JP5719171B2

JP5719171B2 - 内皮細胞移植、特に膵島移植による糖尿病の処置におけるアジュバント活性を有する医薬を調製するための微小胞（ｍｖ）の使用、および関連方法

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Publication number: JP5719171B2
Application number: JP2010529508A
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Inventors: ヴィンセンツォ・カンタルッピ; マリア・キアラ・アミルデ・デレジブス; ジョヴァンニ・カムッシ
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Description

本発明は、概して、内皮細胞−膵島移植の分野の範囲内にあり、特に膵島移植によるＩ型およびＩＩ型糖尿病の治療的処置に関する。

近年、膵島移植は、ラパマイシンに基づくグルココルチコイドを用いない免疫抑制レジュメ導入後に、およびその分離技術の改善後に、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の処置に対する注目の治療選択肢となってきた（１−３）。しかしながら、いまだに大きなパーセンテージで、移植された膵島は、門脈内投与後の肝臓への移植片生着に失敗し、結果として、代謝上の利益を得るのに十分な量の膵島を確保するため、複数の提供者からの膵臓が必要である。
この手順の成功を高めるために、移植された膵島の機能および生存を増強できる因子を特定する必要があろう。

１．Shapiro AM, Lakey JR, Ryan EA et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 2000; 343: 230−238. ２．Biancone L, Ricordi C. Pancreatic islet transplantation: An update. Cell Transplant 2002; 11: 309−311. ３．Ricordi C, Lacy PE, Scharp DW. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes 1989; 38(Suppl 1): 140−142.

内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、膵島損傷に応答して膵臓に動員されることが知られており、また、ＥＰＣに媒介される膵臓の新血管形成により、損傷を受けたβ細胞の回復が促進され、膵島の同種移植の機能を改善しうることもまた知られている（４，５）。しかしながら、細胞移植におけるＥＰＣの使用は、幹細胞ゆえの潜在的な腫瘍形成の危険性を考慮すると、妥当ではない。

本発明において、内皮細胞系の細胞、好ましくは内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞（ＭＶ）が、膵島移植によるＩ型およびＩＩ型糖尿病の治療におけるアジュバント因子として、丸ごとの幹細胞に勝る有利な代替手段を示すことが今回見出された。

本明細書で用いられる表現「内皮細胞系の細胞に由来する微小胞（ＭＶ）」は、細胞外膜との融合の際に、少なくとも一部が内皮細胞系の細胞のエンドソーム区画から得られる膜形成性の粒子（membranaceous particle）を意味する。
内皮細胞系の細胞、好ましくはＥＰＣに由来する微小胞は、概して形は球形であり、直径は１００ｎｍから５μｍの範囲にあり、より典型的には約１μｍである。その粒子の形が球状でない場合、上記の値はその粒子の最も長い方向の大きさを意味する。

表現「内皮細胞系の細胞」は、成熟した機能性の内皮細胞に分化できる骨髄由来の一般的な造血前駆細胞から得られる細胞を意味する（６）。
内皮細胞系の細胞、例えばＥＰＣは、密度勾配遠心分離（density centrifugation）により末梢血から都合よく分離され、内皮細胞増殖因子が補充されたＥＢＭ−２（内皮細胞基本培地（endothelial basal medium））などの培地に撒かれる（２００７年３月２９日にオンラインで予め公開された、Deregibus M Cら、Blood. 1 Oct 2007；110(7):2440-8）。次いで、微小胞（ＭＶ）は、Deregibus, 2007記載のように超遠心分離により、および本明細書の実施例のように、分離されたＥＰＣの上清から得ることができる。

次いで、単離されたＭＶは、非常に低温、典型的には−８０℃で、１個または複数の凍結防止剤を含む懸濁液にて冷凍することで使用するまで保存できる。好ましい凍結防止剤は、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびグリセロールがある。細胞懸濁液容量の１０％濃度のＤＭＳＯの使用は、細胞のよりよい保存および再注入される患者における限定的な毒性効果をもたらす。言及されうる別の物質は、細胞外凍結防止剤、すなわち細胞表面で作用し細胞内の脱水を軽減する強固な障壁を形成する高分子量の物質である。ヒドロキシエチルスターチ（Hydroxyethylic starch）が一例として言及されうる。

ＥＰＣ由来のＭＶは、本発明者らにより、試験管内（インビトロ）および生体内（インビボ）、ＳＣＩＤマウスにおける皮下膵島移植の実験モデルの両方で試験された。ＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞とＢ細胞を産生できず、結果として、感染に対抗することおよび移植された組織を拒絶することができない。

本明細書の実施例でさらに詳細に記載され、本発明者らにより実施された実験は、ＥＰＣ由来のＭＶが内皮細胞−膵島移植者に、特に膵島移植者に投与された場合に、それらが移植された内皮細胞の生存および機能を改善するという点で、移植のアジュバント因子として作用することを示した。より詳細には、本発明者らは、ＭＶが内皮細胞による血管形成および毛細管様構造物の形成、ならびに膵島β細胞からのインスリン分泌および内皮細胞の応答、アポトーシス耐性および遊走を促進できることを観察した。最も重要なことに、上記ＭＶのアジュバント効果は、膵島移植の基本的な免疫抑制剤であるラパマイシンの治療用量を用いたインキュベーションによっては完全に阻害されない。このことは、ラパマイシンが、膵島内皮細胞において、血管形成阻害だけでなくリンパ球接着および活性化に関与する受容体のダウンレギュレーションを通じた同時の免疫調節効果の誘導を示すという２重の効果を発揮することが知られていたため（７）、非常に驚くべきことであった。

従って、本発明の１つの態様は、内皮細胞移植におけるアジュバント活性を有する医薬を調製するための、内皮細胞系の細胞、好ましく内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞（ＭＶ）の使用である。
本発明の他の態様において、膵島移植によるＩ型またはＩＩ型糖尿病処置におけるアジュバント活性を有する医薬を調製するための、内皮細胞系の細胞、好ましくは内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞（ＭＶ）の使用である。

実施例で実際に示されるように、微小胞のアジュバント活性は、移植された膵島および内皮細胞の生存および機能の改善である。
さらに、上記のようにＭＶのアジュバント活性は、免疫抑制剤としてのラパマイシンの治療用量の投与により無効とされない。結果として、本発明に用いられるＭＶは、ラパマイシンと併用されうる膵島移植の枠組みの範囲内で、アジュバント試薬として用いられる。表現「併用」は、ＭＶとラパマイシンが一緒に混合されていることを必ずしも必要とする意味でもなく、それらが必ず同時に投与されなければならないことを意味するものでもない。表現「併用」は、単純に、ＭＶが膵島移植者に投与されることを意味し、該受容者が、移植前におよび／またはその間におよび／またはその後にラパマイシンに基づく免疫抑制を受ける工程を少なくとも１回含む膵島移植の手順の枠組みの範囲内で、好ましくは膵島自体と一緒に、そして一般的には静脈内注射により投与されることを意味する。この内容において、ラパマイシンは、概して、ヒト膵島移植後の最初の週に１２ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌのレベルで膵臓に到達するように用いられる（１）。

上記のように、ＭＶは静脈内注射により投与されてもよいし、概して、ＭＶは膵島と一緒に投与される。門脈は、好ましい注射部位である。膵島は、典型的には、受容者に注射される前にＭＶとともにあらかじめインキュベートされる。投与されるべき好ましいＭＶの用量は、多くの要因に依存するが、概して、ヒトに対しては受容者の体重１Ｋｇあたり０．１μｇ〜１０μｇの間にあり、好ましくは受容者の体重１Ｋｇあたり１μｇ〜５μｇを含む。

本発明の他の態様は、内皮細胞系の細胞、好ましくは内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞（ＭＶ）をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む、内皮細胞移植の方法である。好ましくは、対象はヒトである。ＭＶ投与の結果得られる主な利点は、移植された内皮細胞の生存および機能が改善されることである。

本発明のさらなる別の態様は、内皮細胞系の細胞、好ましくは内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞（ＭＶ）を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む、膵島移植によりＩ型およびＩＩ型糖尿病を処置する方法である。好ましくは、対象はヒトである。ＭＶ投与の結果得られる主な利点は、膵島のβ細胞によるインスリン産生が改善されること、および膵島の生着が向上されることである。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を膵島移植により処置するために、膵島は受容者の肝臓に移植される。
以下の実施例は、単なる例示として提供される。

図１は、ＥＰＣ由来のＭＶによる、膵島でのカスパーゼ３活性の変化を示す。図２は、ＥＰＣ由来のＭＶ存在下または非存在下での、ＳＣＩＤマウスにおける膵島異種移植片の総数および領域の計数を示す。図３は、ＩＥＣにおける試験管内での血管形成のＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な効果およびＭＶ誘導性の血管形成におけるラパマイシンの効果を示す。図４は、ＩＥＣにおけるＥＰＣ由来のＭＶの増大する用量により誘導される用量依存的な増殖効果を示す。図５は、無血清条件下で培養されたＩＥＣのＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な遊走効果、およびラパマイシンのＭＶ誘導性の運動性における効果を示す。図６は、無血清条件下で培養されたＩＥＣにおけるＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な抗アポトーシス効果、およびＭＶ誘導性のアポトーシスからの救出におけるラパマイシンの効果を示す。図７は、ＥＰＣ由来のＭＶによる、ＩＥＣにおける遺伝子アレイ分析の結果を示す。

（材料および方法）
ヒト膵島および内皮細胞の分離
不十分な膵島量のために移植使用から除かれる新しい純化ヒト膵島の１０個の異なる調製物を、リカルディ（Ricordi）法（３）に従って調製した。純化膵島（＞９０％純度）は、５ｍｇ／ｍＬのアルブミン（Kedrion Spa, Lucca, Italy）および２ｍＭのグルタミン（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）を含むＣＭＲＬ培地（Mediatech Inc., Herndon, VA）中で培養した。

ヒト膵島内皮細胞系（ＩＥＣ）は、以下のように調製した。簡単には、膵島から出現する（outgrowing）細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ処理により取り出し、ＳＶ４０−Ｔラージ抗原遺伝子を含む４ｍｇのｐＢＲ３２２プラスミドベクターを用い、エレクトロポレーターＩＩ（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）にて４ｍｍのエレクトロポレーションキュベット中、２５０ｍＶおよび９６０ｍＦにてトランスフェクトした。クローンは、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８耐性について選択され、内皮細胞マーカーの免疫蛍光およびＦＡＣＳ発現についてスクリーニングされた。陽性クローンは、限界希釈法によりさらにサブクローニングされ、１０％ＦＣＳ（Hyclone, Logan, Utah）、２ｍＭのグルタミン（GIBCO BRL）および内皮細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦおよび０．５Ｕ／ｍＬのヘパリン）を含むＲＰＭＩ（Sigma）中で培養された。

ヒト内皮前駆細胞の分離
ヒト内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、健康な提供者のＰＢＭＣから密度勾配遠心分離により分離された。純化細胞は、５％ＦＣＳおよび内皮細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬｎＰＤＧＦおよび０．５Ｕ／ｍＬのヘパリン）が補充された培地中、フィブロネクチン被覆された培養フラスコに撒かれ、既報のように（８）、特性評価された。５回〜１０回継代したＥＰＣを本研究に用いた。

ＥＰＣからの微小胞（ＭＶ）の分離および特性評価
ＭＶは、既報のように（Deregibusら、Blood, 2007）、ＥＰＣの上清から得た。簡単には、残骸を取り除くために２，０００ｇにて２０分間遠心分離した後、細胞を含まない上清を１００，０００ｇ（Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifuge）にて１時間、４℃で遠心分離し、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（Sigma-Aldrich）を含む無血清培地１９９で洗浄し、同じ条件で２回目の超遠心分離にかけた。選択実験では、ＥＰＣ由来のＭＶを、赤色蛍光性の脂肪族の発色団ＰＫＨ２６色素（Sigma Aldrich）を用いて標識化した。標識化後、ＭＶを、新たに１００，０００ｇにて１時間、４℃の超遠心分離により洗浄した。ＭＶペレットを、培地１９９中に再懸濁し、蛋白質含有量はブラッドフォード法（BioRad, Hercules, CA, USA）により定量した。ＭＶ特性評価は、既報のように（Deregibus et al., Blood, 2007）、マイクロアレイ、ＦＡＣＳ分析、走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡により実施した。ＭＶは、使用するまで−８０℃で保存した。

ヒト膵島およびＩＥＣにおけるＥＰＣ由来のＭＶのインターナライゼーション
ヒト膵島（５００ＩＥＱ）は、赤色蛍光色素ＰＫＨ２６（Sigma）を用いて標識化された１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来のＭＶ存在下で、回転（Rotary）細胞培養システムにて６時間培養された。ＭＶインターナライゼーション（内部移行）は、共焦点顕微鏡により評価した（Deregibusら、Blood, 2007）。ＩＥＣは、ビヒクルのみの存在下または１０μｇ／ｍｌの標識化ＥＰＣ由来のＭＶ存在下の２４ウェルプレートにて培養した。選択実験では、αｖβ３−インテグリン（BioLegend）、α４−インテグリン、α５−インテグリン（Chemicon Int.）、ＣＤ２９（Becton Dickinson Biosciences）またはＬ−セレクチン（Pharmingen）に対する１０μg／ｍｌのブロッキング抗体を、ＭＶ刺激されたＩＥＣに添加した。ＩＥＣにおけるＭＶインターナライゼーションは、共焦点顕微鏡およびＦＡＣＳ分析により評価した。

インスリン分泌応答および生存能の評価
膵島機能は、ＥＬＩＳＡインスリン分泌応答（ALPCO Windham, NH）により評価した。簡単には、膵島は、２．８ｍＭのグルコース培地中での予め１時間のインキュベーションに続いて、２５ｍＭのグルコース培地中で２時間のインキュベーションによりインキュベートした。刺激の指標は、波長５９０nmの光の分光光度プレートリーダーを用いて、高グルコース培地存在下でのインスリン分泌（ｍU／L／ＩＥＱ）と平均の基礎的なインスリン分泌レベルとの比を計算した。膵島の生存能は、０．４６μＭのフルオロセインジアセタートおよび１４．３４μＭのヨウ化プロピジウム（両方ともSigma Aldrich, St. Louis, MOから得た）を用いて二重染色することによって評価した。

カスパーゼ３ＥＬＩＳＡ
カスパーゼ３の活性は、ｐ−ＮＡ（発色団のｐ−ニトロアニリド）の分光光度による検出に基づくＥＬＩＳＡ（Chemicon, Temecula, CA）により評価され、ｐ−ＮＡはカスパーゼにより認識される標識化基質、ＤＥＶＤ−ｐＮＡから切り出される。膵島溶解物を、適当な反応緩衝液を用いて希釈し、ＤＥＶＤ−ｐＮＡを終濃度５０Ｍで加えた。試料は、波長４０５ｎｍの自動ＥＬＩＳＡリーダーにて分析した。各実験は、３重にて実施した。

新しい純化膵島からの内皮細胞の出現
新しい純化膵島（５００ＩＥＱ）を、組織培養皿に撒き、ＥＰＣ由来のＭＶの存在下または非存在下にて通常の培地を用いてインキュベートした。選択実験では、ラパマイシンの治療用量（１０ｎｇ／ｍｌ）をＥＰＣ由来のＭＶに加えた。内皮細胞増殖因子を含む培地を、細胞出現の陽性対照として用いた。膵島からの内皮細胞の出現は、生細胞解析のためのニコン（Nikon）顕微鏡システム下で研究した。同じ実験手順を、５個の異なる新しい純化膵島調製物において実施した。

ＩＥＣ遊走
ＩＥＣを、プレートに撒き、１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩを用いて１２時間維持し、続いて、種々の刺激物とともにインキュベートした。細胞の遊走は、上記のニコンシステムにて１０×の位相差対物レンズを用いて研究した。正味の遊走速度（直線速度（velocity straight line））は、出発地点と到着地点の間の直線距離を観察時間で割ることに基づくマイクロイメージ（MicroImage）ソフトウェアにより計算された。各実験ポイントあたり少なくとも３０細胞の遊走が分析された。

ＩＥＣ生死判別アッセイ
ＩＥＣを、細胞密度５×１０^４細胞／ウェルで２４ウェルプレート（Falcon Labware, Oxnard, CA）にて培養し、ＦＣＳを用いずに１２時間欠乏させ、次いで、増大する用量のＥＰＣ由来のＭＶ（１〜５０μｇ／ｍｌ）を用いて、２５０μｇ／ｍＬのＸＴＴ（Sigma Aldrich）を含むフェノールレッド不含培地にて培養した。選択実験では、ラパマイシンの治療用量（１０ｎｇ／ｍｌ）をＥＰＣ由来のＭＶに加えた。ＥＰＣ由来のＭＶは含まないが内皮細胞増殖因子を含む培地を、陽性対照として用いた。吸光度は、４５０ｎｍの波長にて決定された。全ての実験は、３重にて実施された。

ＩＥＣアポトーシスの検出
ＩＥＣは、ＦＣＳを用いず１２時間の欠乏の後、続いてＥＰＣ由来のＭＶの存在下または非存在下で４８時間のインキュベーションの後に、ＴＵＮＥＬアッセイ（ターミナル・デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識化）（ApopTag, Oncor, Gaithersburg, MD）にかけた。選択実験では、ラパマイシンの治療用量（１０ｎｇ／ｍｌ）をＥＰＣ由来のＭＶに加えた。インキュベーション後に、細胞を１％パラホルムアルデヒドにて固定化し、予め冷却したエタノール−酢酸２：１にてさらに固定化し、加湿チャンバにてＴｄＴ酵素とともに３７℃で１時間インキュベートし、抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣ抗体を用いて、およびヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ）を用いて対比染色を行った。試料は、適当なマウント培地を用いてＵＶ光顕微鏡にて分析した。緑色染色されたアポトーシス細胞を、別の顕微視野（倍率×１００）にて計数した。

試験管内での血管形成アッセイ
試験管内での毛細管様構造物の形成は、氷中での冷却ＤＭＥＭ（Sigma Aldrich）と１：１希釈された増殖因子低減マトリゲル（growth factor-reduced Matrigel）（Becton Dickinson, Bedford, MA）に播種された５００ＩＥＱヒト膵島またはＩＥＣ−ＧＦＰ（５×１０^４細胞／ウェル）で研究した。細胞は１０×／０．２５ＮＡ対物レンズを備えたニコン倒立顕微鏡にて観察され、実験結果は様々な刺激物質を用いた３７℃での６時間のインキュベート後に記録した。画像分析は、マイクロイメージ分析システム（Casti Imaging）により１時間間隔で行った。結果は、毛細管様構造物／視野（倍率×１００）の３回の別個の実験の平均値±ＳＤにより与えられる。

ＳＣＩＤマウスの異種移植
マトリゲルプラグ（Matrigel plug）における膵島またはＩＥＣ−ＧＦＰの皮下（ｓ．ｃ．）移植が、生体内でのＥＰＣ由来のＭＶの血管形成の効果を評価するために行われた。簡単には、マトリゲルを使用するまで−２０℃で維持し、移植直前に４℃にて一晩解凍した。新しい純化膵島（２０００ＩＥＱ）またはＩＥＱ−ＧＦＰ（１０^４細胞）を、ＦＣＳを含まない新鮮な培地２５０μＬに再懸濁し、冷却したピペットチップを用いて、１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来のＭＶを含まないまたは含むマトリゲル５００μＬに混合し、ＳＣＩＤマウスの首筋（the scruff region of the neck）にｓ．ｃ．移植した。２週間後に、マウスを犠牲にし、マトリゲルプラグを、後述のように組織学および免疫組織化学のために回収した。各実験群につき６匹の動物で実験した。

遺伝子アレイ技術
血管形成マーカーの研究のためのヒトＧＥアレイ（GEarray）キット（SuperArray Inc., Bethesda, MD）を用いて、ビヒクルのみを用いてまたは１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来のＭＶを用いて４８時間インキュベートしたＩＥＣの遺伝子発現プロファイルを特性評価した。ハイブリダイゼーションは、製造業者の説明書に従って実施した。

免疫蛍光研究
様々な実験条件にてチャンバースライド中で培養された新しい純化ヒト膵島またはＩＥＣを、１％パラホルムアルデヒドを用いて固定化し、要すれば０．１％トライトンＸ１００（Sigma）を用いて透過処理し、ポリクローナル・ラビット抗ヒトインスリン抗体を用いて、または以下の内皮細胞抗原に対する抗体；抗ヒトＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、抗ヒトｔｉｅ−２および抗ヒトＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）（すべてSanta-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAから得た）、マウスモノクローナル抗ヒトＶＥＧＦ（US Biological, Swampscott, MA）、マウスモノクローナル抗ヒトαＶβ３−インテグリン（Chemicon International, Temecula, CA）、ラビットポリクローナル抗ヒトフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）またはアレキサフルオロ（Alexa Fluor）コンジュゲートアセチル化ＬＤＬに対する抗体（すべてInvitrogen, Carlsbad, CAから得た）を用いて、１時間染色した。すべての試料は、適当なアレキサフルオロ・コンジュゲート二次抗体（Invitrogen）を用いて３０分間インキュベートした。ヒト膵島を含むマトリゲルインプラント（Matrigel implant）を、ホルムアルデヒドにて固定化し、染色前にパラフィン中に包埋した。すべての試料を、１ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを用いて、または０．５ｍｇ／ｍＬのヘキスト（Hoechst）を用いて対比染色し、アンチフェード・マウンティング培地（antifade mounting medium）（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いてマウントし、蛍光顕微鏡により試験した。内部の膵島血管再生およびMVインターナライゼーションの評価は、インスリンに対するおよび上記の内皮細胞マーカーに対する同時染色後に、共焦点顕微鏡（Leica TCS SP2 Heidelberg, Germany）により行った。マイクロイメージ・ソフトウェアを用いて、膵島内に新生された血管の数／切片および全領域／切片を決定した。

ＦＡＣＳ分析
刺激していないまたは刺激したＩＥＣを、ＥＤＴＡを用いて組織培養プレートから剥がし、４５分間４℃でＦＩＴＣ−、ＰＥ−コンジュゲート抗体または赤色蛍光標識ＥＰＣ由来のＭＶを用いて染色した。次いで、細胞を、１％パラホルムアルデヒドにて固定化し、ＦＡＣＳ分析（Becton Dickinson, Mountain View, CA）にかけた。

ウェスタンブロット分析
さまざまな実験条件で培養されたＩＥＣを、溶解緩衝液（１％トライトンＸ−１００、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび１００ユニット／ｍｌのアプロチニンを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）中にて４℃で１時間溶解した。ブラッドフォード法により決定され、３０μｇのタンパク質を含むその細胞溶解液の一部を、還元条件下で４％〜１５％のグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜フィルターにエレクトロブロットした。以下の一次抗体；Ａｋｔに対するモノクローナル抗体（Upstate, Charlottesville, VI, USA）、ホスホ−Ａｋｔおよびホスホ−ｅＮＯＳラビットポリクローナル抗体（Cell Signalling, Beverly, MA, USA）、アクチンに対するマウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗Ｂｃｌ−ｘＬおよびｅＮＯＳに対するラビットポリクローナル抗体（Santa Cruz）を用いた。

ＩＥＣ単層に対するリンパ球の接着
ＰＢＭＣは、健常ボランティアから密度勾配遠心分離（density gradient）により分離し、製造者の説明書に従い、ＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳ中、１０μｍのＶｙｂｒａｎｔセルトラッカー・キット（Invitrogen）を用いて一晩標識化した。標識化された細胞を計数し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ中に５０×１０^６／ｍＬに再懸濁し、６ウェルプレート上のＩＥＣのコンフルエント単層に加え、ビヒクル単独または炎症性サイトカイン（１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−アルファおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマ）とともに、１０μｇ／ｍＬのＥＰＣ由来のＭＶの存在下または非存在下でインキュベートした。実験は、穏やかに攪拌する条件下で、１時間３７℃にて３重で行われた。インキュベーションの終わりに、プレートを培地で満たし、結合していない細胞を取り除くため３回吸引した。すべての試料を、１％パラホルムアルデヒドを用いて固定化し、蛍光顕微鏡により観察した。緑色蛍光の細胞を、倍率×２００倍で異なる１０の視野で計数した。

統計分析
種々の実験手順のデータはすべて、平均値±ＳＤで表される。統計分析は、スチューデントｔ検定もしくは適宜、ニューマン・クールズ（Newmann-Keuls）の多重比較検定を用いるＡＮＯＶＡにより実施した。

（結果）
ＥＰＣ由来のＭＶの特性評価
走査電子顕微鏡およびＦＡＣＳ分析は、ＥＰＣ上清の超遠心分離により得られたペレット中に球状のＭＶの存在を示した。ＥＰＣ由来のＭＶの大部分は、大きさが約１μｍであり、通常ＥＰＣ表面に見られる幾つかの分子、例えば細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、α４インテグリン、ＣＤ２９（β１インテグリン）およびＣＤ４４を発現していた。さらに、我々はまた、ＥＰＣ由来のＭＶの表面上に、損傷組織へのＥＰＣのホーミングに必須のタンパク質であるＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）の存在も見出した。

ＥＰＣ由来のＭＶは膵島から内皮細胞の出現を誘導した
ビヒクル単独でのインキュベーションと比較して、１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来のＭＶは、膵島表面から２４時間後に検出可能なおよび９６時間後により明白な細胞の出現（outgrowth）を誘導した。膵島から出現した細胞は、典型的な内皮細胞マーカー、例えば、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）、フォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand Factor）、ＣＤ１０５およびネスチンを用いた特異的な免疫染色により、内皮細胞と特徴づけられた。さらに、出現した細胞は、アセチル化ＬＤＬをインターナライズ（内部移行）する能力と、マトリゲル被覆プレート上に播種された場合に毛細管様構造物を形成する能力とを示した。

ラパマイシンは、ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導される膵島からの内皮細胞の出現を無効にしなかった
我々が以前に報告したように（７）、ラパマイシンの治療用量（１０ｎｇ／ｍｌ）は、内皮細胞増殖因子に富む培地を用いた膵島のインキュベーションにより誘導される内皮細胞の出現を無効にした。対照的に、同じラパマイシン用量では、ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導される内皮細胞の出現は完全に阻止することができず、このことは、この血管形成過程に増殖因子による刺激以外の機序の関与を示唆する。

ＥＰＣ由来のＭＶは、インスリン分泌を増強し、膵島の生存能を保ち、そしてカスパーゼ３の活性を低下させた
高グルコースチャレンジ後のインスリン応答で評価される膵島機能は、培養の２日後および７日後のビヒクル単独に対し、ＥＰＣ由来のＭＶ存在下において有意に高かった。加えて、フルオロセインジアセタートおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色は、ＥＰＣ由来のＭＶ存在下で維持された膵島の生存を証明した。ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導される膵島アポトーシスの阻害は、ＥＰＣ由来のＭＶとのインキュベーションの２日後および７日後に膵島溶解液中で観察されるカスパーゼ３活性の有意な低下によりさらに確認された（図１）。

ＥＰＣ由来のＭＶは、β細胞および膵島内皮細胞にインターナライズされる
ヒト膵島におけるＥＰＣ由来のＭＶのインターナライゼーション（内部移行）は、赤色蛍光色素であるＰＫＨ２６を用いてＭＶを染色した後に評価された。共焦点顕微鏡分析により、標識ＭＶの存在が、インスリン、ＧＬＵＴ−２あるいは内皮細胞マーカーであるＣＤ３１、ＫＤＲおよびフォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand Factor）を用いた同時染色で検出され、β細胞および膵島内皮細胞の両方でその存在が示された。加えて、ＥＰＣ由来のＭＶはまた、共焦点顕微鏡写真およびＦＡＣＳ分析により示されるように、３７℃で３０分間のインキュベーション後に別系統の膵島由来の内皮細胞（ＩＥＣ）にも取り込まれた。ＭＶインターナライゼーションに関与する選択的な分子の役割を特定するため、ＥＰＣ由来のＭＶを種々のブロッキング抗体とともに１５分間４℃で予めインキュベートした。これまでに別の内皮細胞系について報告されているように、膵島内皮細胞でもまた、α４インテグリン、ＣＤ２９、加えてＬ−セレクチンの存在が標的細胞へのＭＶのインターナライゼーションに必須である。

ＥＰＣ由来のＭＶは、ＳＣＩＤマウス内のマトリゲルプラグ中の皮下移植されたヒト膵島の血管新成を増大する
膵島の血管新生におけるＥＰＣ由来のＭＶの効果は、マトリゲルプラグ内の新しい純化膵島を既報（７）の異種移植モデルのＳＣＩＤマウスの首筋に皮下注射した後に、生体内で評価した。ＥＰＣ由来のＭＶ存在下で、移植片は、膵島内にヘマトキシリン−エオシン染色により、および内皮細胞マーカーであるＫＤＲおよびＣＤ３１の免疫組織化学分析により検出される血管密度の顕著な増加を示した。ＥＰＣ由来のＭＶにより処理された膵島はまた、インスリンのびまん性の染色（diffuse staining）を示した。加えて、マトリゲル区画内に新生された血管の総数および領域の評価は、ＥＰＣ由来のＭＶを用いて刺激された膵島での血管形成の有意な増加を裏付けた。図２は、ＥＰＣ由来のＭＶ存在下または非存在下での、ＳＣＩＤマウスにおける膵島異種移植片の総数および領域（μｍ^２／区画として表される）の計数を示す。

ＥＰＣ由来のＭＶは、試験管内および生体内でのＩＥＣ−ＧＦＰ血管形成を増強する
我々は、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターにより形質導入されたＩＥＣ（ＩＥＣ−ＧＦＰ）において、ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導される試験管内での血管形成の変化を評価した。マトリゲルで被覆された表面に播種された場合、ＩＥＣ−ＧＦＰは自発的に毛細管様の構造物を形成した。ＥＰＣ由来のＭＶの添加は、血管新生過程を促進し、その結果、用量依存的に促進される組織だった毛細血管網の形成を導いた。ラパマイシン（１０ｎｇ／ｍｌ）は、ＥＰＣ由来のＭＶの血管新生の効果を完全に無効にしなかった。図３は、得られた結果、すなわちＩＥＣにおける試験管内での血管形成のＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な効果およびＭＶ誘導性の血管形成におけるラパマイシンの効果を示す（ＥｎｄｏＧＦ＝内皮細胞増殖因子に富む培地）。

次いで、我々は、上記のように、ＳＣＩＤマウスの首筋に注射することによりＩＥＣ−ＧＦＰの異種移植を行った。試験管内での血管形成の結果と一致して、ＩＥＣはＥＰＣ由来のＭＶ存在下で組織学的分析および免疫蛍光分析により検出される増殖能および新血管の形成能において顕著な増大を示した。さらに、ＥＰＣ由来のＭＶは、試験されたマトリゲル区画内の血管の総数および領域に著しい増大を誘導した。

ＥＰＣ由来のＭＶは、増殖効果、抗アポトーシス効果および遊走効果をＩＥＣに与える
我々は、膵島内皮細胞生育におけるＥＰＣ由来のＭＶの効果を評価した。ＩＥＣを、ＦＣＳを用いずに一晩欠乏させ、続いて、増大する用量のＥＰＣ由来のＭＶとともにインキュベートした。ＥＰＣ由来のＭＶは、ＩＥＣ増殖において顕著な用量依存的な増大を誘導した。この増殖効果は、１μｇ／ｍＬの用量で検出可能であり、また５０μｇ／ｍＬの用量でプラトーに達した。加えて、我々は、ＥＰＣ由来のＭＶを用いてチャレンジしたＩＥＣが、血清の欠乏によって誘導されるアポトーシスに対して増強された耐性を示すことを見出した。ＩＥＣにおいてＥＰＣ由来のＭＶにより与えられたこの抗アポトーシス効果は、１０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンを用いた同時インキュベーションによっては完全に無効とされなかった。図４は、ＩＥＣにおけるＥＰＣ由来のＭＶの増大する用量により誘導される用量依存的な増殖効果を示す。

次いで、内皮細胞活性化の指標であるＩＥＣ遊走におけるＥＰＣ由来のＭＶの効果を、顕微鏡のコマ撮り（タイムラプス）で記録し、研究した。静止細胞（resting cell）の自発的な運動性に対応するＩＥＣの基準となる遊走速度は、観察の全期間にわたって安定を保ちし、５〜６ｍ／時間を越えないことが見出された。ＥＰＣ由来のＭＶは、自発的な細胞の運動性に有意な用量依存的増大をもたらした。アポトーシスのデータと一致して、１０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンは、ＩＥＣ遊走の活性を完全にブロックしなかった。図５は、無血清条件下で培養されたＩＥＣのＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な遊走効果、およびラパマイシンのＭＶ誘導性の運動性における効果を示す（ＥｎｄｏＧＦ＝内皮細胞増殖因子に富む培地）。

図６は、無血清条件下で培養されたＩＥＣにおけるＥＰＣ由来のＭＶの用量依存的な抗アポトーシス効果、およびＭＶ誘導性のアポトーシスからの救出におけるラパマイシンの効果を示す（ＥｎｄｏＧＦ＝内皮細胞増殖因子に富む培地）。

ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導されるＩＥＣ血管形成に関与する経路
我々は、ＩＥＣにおける遺伝子レベルとタンパク質レベルの両方、ならびにＥＰＣ由来のＭＶとのインキュベーション後の血管形成に関与する分子の発現変化を調べた。ＥＰＣ由来のＭＶを用いて刺激されたＩＥＣにおける遺伝子アレイ分析は、内皮細胞分化関連因子（Endothelial Differentiation-related Factor-1（ＥＤＦ−１））、チロシンキナーゼ受容体のエフリン、他のさまざまな増殖因子受容体（ＦＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＴＧＦβ−Ｒ）、血管新生促進性のインテグリン（pro-angiogenic integrin）（α５およびβ３）およびマトリックス分子（フィブロネクチン−１）、特異的な内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）およびｅＮＯＳの、増強された発現を明らかにした（図７）。加えて、ＥＰＣ由来のＭＶを用いて刺激されたＩＥＣは、抗血管形成因子トロンボスポンジン−１のダウンレギュレーションを示した。免疫蛍光分析またはウェスタンブロット分析により、我々は、ＥＰＣ由来のＭＶが、血管形成および細胞の生存に関与する膵島内皮細胞の分子、例えばＡｋｔ／Ｐ−Ａｋｔ、Ｂｃｌ−ｘＬおよびｅＮＯＳをモジュレートすることを確認した。

ｈＩＥＣに対するリンパ球の接着
我々は、内皮細胞−リンパ球相互作用におけるＥＰＣ由来のＭＶの役割を評価した。１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来のＭＶの添加は、穏やかな攪拌条件下でのＩＥＣ単層に対する自発的なリンパ球接着を有意に阻害した。リンパ球接着の阻害は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−アルファおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−ガンマと一緒にＩＥＣ単層をインキュベートした後に得られる炎症促進性の微環境のもとで特に明白となった。

（議論）
本研究において、我々は、ＥＰＣ由来のＭＶが、試験管内で、およびＳＣＩＤマウスへのマトリゲルプラグにおける皮下の膵島移植の実験モデルで、血管形成およびインスリン分泌を促進することを実際に示した。加えて、ＥＰＣ由来のＭＶは、膵島由来の内皮細胞系の試験管内での増殖、アポトーシス耐性、遊走、毛細管様構造物の形成および生体内での血管形成をもたらす。

我々はまた、ＥＰＣ由来のＭＶが、β細胞と膵島内皮細胞の両方にインターナライズされ、インスリン分泌および生じうるパラクリン作用を通じた試験管内での血管形成がもたらされることを実際に示した。さらに、ＥＰＣ由来のＭＶは、ＳＣＩＤマウスの首筋にマトリゲルプラグにて異種移植した新しい純化ヒト膵島において、新たに形成される血管の総数および面積の有意な増加を引き起こす。これらの結果は、ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導される直接的な膵島内皮細胞での血管形成の活性化を示唆する。加えて、膵島内皮細胞およびβ細胞におけるＥＰＣ由来のＭＶのインターナライゼーションは、有害な分離および培養条件において生存を維持できる、両方の細胞型からのパラクリン因子のさらなる放出を促進しうる。

ＭＶ取り込みは、特定の細胞膜タンパク質、例えばα４、ＣＤ２９およびＬ−セレクチンにより媒介される。白血球生物学では、種々の接着受容体は、ローリングを通じてそれらの内皮細胞との相互作用を調節し、それに続く炎症部位への移動を調節する。セレクチン受容体ファミリーは、血管接着の初期事象の鍵となる重要な役割を果たす。我々は、最近、ＥＰＣがＬ−セレクチンをその表面に発現すること、およびこの分子が血管損傷部位へのＥＰＣのホーミングに必須であることを実際に示した。本研究で、我々は、ＥＰＣ由来のＭＶもまた、虚血−再灌流損傷に曝された組織において通常はアップレギュレートされるフコシル化残基または別のオリゴ糖リガンドと結合するため、Ｌセレクチン媒介型の機構を介して標的細胞中にインターナライズすることを示す。

我々はまた、ＥＰＣ由来のＭＶが、膵島内皮細胞系の試験管内増殖、血清欠乏により誘導されるアポトーシスに対する耐性、遊走、および膵島からの内皮細胞の出現を増強することを見出した。興味深いことに、ラパマイシンの治療用量は、培地に加えられた可溶性の増殖因子によりＩＥＣに与えられる栄養作用を完全に阻害するのに対し、この薬剤の同じ用量との同時インキュベーションによっては、ＥＰＣ由来のＭＶにより誘導されるこれらの生物学的現象はすべて完全には無効にされない。これらの結果は、ＥＰＣ由来のＭＶと膵島内皮細胞との間をｍＲＮＡが水平移行することを推定させる示唆であり、このことは、ＲＮａｓｅを用いてＥＰＣ由来のＭＶをあらかじめインキュベートした後では、ＭＶにより誘導されるＩＥＣでの効果が有意に阻害されることによって確認される。加えて、血管形成に関与する分子の遺伝子アレイ解析は、ＥＰＣ由来のＭＶによりもたらされる増大した発現のｍＲＮＡ、例えばＢｃｌ−ｘＬおよびｅＮＯＳを示した。ＥＰＣ由来のＭＶは、ＩＥＣにおけるＰ１３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路およびｅＮＯＳの活性化を引き起こす。

ＥＰＣ由来のＭＶはまた、ＩＥＣにおけるエフリンおよびＥＤＦ−１のアップレギュレーションを誘導する。エフリンおよびその関連するチロシンキナーゼ受容体は、血管壁集合の間の細胞の運動性および接着に深く関与し、内皮細胞の走化性およびブランチングのリモデリング（branching remodeling）を誘導する。ファージディスプレイおよびレーザー顕微解剖により、エフリンファミリーのメンバーおよびそれらの受容体が、膵島内皮細胞に認められた（９）。ＥＤＦ−１は、分化、静止（quiescence）、老化を受けるヒト内皮細胞においてダウンレギュレーションされる低分子量のポリペプチドである。我々の発見は、ＥＰＣ由来のＭＶが、ＩＥＣにおける分化および増殖プログラムを活性化することを示唆する。加えて、ビヒクル単独と比較して、ＥＰＣ由来のＭＶで刺激されたＩＥＣは、内皮細胞のアポトーシスを阻害すること、およびトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）のダウンレギュレーションを阻害することが知られている分子であるＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）の増大したレベルを示す。ＴＳＰ−１は、血管形成の阻害剤であり、活性型の内皮細胞のアポトーシスも促進する。我々は、最近、ＩＥＣにおいて、ＴＳＰ−１がラパマイシンに応答してアップレギュレートされることを見出した。さらに、ＴＳＰ−１ノックアウトマウスは、増大した血管密度により特徴付けられる膵島過形成を示すことが示された（１０）。

本研究の結果得られる別の知見は、ＥＰＣ由来のＭＶ存在下では、リンパ球がＩＥＣ単層に対して低下した接着特性を示すことである。膵島内皮細胞は、移植された膵島の再血管新生だけでなく、同種免疫および自己免疫に関係する機構においても鍵となる重要な役割を果たす。実際、免疫応答の活性化は、膵島移植片の消失の他の重要な原因である。ＩＥＣは、β細胞により分泌されるインスリンを捕捉できる抗原提示細胞であり、かくして、移植された繊細な膵島に活性型のＴリンパ球をホーミングするという特異性に寄与することが以前示された。我々は、他の細胞型に由来するエキソソームとは対照的に、ＥＰＣ由来のＭＶはその表面にＭＨＣ抗原を提示していないことを見出した。この発見は、ＩＥＣ単層に対するリンパ球の有意な低下と併せて考えると、移植された膵島における異種免疫および自己免疫のきっかけとなる引き金を制限しうるＥＰＣ由来のＭＶによる抗炎症作用が生じる可能性を示唆する。

結論として、我々の研究の結果は、膵島とＥＰＣとの間のキメラ現象（chimerism）が、細胞表面からの活性型ＭＶの放出によって媒介されるパラクリン機構を通じた膵島におけるβ細胞の機能および血管新生を促進することを実際に示す。ＥＰＣ由来のＭＶの血管形成の特性は、臨床での膵島移植に通常用いられるラパマイシン用量が存在しても、得られた。末梢血からのＥＰＣの容易な採取は、それらが、移植後の膵島の再灌流を改善するにあたっての潜在的な治療選択肢であることを示す。さらに、このβ細胞の機能による治療アプローチの代謝上の利益を調べるため、さらなる実験が必要とされることがあっても、ＥＰＣ由来のＭＶの使用は、丸ごとの細胞の注入により生じる有害な効果を伴わない、血管新生の機構における一時的で限定的な転換を提供しうる。

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Claims

膵島移植によるＩ型およびＩＩ型糖尿病の処置においてインスリン産生を増大させるための医薬を調製するための、内皮前駆細胞に由来する微小胞の使用。
医薬が、静脈内注射による投与に適している、請求項１記載の使用。
医薬が、受容者の体重１Ｋｇあたり０．１μｇ〜１０μｇを含む微小胞の用量を投与するのに適している、請求項１または２のいずれか一項記載の使用。
膵島移植手順が、受容者が、移植前におよび／またはその間におよび／またはその後にラパマイシンに基づく免疫抑制を受ける工程を少なくとも一回含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。