JP5686841B2 - 損傷しまたは傷害を受けた組織または臓器の内皮/上皮再生用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞(mv)の使用ならびにインビトロおよびインビボでの関連した方法 - Google Patents
損傷しまたは傷害を受けた組織または臓器の内皮/上皮再生用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞(mv)の使用ならびにインビトロおよびインビボでの関連した方法 Download PDFInfo
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
好ましい態様において、医薬は急性腎不全(ARF)のような腎損傷の処置に関する。
別の好ましい態様において、医薬は急性肝不全(AHF)のような肝損傷の処置に関する。
細胞調製物
内皮前駆細胞(EPC)、間葉系幹細胞(MSC)およびCD133腎前駆細胞の単離および特徴付け
EPCは、健常ドナー由来の末梢血単核細胞から密度遠心分離によって単離して、フィブロネクチン被覆培養フラスコ中の5%のFBS、VEGF、FGF−2、EGFおよびインスリン様増殖因子−1を補った内皮細胞基礎培地−2(Clonetics, Biowhittaker, Walkersville, MD)に播種した。内皮の同一性は、FACS、ウェスタンブロット、遺伝子マイクロアレイ分析およびマトリゲル被覆プレート上での血管形成特性の機能的評価によって、既報の通りに試験した(5)。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)は既報の通りに単離し、培養した(4)。8週齢マウスの大腿骨および脛骨由来マウスMSC(mMSC)は、既報の通りに得た(14)。10%のFCS、10%のウマ血清(いずれもEuroclone, Westenby, UKから)、2mMのL−グルタミン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100IU/mLのペニシリン(全てSigma, St Louis, MO, USAから)を補ったα−MEM(Invitrogen, Paisley, Scotland)に細胞を密度20〜40×106細胞/9.5cm2で播種した。72時間後に非接着細胞集団を除去し、接着層を新鮮な培地で1回洗浄した。細胞は典型的な紡錘型外見を有し、MSC表現型が間葉系幹細胞マーカーの発現ならびに骨細胞および脂肪細胞への分化能によって、既報の通り確認された(14)。腎前駆細胞は、外科的に採取した腎臓から得た皮質の正常部分から得た。切除および連続等級メッシュによるふるい分けの後、MACSシステム(Miltenyi Biotec, Auburn, California)を用いた磁気的細胞選別によって、CD133+細胞を尿細管分画から単離した。60%のDMEM LG(Invitrogen, Paisly, United Kingdom)、40%のMCDB−201の存在下で、1×インスリン−トランスフェリン−セレニウム、1×リノール酸2−リン酸、10−9Mのデキサメタゾン、10−4のアスコルビン酸2−リン酸、100Uのペニシリン、1000Uのストレプトマイシン、10ng/mlのEGFおよび10ng/mlのPDGF−BB(全てSigma-Aldrich, St.Louis, Missouryから)および2%のFCS(EuroClone, Wetherby, United Kingdomから)を補ったフィブロネクチン上にCD133+細胞を播種した(12)。選択した細胞は造血マーカーの発現を欠いており、胚腎マーカーであるPAX−2を発現していた。これはそれらが腎臓起源であることを示唆している。腎組織由来CD133+細胞および個々の細胞のクローンは、増殖および限定的な自己再生が可能であり、インビトロで上皮または内皮細胞に分化することができた。インビトロでの上皮分化は、FGF−4(10ng/ml)およびHGF(20ng/ml)(Sigma)の存在下で得られた。内皮分化は、VEGF(10ng/ml)(Sigma)および内皮細胞接着因子(Sigma)上10%FCSを補ったEBM培地(Cambrex Bio Science, Baltimore, Maryland)中で培養して得られた(12)。SCIDマウスに皮下移植すると、未分化細胞は腎上皮マーカーを発現する尿細管構造を形成した。
MVは、FCSを除いた培地中で培養した別の前駆細胞の上清から得た(7)。2000gで20分間遠心分離してゴミを除いた後、細胞を含まない上清を100000gで1時間、4℃で遠心分離し(Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifuge)、無血清培地で洗浄し、同じ条件での2回目の超遠心分離に供した。製造業者の指示書(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)に従ったLimulusテストによって、内毒素汚染を除いた。得られたMVは次のとおりに分析した:
マウス毒性ARFモデル
C57Bl/6マウスの急性毒性尿細管損傷は、50%グリセロール溶液(Sigma, St. Louis, MO)の7.5ml/kg体重の筋注によって、既報の通り誘導した(14)。血清クレアチニンレベルおよび尿素濃度を測定して(Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA)、腎機能を評価した。尿細管損傷のピークはグリセロール注射後3日で生じた(14)。ARF誘導から3、6、10および15日後にマウスを屠殺し、最大損傷および尿細管再生の段階を評価した。組織学的および免疫組織化学的分析のために腎臓をホルマリン固定してパラフィン包埋した。
6週齢メスLewisラットに250μg/100g体重の抗Thy1−1抗体(Ab)を0日目に大腿静脈に静脈内投与して、糸球体腎炎(GN)を誘導した。対照動物には抗Thy1.1 Abの代わりに同量の生理食塩水を注射で投与した。既にタンパク尿が検出できた2日目に、30μgのEPC由来MVを反対側の大腿静脈に注射した。対照動物には同量のビークル(Hepes修飾M199培地と1%のDMSO)のみを注射で投与した。タンパク尿、血清および尿クレアチニン/尿素(24時間尿採取)を毎日評価した。マウスを4日目、7日目、14日目に屠殺した。各実験グループは9匹のラットを含む。
ヒト尿細管細胞の単離および培養
ヒトTECの初代培養(PTEC)は、腎臓癌に罹患している患者から外科的手法によって採取した腎臓から得た(15)。ハイブリッドAdeno5/SV40ウイルスに感染させて得たPTECの不死化細胞系を用いて、初代尿細管細胞で行った実験を確認し、敷衍した。10%のFCS(Hyclone, Logan, Utah)および2mMのグルタミン(GIBCO)を含むRPMI1640(GIBCO, Grand Island, NY)で細胞を増殖させた。
96ウェルプレート中の10%のFCSを含むDMEM培地に、8000細胞/ウェルで細胞を播種して、接着させた。DNA合成は、細胞DNAへの5−ブロモ−2−デオキシウリジン(BrdU)の取り込みとして、ELISAキット(Roche Applied Science)を用いて検出した。簡潔には、細胞に10μMのBrdUを加え、10%のFCSの存在下または非存在下でDMEM中で18時間インキュベートした。次いで細胞を0.5Mのエタノール/HClで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてDNAを消化した。DNAに取り込まれたBrdUは、抗BrdUペルオキシダーゼ結合mAbを用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をELISAリーダーで405nmで測定した。
アポトーシスは、TUNELアッセイ分析(ApopTag Oncor, Gaithersburg, MD)を用いて評価した。多様な前アポトーシス性刺激の後、細胞をPBSに懸濁し、PBS中1%のパラホルムアルデヒド、pH7.4で15分間、4℃で固定し、PBSで2回洗浄した後、予め冷却した2:1のエタノール−酢酸で5分間、−20℃で固定した。サンプルをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)酵素で処理した。次いで細胞を、フルオレセインと結合した抗ジゴキシゲニンで加温下で処理し、室温で30分間インキュベートした。1μg/mlのヨウ化プロピジウムを含む培地にサンプルを乗せ、免疫蛍光法で細胞を分析した。結果は赤色蛍光放出細胞(全細胞)に対する緑色蛍光放出細胞(アポトーシス細胞)の百分率として表現する。
カスパーゼ3−8−9の活性は、カスパーゼによって認識される標識化基質DEVD−pNAを切断した後、発色団p−ニトロアニリド(pNA)の分光光度的検出に基づくELISA(Chemicon, Temecula, CA)によって評価した。尿細管溶解物を適切な反応バッファーで希釈し、DEVD−pNAを最終濃度50Mで加えた。次いでサンプルを波長405nmで自動ELISAリーダーで分析した。各実験は、3連で行った。
FACS分析のため、細胞を組織培養プレートからEDTAで剥離し、1×PBSで2回洗浄し、別の分子に関する一次抗体または無関係な対照抗体で、4℃で1時間染色した。細胞をAlexa Fluor結合二次抗体と共に45分間、4℃でインキュベートした。細胞を1%のパラホルムアルデヒドで固定し、FACS分析に供した(Becton Dickinson, Mountain View, CA)。
ウェスタンブロット分析のために、細胞をEDTAで剥離し、1%のTriton-X-100、10μM/mlのロイペプチン、10μMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSFjおよび100U/mlアプロチニンを含む50mMのTris−HCl溶解バッファーで溶解させた。尿細管溶解物を15000×gで遠心分離した後、上清のタンパク質含量をBradford法で測定した。30μg/レーンのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に供し、ニトロセルロースメンブランフィルターにエレクトロブロットした。次いで20mMのTris−HCl(pH7.5)、500mMのNaClおよび0.1%のTweenを含む5%の無脂肪ミルクでブロットをブロックした。濃度500ng/mlのAkt、P−Akt、Bcl−xLに対する抗体(全てSanta Cruz Biotechnologyから)またはPax−2に対する抗体と共に、膜を4℃で一夜インキュベートした。0.1%のTweenで入念に洗浄した後、HRP結合タンパク質A(200ng/ml、Amersham, Buckingamshire, UK)で1時間、RTでブロットを染色し、0.1%のTweenで再度洗浄し、ECL検出試薬(Amersham)で現像して、X-Omatフィルム(Eastman Kodak, Rochester, NY)に曝した。
経上皮電気抵抗(TER)を上皮極性の指標として用いた。細胞をTranswell中コラーゲン被覆ポリカーボネート膜(Corning Costar Corp., Cambridge, MA)に播種し、コンフルエンスに到達させた後、多様な刺激を加えた。上皮ボルト−オームメーター(EVOM;World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL)を用いてTER値を既報の通りに測定した(12)。全測定は3連で実施し、膜の面積について正規化した。
尿細管細胞を50mg/mlのFITC結合ヒトアルブミンと共に37℃で2時間インキュベートした後、タンパク質取り込みを試験した。FITC−アルブミン負荷の後、細胞を氷冷PBSで3回念入りに洗浄し、FACSで分析した。
機械的ストレス条件を模倣するために、コンフルエントな単層に生じさせた外傷へと尿細管細胞が移動する速度として、移動を評価した。細胞運動性はNikonの倒立顕微鏡下で、密封したインキュベーター内で37℃で観察した。Micro-Image分析システム(Casti Imaging srl, Venezia, Italy)を用いて30分間隔で異なる画像をデジタル保存した後、移動を分析した。細胞移動は、視野当たり30個以上の細胞の核の位置に印を付けて評価した。観察物の始点から終点までの直線距離を観察時間で割った比として、平均速度を計算した。選択実験および形態発生アッセイにおいて、タイプIVコラーゲンであるフィブロネクチン 20μg/mlまたはMatrigelで予めコーティングしたプレートに散在している尿細管細胞を播種した。
マトリゲルプラグ中PTECの皮下移植を行って、インビボで幹細胞由来MVの管形成効果を評価した。簡潔には、増殖因子欠乏マトリゲル(Becton Dickinson)を使用するまで−20℃で維持し、移植の直前に4℃で一夜解凍した。FCSを含まない新鮮な培地250μlに5000個の細胞を再懸濁し、多様な刺激の存在下で冷却ピペットチップを用いて氷上でマトリゲル500μlと混合した。全サンプルをSCIDマウスの後肢に皮下移植した。1週間後、マウスを屠殺し、試験のためにマトリゲルプラグを回収した。
多様な刺激と共にインキュベートしたHMECの尿細管生存率に対する効果を試験するために、共培養モデルを適用した。HMECを24ウェルプレートで24時間、標準培養条件で播種した。次いでHMECを24時間または48時間、10μg/mlのEPC由来MVの存在下または非存在下で、血清欠乏に付した。上記条件下でインキュベーションした後、培地を吸引し、接着細胞を1×PBSで念入りに洗浄し、RPMIで1:1に希釈した増殖因子減少マトリゲル;(BD)200μlを上覆いとして用い、37℃で30分間ゲル状にさせた。その後、1×104個の尿細管細胞を核ウェルに加えてサンドイッチ共培養物を完成させた。共培養物をさらに24または48時間、血清欠乏条件でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、尿細管細胞をXTT利用アッセイ(Sigma)に供した。データは3つの異なる実験の平均±SDとして与えられる。
以下の抗体を用いて細胞蛍光分析を実施した:全てFITCまたはPE結合の、抗CD133−1モノクローナルAb(mAb)(Miltenyi Biotec)、抗CD44および抗ヒトHLAク宴XI mAb(Sigma)、抗CD31および抗CD105mAb(Serotec Inc, Oxford, United Kingdom)、抗KDR mAb(R&D System, Minneapolis, Minnesota);抗Muc−18 mAb(Chemicon International, Temecula, California)、抗CD29、抗CD33、抗CD34、抗CD45、抗CD73、抗CD90、抗CD117 mAb(Becton Dickinson, San Jose, California)。抗VEカドヘリンmAbはGuido Tarone(University of Torino)から提供を受けた。FITCまたはPEマウス非免疫アイソタイプIgG(Dako, Copenhagen, Denmark)を対照として用いた。チャンバースライドで培養し、2%ショ糖を含む4%パラホルムアルデヒドで固定し、所望によりHepes-Triton-X 100バッファーで透過処理した細胞で、間接免疫蛍光法を実施した。液体窒素で急速凍結し、3μm切片に切断し、2%ショ糖を含む3.5%パラホルムアルデヒドで固定したヒトまたはマウス組織でも免疫蛍光法を実施した。次の抗体を用いた:抗Na−Clコトランスポーター、抗アミノペプチダーゼAおよび抗アルカリホスファターゼポリクローナルヤギAb(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)、ウサギ抗閉鎖帯(ZO)−1ポリクローナルAb(Santa Cruz Biotechnology)、ヤギ抗−VWFおよびウサギ抗Pan-Cytokeratin Ab(Sigma)、抗ビメンチンおよび抗EカドヘリンmAb(Dako)、抗EMA mAb(Chemicon International)、ポリクローナルウサギ抗PAX2 Ab(Covance, Princeton, New Jersey)、PE結合抗CD133(Miltenyi Biotec)および抗増殖細胞核抗原(PCNA)、FITC結合抗HLA Iおよび抗カルビンジンD−28K mAbs(Sigma)。対照マウス、ウサギまたはヤギ非免疫免疫グロブリンを対照として用いた。FITC結合抗マウス、ウサギまたはヤギIgG(Sigma)を、所望により、二次抗体として使用した。10%緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織で、既報のとおり免疫組織化学を実施した(7)。Leika TCS SP2モデルの共焦点顕微鏡(Heidelberg, Germany)を用いて共焦点顕微鏡観察を実施した。核を染色するためにHoechst 33258染色剤(Sigma)を加えた。
異なる実験方法の全てのデータは、平均±SDとして与えられる。統計的分析は、適切であるとき、多重比較試験によるANOVAで実施した。
MVの特徴
EPC、MSCおよびCD133腎前駆細胞由来のMVについて、1、2、4および6μmビーズをサイズの内部標準としたFACS分析を用いて、サイズを測定したところ、幹/前駆体細胞の別集団由来のMVが同様のサイズを有することが示された。観察したMVの大多数は1μmビーズに対応するFSCシグナル未満であった(図1A)。走査型および透過型電子顕微鏡観察によってMVが球状の形態を有することが示され、サイズが0.2〜1μmであることが確認された(図1B)。画像は作動距離15〜25mm、加速電圧20〜30kVで二次電子を介して得られた。FACS分析によって、対応する幹/前駆体細胞の細胞膜によって発現されることが知られている接着分子の発現をMVが示した(図1C)。EPC、MSC由来MVおよび常在腎臓CD133+前駆体は、CD44、CD29の発現について共通しているが、ICAM−1、α4インテグリンおよびα5インテグリンの発現については異なっていた。これらの結果は、MVが表面で、それらの起源である細胞の細胞膜の多様な決定因子を発現することを示している。接着分子の発現は標的細胞中のMVの取り込みに役立つことが既に示されている。
尿細管損傷は虚血性または毒性急性腎不全(ARF)の特徴である。さらに、傍尿細管毛細血管の内皮細胞の損傷は、虚血後の腎臓損傷の拡大に寄与することが示されている(16)。したがって、我々は幹細胞から放出されたMVの近位尿細管上皮細胞系(PTEC)に対する効果を調べた。
我々は、漸増用量のマウス間葉系細胞(mMSC)由来MVと共にPTECをインキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して、シスプラチンによって誘導されるアポトーシスが顕著に減少することを見出した。RNaseと共にMVをインキュベートすると、アポトーシスに対する耐性が破壊された。得られた結果を図2に示す。アポトーシスは、0.5μm/mlのシスプラチンと共に24時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合として、TUNELアッセイによって評価した(黒棒)。PTECをビークルのみと、または多様な用量のMVと共にインキュベートした。 斜線付の棒はシスプラチンで処理しない対照を示す。結果は3回の実験の平均±1SDとして表す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った:* p<0.05 MV対ビークルのみ。
mMSC由来MVはPTECによるPCNAの発現を誘導する。5×104細胞/ウェルの尿細管細胞を10μg/mlのMVまたはビークルと共に、DMEM+5%のBSA中で24時間インキュベートして、PCNAの発現を共焦点顕微鏡で評価した。得られた結果は、無血清培地で培養したPTEC中のPCNAについて染色された核が存在せず、mMSC由来MVと共にインキュベートした後、PTECによって核がPCNAを発現することが示された。3回実験を実施し、同様の結果が得られた。
多様な用量(1、5および10μg/ml)の成人腎前駆細胞CD133+由来MVと共にPTECをインキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して、シスプラチンによって誘導されるアポトーシスが顕著に阻害された(図3)。アポトーシスは、0.5μm/mlのシスプラチンと共に24時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合として、TUNELアッセイによって評価した(黒棒)。斜線付の棒はシスプラチンで処理しない対照を示す。結果は3回の実験の平均±1SDとして表す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った:* p<0.05 MV対ビークルのみ。
2種の異なる用量(15および30μm/ml)のヒト腎臓前駆細胞CD133+由来MVと共にPTECを48時間インキュベートすると、対照と比較して尿細管上皮細胞の細胞増殖が顕著に促進された。96ウェルプレート中8000細胞/ウェルに10μMのBrdUを加え、ビークルのみまたは多様な用量のMVと共にDMEM中でインキュベートした。次いで細胞を0.5Mのエタノール/HClで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてDNAを消化した。抗BrdUペルオキシダーゼ結合mAbを用いてDNAに取り込まれたBrdUを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をELISAリーダーで405nmで測定した。結果は3回の実験の平均±1SDとして表す。結果を図4に示す。
ヒト腎臓前駆細胞CD133由来MVはPTECの脱分化を誘導する。5×104細胞/ウェルのPTECをビークルのみまたは10μm/mlのヒト腎臓前駆細胞CD133由来MVと共にDMEM+5%BSA中で24時間インキュベートして、PAX2およびビメンチンの発現を共焦点顕微鏡で評価した。
間葉系幹細胞(MSC)または成人肝臓幹細胞(HLSC)由来MVはヒト肝細胞の増殖を補助できる; 多様な用量(10、25および50μm/ml)のMSCまたはHLSC由来MVと共に肝細胞を72時間インキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して細胞増殖が促進された。96ウェルプレート中5000細胞/ウェルに10μMのBrdUを加え、ビークルのみまたは多様な用量のMVと共にDMEM中でインキュベートした。次いで細胞を0.5Mのエタノール/HClで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてDNAを消化した。抗BrdUペルオキシダーゼ結合mAbを用いてDNAに取り込まれたBrdUを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をELISAリーダーで405nmで測定した。結果は3回の実験の平均±1SDとして表す。結果を図4に示す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った:* p<0.05 MV対ビークルのみ。結果は、MSCまたはHLSC由来MVが成熟ヒト肝細胞の増殖をインビトロで刺激することができることを明確に示しており、これは肝臓再生における潜在的な効果を示唆している。
既報の通りTUNELアッセイを用いて、ヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスを評価した。簡潔には、アポトーシスの誘導のためのポジティブコントロールとしてシスプラチン(2μg/ml)を用いて、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)介在ニック末標識(TUNEL)アッセイ分析に細胞を供した。細胞をPBSで洗浄し、PBS中1%パラホルムアルデヒド pH7.4で固定し、TdT酵素、ジゴキシゲニン−dNTPと共にインキュベートし、抗ジゴキシゲニン−FITC抗体およびPBS中ヨウ化プロピジウム(1μg/ml)で対比染色した。アポトーシス細胞のFITC標識化DNAフラグメントを倒置UV顕微鏡で可視化した。ビデオカメラを用いて得られた画像のデジタル分析によって細胞数を計測し、アポトーシス陽性細胞を10倍の倒置顕微鏡視野で計測した合計細胞数の割合として表した。このアッセイで用いたMVの濃度は、48時間で、10、15、30μg/mlであった。
図6は10、15および30μg/mlのHLCS由来MVで刺激したヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスのパーセンテージを示す。HLSC由来MVは用量依存的に、初代細胞培養物であるヒト尿細管上皮細胞の増殖を刺激し、これはわずか数代に限られていた。増殖を刺激したMV濃度は10、15、30μg/mlであった。シスプラチンによってアポトーシスを誘導した場合、HLCS由来MVは、増殖の刺激と同じ濃度でヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスを阻害する。
PTECを漸増用量のMV(1〜5μg/ml)と共にインキュベートした。MVはPTECにおいて、インキュベーションの12時間後に増殖性効果を誘導し、24〜48時間後にさらに上昇した(図7)。MV誘導性増殖は1μg/mlの用量で顕著に上昇し、用量50μg/mlでピークに達した(図7)。図7はPTECに対するMV誘導性増殖効果を示す。PTECの時間経過増殖のXTT利用アッセイからのデータ。MVは、検討した全ての時点で、増殖の顕著な用量依存的上昇を誘導した(12、24、48時間)。データは3回の異なる実験の平均±SDとして表す。Newman-Keuls多重比較試験によるANOVAを実施した。
フィブロネクチン、タイプIVコラーゲンまたはマトリゲル被覆プレート上に播種した散在PTECの運動性を評価した。条件は、PTECが移動して尿細管完全性を回復するであろう微小環境を模倣した。散在PTECの低速度顕微鏡観察によって細胞移動に対するMVの効果を試験した。PTECの自発的運動性に対応するベースライン移動速度は観察の全期間(12時間)にわたって静置して得られ、3〜4μm/時間を超えることはなかった。MVは自発的移動の顕著な上昇を誘導し、これは2時間でピークとなり、全細胞外マトリックスにおいて、全観察期間を通じて顕著に高いままであった。図12は細胞外マトリックスで培養したPTECの移動に対するMVの効果を示す。10μg/mlのMSPとのインキュベーションによって、予め20μg/mlのヒトフィブロネクチン、タイプIVコラーゲンまたはマトリゲルで被覆したプレート上で培養したPTECの移動が上昇した。データは3回の異なる実験の平均速度(μm/時間)±SDとして与えられる。
経上皮耐性分析で評価したように、シスプラチン処理PTECにMVを加えると細胞極性が回復した。図13は経上皮耐性(TER)のシスプラチン誘導性変化に対するMVの効果を示す。細胞極性のマーカーであるPTEC TERの異なる実験条件での分析。シスプラチン(CIS 5μg/ml)はTER値を有意に低下させるが(*p<0.05 CIS対ビークル)、MV(10または50μg/ml)は正常TER値を回復した。データは3回の異なる実験の平均TER値±SDとして与えられる。TER値は実験に使用した膜面積について正規化した。Newman-Keuls多重比較試験によるANOVAを実施した。
PTECをFCSの非存在下、マトリゲル被覆プレート上で24時間培養すると、嚢胞様構造が形成された。10μg/mlのMVを加えると、PTECの分岐形態形成がもたらされた。マトリゲルプラグ中PTECをSCIDマウスに皮下注射した。これらの細胞は自発的に少数の尿細管様構造を形成し、これは10μg/mlのMVの存在下で顕著に増加した。対照的に、シスプラチンはアポトーシスを惹起する分岐形態形成を完全に阻害し、これはMV刺激によって回復された。10μg/mlのMVの存在下または非存在下でのマトリゲル被覆プレート上で培養したPTECの形態形成を評価した。24時間後、非刺激PTECは嚢胞様構造を形成したが、MVは散乱および分岐形態形成を誘導した。SCIDマウスにマトリゲル中で皮下注射したPTECのインビボでの尿細管形成も評価した。非刺激細胞はごく少数の尿細管様構造を形成し、これは10μg/mlの存在下では顕著に増加した。
サイトカイン処理PTECは、インビボでARF中に生じる炎症性応答を模倣したリンパ球接着を促進した。サイトカインで刺激したPTECにMVを加えると、PTECへのリンパ球接着を顕著に阻害したが、これはMVの抗炎症性作用を示唆している。
EPC由来MVは細胞増殖およびインビトロでの糸球体内皮細胞(GEC)の血管新生を誘導できた。GECを多様な用量のEPC由来MV(10、15および30μg/ml)と共に48時間インキュベートすると、対照と比較して、GECの細胞増殖を顕著に促進した。図17に示すとおり、GEC(96ウェルプレート中8000細胞/ウェル)に10μMのBrdUを加え、ビークルのみまたは多様な用量のMVと共にDMEM中でインキュベートした。次いで細胞を0.5Mのエタノール/HClで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてDNAを消化した。抗BrdUペルオキシダーゼ結合mAbを用いてDNAに取り込まれたBrdUを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をELISAリーダーで405nmで測定した。結果は3回の実験の平均±1SDとして表す。
さらに、多様な用量のMV(10、15および30μg/ml)はインビトロで、マトリゲル上で6時間インキュベートしたGECの血管新生を誘導した。
MVは実験的に誘導した急性尿細管損傷の再生を促進する
C57/BL6マウスの成体骨髄由来のMSC由来MVが急性腎損傷からの回復を促進できるか決定するため、メスC57/BL6マウスに高張グリセロールを筋肉内注射して、ARFを誘導した。グリセロールは組織、特に腎臓に曝露することによって、筋融解、そしてそれによる溶血を多くのミオグロビンおよびヘモグロビンに誘導した。このマウスモデルにおいて、血清クレアチニンおよびBUNによって測定されるように、腎臓機能がグリセロールの投与後1〜4日で損なわれる。今回の条件では、7.5ml/kgのグリセロールの筋内注射によって、血清クレアチニンおよびBUNの顕著な上昇が誘導され、これは3日目でピークに達し、10日目に低下し、21日目に正常化した。グリセロール投与の3日後、MSC由来MVまたは1×106個のMSCの静脈内注射によって、生理食塩水を与えたグリセロール処置マウスと比較して、5日目で血清クレアチニンおよびBUNが顕著に低下した(図18および19)。
ヒトEPC由来MVが糸球体再生を誘導し得るかを決定するために、急性抗体介在性糸球体損傷によって特徴付けられる糸球体腎炎のThy−1モデルを用いた:このモデルにおいて、抗Thy−1抗体は糸球体毛細血管の減少を伴ったメサンギウム融解および炎症性細胞の蓄積を誘導する。糸球体損傷はタンパク尿に関連している。糸球体腎炎(GN)は、6週齢のメスLewisラットの大腿静脈に250μg/100g体重の抗Thy−1抗体(Ab)を0日目に静脈内投与して誘導した。対照動物には抗Thy1.1 Abの代わりに同量の生理食塩水を注射した。既にタンパク尿が検出できた2日目に、30μgのEPC由来MVを反対側の大腿静脈に注射した。対照動物には同量のビークル(Hepes修飾M199培地と1%のDMSO)のみを注射で投与した。タンパク尿、血清および尿クレアチニン/尿素(24時間尿採取)を毎日評価した。マウスを4日目、7日目、14日目に屠殺した。各実験グループは9匹のラットを含む。
結論として、MVによるThy−1 GNの処置はAタンパク尿、糸球体炎症性病変を阻害し、糸球体毛細血管再生および回復を促進した。
得られた実験結果は、内皮前駆体、間葉系、肝および腎幹細胞のような異なる起源の幹細胞に由来するMVは、腎成熟細胞に生物学的シグナルを伝達することができ、これによってアポトーシス刺激に対する耐性ならびに移動能および増殖能と共に、未成熟表現型を獲得する標的細胞の脱分化が生じることを示唆している。常在細胞の脱分化、それらの移動および増殖は、腎尿細管および糸球体損傷後の修復に必須である。したがって、幹細胞由来MVは、多様な腎尿細管および糸球体病的状態における再生両方に提唱され得る。幹細胞よりもMVを用いる利点は、幹細胞の潜在的な腫瘍原性効果の回避、免疫抑制の必要の回避および限定されないインビトロでの生産の可能性である。
1. Bonventre JV, Weinberg JM. Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003 Aug;14(8):2199-210.
2. Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003 Jun;14 Suppl 1:S55-61.
3. Iruela-Arispe L, Gordon K, Hugo C, Duijvestijn AM, Claffey KP, Reilly M, Couser WG, Alpers CE, Johnson RJ. Participation of glomerular endothelial cells in the capillary repair of glomerulonephritis. Am J Pathol. 1995 Dec;147(6):1715-27.
4. Herrera MB, Bussolati B, Bruno S, Morando L, Mauriello-Romanazzi G, Sanavio F, Stamenkovic I, Biancone L, Camussi G.Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means of CD44 following acute tubular injury. Kidney Int. 2007 Aug;72(4):430-41.
5. Biancone L, Cantaluppi V, Duo D, Deregibus MC, Torre C, Camussi G. Role of L-selectin in the vascular homing of peripheral blood-derived endothelial progenitor cells. J Immunol. 2004 Oct 15;173(8):5268-74.
6. Kunter U, Rong S, Boor P, Eitner F, Muller-Newen G, Djuric Z, van Roeyen CR, Ko-nieczny A, Ostendorf T, Villa L, Milovanceva-Popovska M, Kerjaschki D, Floege J. Mes-enchymal stem cells prevent progressive experimental renal failure but maldifferentiate into glomerular adipocytes. J Am Soc Nephrol. 2007 Jun;18(6):1754-64.
7. Deregibus MC, Cantaluppi V, Calogero R, loIacono M, Tetta C, Biancone L, Bruno S, Bussolati B, Camussi G. Endothelial progenitor cell-derived microvesicles activate an an-giogenic program in endothelial cells by an horizontal transfer of mRNA. Blood 2007, 110:2440-2448.
8. Chertow GM, Soroko SH, Paganini EP, Cho KC, Himmelfarb J, Ikizler TA, Metha RL. Mortality after acute renal failure: models for prognostic stratification and risk adjustment. Kidney Int. 2006;70:1120-1126.
9. Metha RL, Pascual MT, Soroko S, Savage BR, Himmelfarb J, Ikizler TA, Paganini EP, Chertow GM. Program to Improve Care in Acute Renal Disease. Spectrum of acute renal failure in the intensive care unit: the PICARD experience. Kidney Int. 2004;66:1613-1621.
10. Bonegio R, Lieberthal W. Role of apoptosis in the pathogenesis of acute renal failure. Curr Opin Nephrol Hypertens.2002;11:301-308.
11. Tonelli M, Manns B, Feller-Kopman D. Acute renal failure in the intensive care unit: a systematic review of the impact of dialytic modality on mortality and renal recovery. Am J Kidney Dis. 2002 Nov;40(5):875-85.
12. Bussolati B, Bruno S, Grange C, Buttiglieri S, Deregibus MC, Cantino D, Camussi G. Isolation of renal progenitor cells from adult human kidney. Am J Pathol. 2005 Feb;166(2):545-55.
13. Nangaku M. Chronic hypoxia and tubulointerstitial injury: a final common pathway to end-stage renal failure. J Am Soc Nephrol. 2006 Jan;17(1):17-25.
14. Herrera MB, Bussolati B, Bruno S, Fonsato V, Mauriello Romanazzi G, Camussi G. Mesenchymal stem cells contribute to the renal repair of acute tubular epithelial injury. Int J Mol Med 2004;14:1035-1041.
15. Conaldi PG, Biancone L, Bottelli A, Wade-Evans A, Racusen LC, Boccellino M, Or-landi V, Serra C, Camussi G, Toniolo A. HIV-1 kills renal tubular epithelial cells in vitro by triggering an apoptotic pathway involving caspase activation and Fas upregulation. J Clin Invest. 1998 Dec 15;102(12):2041-9.
16. Molitoris BA, Sutton TA. Endothelial injury and dysfunction: role in the extension phase of acute renal failure. Kidney Int. 2004 Aug;66(2):496-9.
Claims (7)
- 細胞増殖抑制剤によって誘導されるアポトーシスの阻害用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞(MV)の使用であって、微小胞の起源である幹細胞が、内皮前駆細胞(EPC)、間葉系幹細胞(MSC)、腎前駆細胞CD133 + 、成人ヒト肝臓幹細胞(HLSC)およびそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、使用。
- 医薬が化学療法において投与される、請求項1の使用。
- 医薬が癌の化学療法において投与される、請求項2の使用。
- 医薬が化学療法の副作用を低減するために投与される、請求項1または2の使用。
- 細胞増殖抑制剤が、パクリタキセル、レナリドマイド、ポマリドマイド、エピルビシン、5FU、スニチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、レナリドマイド/デキサメタゾン、ポマリドマイド/デキサメタゾン、カルボプラチン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、ドセタキセル、ビノレルビンおよびそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、請求項1〜4の何れかの使用。
- 医薬が、静脈内輸液による投与に適した投与形態である、請求項1〜5の何れかの使用。
- 医薬が、30〜120μg/kg体重の微小胞の投与に適した投与形態である、請求項1〜6の何れかの使用。
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