达刷状缘。
MVs促进实验诱导的肾小球损伤的再生
为了测定衍生自人EPC的MV是否能够诱导肾小球再生，使用肾小球肾炎的Thy-1模型，其特征在于急性抗体介导的肾小球损伤：在这个模型中，抗Thy-1抗体诱导肾小球膜溶解伴随肾小球毛细血管丧失和炎症细胞累积。肾小球损伤与蛋白尿相关。通过在第0天时将250μg/100g重量的抗Thy1-1抗体(Ab)i.v.施用到6周大雌性Lewis大鼠的股静脉内诱导肾小球肾炎(GN)。对照动物接受相同体积的盐水注射代替抗Thy1.1Ab。在第2天时，当已可检测出蛋白尿时，将30μgEPC衍生的MVs注射到对侧股静脉中。对照动物接受相同量的仅媒介物(经修饰的M199培养基Hepes加上1％DMSO)的注射。每天评估蛋白尿、血清和尿肌酸酐/尿素(24小时尿液采集)。小鼠在下述天数D4、D7、D14时处死。每个实验组包括9只大鼠。
如图20中所示，MV的施用显著减少在具有Thy-1GN的大鼠中的蛋白尿。组织学分析显示在具有Thy-1GN的大鼠中存在毛细血管壁的发散损伤，伴随微动脉瘤形成和炎症细胞的存在。肾小球毛细血管的丧失也由关于减少的RECA抗原染色指出，所述RECA抗原是内皮标记。此外，观察到近端和远端肾小管的发散损伤伴随在肾小管腔内的蛋白管型。用MV处理的大鼠肾的组织学检查证实在第4天时减少的肾小球和肾小管损伤坏死，以及在第7天时如RECA抗原和肾小管细胞刷状缘的正常分布检测的肾小球毛细血管再生。通过电子显微镜检查证实毛细血管损伤经由MV处理的抑制，这证实在MV处理大鼠中完整内皮细胞层的存在和足突状细胞足突的正常分布。相比之下，在未用MV处理的大鼠中观察到由于损伤内皮经由炎症细胞的吞噬作用的MV膨胀和内皮细胞脱落。此外，存在足突的消失。
总之，用MV处理Thy-1GN抑制蛋白尿、肾小球炎症病变且促进肾小球毛细血管再生和恢复。
结论
所获得的实验结果暗示衍生自不同起源干细胞例如内皮祖细胞、间充质、肝和肾干细胞的MVs，能够将生物信号转移给肾成熟细胞，导致靶细胞的去分化，获得未成熟表型连同对凋亡刺激的抗性以及迁移和增殖能力。驻留细胞的去分化、其迁移和增殖是关于在肾小管和肾小球损伤后的修复事件的关键需求。事实上，实验急性肾小管坏死和抗体介导的肾小球损伤的处理导致加速功能和形态恢复。因此，可以提议衍生自干细胞的MVs用于在不同肾小管和肾小球病理状态中的再生治疗。使用MVs而不是干细胞的优点是避免干细胞的潜在致瘤效应，避免免疫抑制需要和无限体外产生的可能性。
参考文献
1.Bonventre JV，Weinberg JM.Recent advances in thepathophysiology of ischemic acute renal failure.J Am Soc Nephrol.2003Aug；14(8)：2199-210.
2.Bonventre JV.Dedifferentiation and proliferation of survivingepithelial cells in acute renal failure.J Am Soc Nephrol.2003 Jun；14Suppl 1：S55-61.
3.Iruela-Arispe L，Gordon K，Hugo C，Duijvestijn AM，ClaffeyKP，Reilly M，Couser WG，Alpers CE，Johnson RJ.Participation ofglomerular endothelial cells in the capillary repair of glomerulonephritis.Am J Pathol.1995 Dec；147(6)：1715-27.
4.Herrera MB，Bussolati B，Bruno S，Morando L，Mauriello-Romanazzi G，Sanavio F，Stamenkovic I，Biancone L，CamussiG.Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means ofCD44 following acute tubular injury.Kidney Int.2007 Aug；72(4)：430-41.
5.Biancone L，Cantaluppi V，Duo D，Deregibus MC，Torre C，CamussiG.Role of L-selectin in the vascular homing of peripheral blood-derivedendothelial progenitor cells.J Immunol.2004 Oct 15；173(8)：5268-74.
6.Kunter U，Rong S，Boor P，Eitner F，Muller-Newen G，Djuric Z，van Roeyen CR，Konieczny A，Ostendorf T，Villa L，Milovanceva-PopovskaM，Kerjaschki D，Floege J.Mesenchymal stem cells prevent progressiveexperimental renal failure but maldifferentiate into glomerular adipocytes.JAm Soc Nephrol.2007 Jun；18(6)：1754-64.
7.Deregibus MC，Cantaluppi V，Calogero R，loIacono M，Tetta C，Biancone L，Bruno S，Bussolati B，Camussi G.Endothelial progenitorcell-derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelialcells by an horizontal transfer of mRNA.Blood 2007，110：2440-2448.
8.Chertow GM，Soroko SH，Paganini EP，Cho KC，Himmelfarb J，Ikizler TA，Metha RL.Mortality after acute renal failure：models forproghostic stratification and risk adjustment.Kidney Int.2006；70：1120-1126.
9.Metha RL，Pascual MT，Soroko S，Savage BR，Himmelfarb J，Ikizler TA，Paganini EP，Chertow GM.Program to Improve Care inAcute Renal Disease.Spectrum of acute renal failure in the intensive careunit：the PICARD experience.Kidney Int.2004；66：1613-1621.
10.Bonegio R，Lieberthal W.Role of apoptosis in the pathogenesis ofacute renal failure.Curr Opin Nephrol Hypertens.2002；11：301-308.
11.Tonelli M，Manns B，Feller-Kopman D.Acute renal failure inthe intensive care unit：a systematic review of the impact of dialyticmodality on mortality and renal recovery.Am J Kidney Dis.2002 Nov；40(5)：875-85.
12.Bussolati B，Bruno S，Grange C，Buttiglieri S，DeregibusMC，Cantino D，Camussi G.Isolation of renal progenitor cells from adulthuman kidney.Am J Pathol.2005Feb；166(2)：545-55.
13.Nangaku M.Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury：a finalcommon pathway to end-stage renal failure.J Am Soc Nephrol.2006 Jan；17(1)：17-25.
14.Herrera MB，Bussolati B，Bruno S，Fonsato V，MaurielloRomanazzi G，Camussi G.Mesenchymal stem cells contribute to the renalrepair of acute tubular epithelial injury.Int J Mol Med 2004；14：1035-1041.
15.Conaldi PG，Biancone L，Bottelli A，Wade-Evans A，RacusenLC，Boccellino M，Orlandi V，Serra C，Camussi G，Toniolo A.HIV-1kills renal tubular epithelial cells in vitro by triggering an apoptoticpathway involving caspase activation and Fas upregulation.J Clin Invest.1998Dec 15；102(12)：2041-9.
16.Molitoris BA，Sutton TA.Endothelial injury and dysfunction：role in the extension phase of acute renal failure.Kidney Int.2004 Aug；66(2)：496-9.

Claims (6)

1.干细胞衍生的微泡(MV)用于制备用于肾损伤的药物的用途，所述干细胞选自内皮祖细胞(EPCs)、肾祖细胞CD133+和成人肝干细胞(HLSCs)。
2.根据权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗急性肾衰竭(ARF)。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述微泡(MV)衍生自内皮祖细胞(EPC)。
4.根据权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物是适合于通过静脉内输注施用的剂型。
5.根据权利要求1-4中任一项的用途，其中所述药物是适合于以30至120μg/kg体重的量施用微泡的剂型。
6.受损或损伤肾或肾组织的内皮/上皮再生的体外方法，其包括用有效量的干细胞衍生的微泡(MVs)处理所述受损或损伤肾或肾组织，所述干细胞选自内皮祖细胞(EPCs)、肾祖细胞CD133+和成人肝干细胞(HLSCs)。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110179826A (zh) * 2019-05-29 2019-08-30 武汉五州润达生物医药科技有限公司 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101314868B1 (ko) 2009-07-01 2013-10-08 주식회사이언메딕스 포유류의 유핵세포에서 유래된 마이크로베시클 및 이의 용도
SG10201403202XA (en) * 2009-07-23 2014-08-28 Agency Science Tech & Res Pre-natal mesenchymal stem cells
EP2363136A1 (en) 2010-03-02 2011-09-07 Fresenius Medical Care Deutschland GmbH Microvesicles (MVs) derived from adult stem cells for use in the therapeutic treatment of a tumor disease
NZ603482A (en) 2010-05-12 2014-11-28 Tengion Inc Bioactive renal cells
US9149542B2 (en) * 2010-07-01 2015-10-06 Aeon Medix Inc. Microvesicles derived from cell protoplast and use thereof
EP2603592A2 (en) * 2010-08-13 2013-06-19 The University Court of the University of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
EP2495025A1 (en) 2011-03-04 2012-09-05 Fresenius Medical Care Deutschland GmbH Filter for the removal of micro-vesicles from biological fluids, methods and devices using such a filter
KR101334404B1 (ko) * 2011-04-28 2013-12-12 포항공과대학교 산학협력단 배아줄기세포 유래의 인공 마이크로베시클을 이용한 역분화 유도만능줄기세포의 제조방법
KR101405437B1 (ko) * 2011-08-16 2014-06-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경 생성 촉진용 조성물
US20150093447A1 (en) * 2012-03-23 2015-04-02 Neostem, Inc. Stem cell identification and purification method
US20150079047A1 (en) * 2012-04-16 2015-03-19 The Regents Of The University Of California Ocular therapeutics using embryonic stem cell microvesicles
CN103040867A (zh) * 2013-01-04 2013-04-17 江苏省人民医院 骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用
CN103045534B (zh) * 2013-01-23 2014-10-22 山东大学 一种老年大鼠脑血管内皮细胞培养液
JP6562897B2 (ja) 2013-03-13 2019-08-21 ユニバーシティー オブ マイアミＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ 細胞培養上清および生体液からの微小胞の単離および精製のための方法
TWI582232B (zh) 2013-03-13 2017-05-11 Zhong Li Microbubbles and methods for their manufacture
ES2526816B1 (es) * 2013-06-14 2015-10-27 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Composiciones para el tratamiento del daño hepático
DK3016665T3 (da) 2013-07-05 2019-11-25 Univ Catholique Louvain Konditioneret medium fra humane voksne leverstamceller og dets anvendelse i behandlingen af leverlidelser
EP3033418B1 (en) * 2013-08-14 2019-12-11 Reneuron Limited Stem cell microparticles and mirna
US10160955B2 (en) * 2015-06-30 2018-12-25 Board Of Supervisors Of Louisiana State University Method for harvesting stem and progenitor cells and method of treatment of kidney disease and neurological disease
DE102016109067B4 (de) 2016-05-17 2018-07-19 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren zur Bildung von Nierentubuli
EP3308795A1 (en) * 2016-10-12 2018-04-18 Unicyte EV AG A composition of extracellular vesicles (evs) and medical uses thereof
CN106692984B (zh) * 2016-12-08 2020-02-18 武汉大学 一种基于细胞源性微囊泡的肿瘤靶向递送载体及制备方法和应用
CN107937342B (zh) * 2017-11-06 2021-07-06 中国人民解放军第四军医大学 一种通过内皮细胞来源的外泌体扩增神经干细胞的方法
ES2724215B2 (es) * 2018-03-01 2020-04-14 Univ Alcala Henares Microvesículas endoteliales con efecto microbicida
KR102015502B1 (ko) 2018-03-29 2019-08-28 아키소스템바이오스트래티지스(주) 인간 제대로부터 줄기세포를 분리하는 방법
EP3833744A1 (en) * 2018-08-10 2021-06-16 Unicyte EV AG Extracellular vesicles loaded with an exogenous molecule
CN112300984A (zh) * 2020-09-21 2021-02-02 四川大学华西医院 一种医用hUC-MSCs-MVs批量制备流程及质控

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005121369A2 (en) * 2004-06-02 2005-12-22 Sourcepharm, Inc. Rna-containing microvesicles and methods therefor

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007535486A (ja) * 2003-05-07 2007-12-06 ラ ホーヤ インスティチュート フォー モレキュラー メディシン 高分子量のヒアルロン酸を用いた内因性又は埋め込まれた又は移植された幹細胞の機能回復を促進するための方法
GB0501129D0 (en) * 2005-01-19 2005-02-23 Ribostem Ltd Method of treatment by administration of RNA

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005121369A2 (en) * 2004-06-02 2005-12-22 Sourcepharm, Inc. Rna-containing microvesicles and methods therefor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MB Herrera.Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means of CD44 following acute tubular injury.《kidney international》.2007,第72卷(第4期),430-441. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110179826A (zh) * 2019-05-29 2019-08-30 武汉五州润达生物医药科技有限公司 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法

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Publication number Publication date
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