CN111808804A - 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体通过对传代培养获得的脐带间充质干细胞进行超速离心提取和纯化得到，相较于现有外泌体提取方法，能够在较短时间内获得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体。该方法操作简单、易于实现，具有广泛的应用前景。

Description

一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法
技术领域
本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。
近年来研究发现，干细胞在培养过程中能够向培养基中分泌包含有多种生物活性物质的外泌体。外泌体是一种直径在30-150nm的双层囊泡结构，作为机体内细胞间的信号传递物质，外泌体中包含有microRNA、信号蛋白、活性肽和细胞因子等多种生物活性物质。且有大量研究表明，干细胞外泌体拥有良好的免疫调节和组织修复等功能，在治疗烧伤、慢性阻塞性肺疾病、呼吸系统损伤以及抗衰老等多种疾病方面具有极高的临床价值。
目前外泌体的制备方法存在提取效率不高、所获得的外泌体纯度过低以及在提取过程中损伤外泌体自身结构等弊端，严重影响了外泌体的临床应用和产业化发展。有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，以解决现有外泌体的制备方法存在的提取效率不高、所获得的外泌体纯度过低以及在提取过程中损伤外泌体自身结构等问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
培养：将P1-P10代脐带间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后收集上清液，离心去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；
提取：使用0.22μm无菌过滤膜对所述包含外泌体的溶液进行过滤，所得滤液在0-20℃，50000-200000g离心30-90min，弃上清；
纯化：用无菌PBS重悬，得到外泌体悬液，加入纯化液，颠倒混匀，0-20℃静置2-24h，在0-20℃，2000-10000g离心0.5-4h，所得沉淀即为外泌体。
进一步地，所述干细胞培养基为无动物源成分培养基。作为优选，本发明实施例的干细胞培养基的的组成如下：无水氯化钙100-300mg/L、九水合硝酸铁0.03-0.2mg/L、氯化钾200-500mg/L、无水硫酸镁50-150mg/L、氯化钠5000-7200mg/L、无水磷酸二氢钠75-165mg/L、L-盐酸精氨酸65-105mg/L、L-盐酸胱氨酸42-86mg/L、L-谷氨酰胺320-760mg/L、甘氨酸14-32mg/L、L-盐酸组氨酸30-54mg/L、L-异亮氨酸75-165mg/L、L-亮氨酸80-125mg/L、L-盐酸赖氨酸120-165mg/L、L-甲硫氨酸12-48mg/L、L-苯丙氨酸30-80mg/L、L-丝氨酸25-62mg/L、L-苏氨酸72-125mg/L、L-色氨酸8-22.5mg/L、L-酪氨酸钠盐75-162mg/L、L-缬氨酸80-160mg/L、D-泛酸钙0.5-6.5mg/L、氯化胆碱2.5-8mg/L、叶酸2.5-6.5mg/L、肌醇4.2-8.6mg/L、烟酰胺3-7.5mg/L、核黄素0.2-1.2mg/L、盐酸硫胺1.6-5.8mg/L、盐酸吡哆辛2.4-6mg/L、葡萄糖2000-8500mg/L、丙酮酸钠80-135mg/L、亚硒酸钠0.01-0.03mg/L、胰岛素10-45mg/L、总细胞因子含量2-80mg/L。
进一步地，所述离心去除细胞碎片的步骤包括：在0-20℃，800-1200g离心25min，取上清液，在相同条件下再次离心30min，保留上清液，即为包含外泌体的溶液。
进一步地，所述纯化液通过以下方法获得：将15-30g聚乙二醇和3-10g氯化钠添加到80ml超纯水中，溶解混匀，定容至100ml。
进一步地，纯化步骤中，所述无菌PBS和纯化液在使用前，进行0-20℃预冷处理；所述外泌体悬液和纯化液的体积比为1：0.25-4。
进一步地，所述P1-P10代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：
(1)将脐带快速置于脐带保存液中；
(2)脐带纵向剖开，剔除脐带内的动静脉血管，将所得华通氏胶剪成组织匀浆块，滤网过滤；
(3)将过滤得到的组织匀浆块平铺于细胞培养皿，置于细胞培养箱孵育；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，向细胞培养皿中加入干细胞培养基，置于细胞培养箱内培养；
(5)24-48小时后，弃去原有培养基，更换为新鲜培养基；
(6)待细胞培养皿中贴壁细胞铺满60-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，得到P0代细胞；
(7)所得P0代细胞进行传代，传至P1-P10代时收获细胞；
(8)对收获的细胞进行鉴定及检测。
进一步地，步骤(1)中，所述脐带是健康、足月、行剖宫产的初产妇在胎儿娩出后结扎的人脐带；所述脐带保存液的组成如下：在PBS溶液的基础上，添加1％青霉素钠和1％硫酸链霉素。
进一步地，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-2mm3，所述滤网孔径为200目。
进一步地，所述细胞培养箱的条件为3-8％二氧化碳、温度36-39℃、湿度85-100％；所述培养/孵育为静置培养/孵育。
进一步地，步骤(7)中，P0代细胞悬液按1：2-4的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)，待贴壁细胞生长铺满60-90％时，重复步骤(6)的操作，继续进行传代至P1-P10代。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明的脐带间充质干细胞来源的外泌体通过对传代培养获得的脐带间充质干细胞进行超速离心提取和纯化得到，相较于现有外泌体提取方法，能够在较短时间内获得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体。该方法操作简单、易于实现，具有广泛的应用前景。
(2)本发明的纯化步骤中，使用的纯化液能够有效去除高丰度大分子蛋白质，提高所得外泌体的纯度。
(3)本发明通过对脐带间充质干细胞的培养分离方法进行改进，能提高脐带间充质干细胞的数量、活性，进而在一定程度上提高了外泌体的提取率和纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1是本发明实施例1的P0代间充质干细胞显微镜图；
图2是本发明实施例1的P3代间充质干细胞显微镜图；
图3是本发明实施例1的P3代间充质干细胞流式检测结果图；
图4是本发明实施例2制得的外泌体直径分布范围示意图；
图5是本发明实施例2制得的外泌体在扫描电子显微镜下的形态图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管，用手术剪将所得华通氏胶剪成体积为1mm3大小的组织匀浆块，用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(3)将过滤得到的组织匀浆块均匀的铺于10cm细胞培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内1小时；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，轻轻加入适量的干细胞培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(5)24小时后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml干细胞培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度3％，温度36℃，湿度100％)内静置培养；
(6)第5天，细胞培养皿中贴壁细胞铺满约60％时，用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml干细胞培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml干细胞培养基重悬，所得细胞即为原代脐带间充质干细胞(P0)；
(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1：2的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)；
(8)待细胞生长铺满80％时，重复步骤(6)、(7)，继续进行传代至P3代；
(9)待P3代融合度达到85％后将其吸出培养基，更换干细胞培养基培养24h，收集上清液，在15℃，1000g离心25min，取上清液，在相同条件下再次离心30min，保留上清液，得到包含外泌体的溶液；
(10)取上述包含外泌体的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后上述滤液在10℃，120000g离心60min，弃上清；
(11)取1ml温度为15℃的无菌PBS重悬步骤(10)所得沉淀，得到外泌体悬液，加入5ml温度为15℃的纯化液(纯化液的制备方法：将聚乙二醇15g和氯化钠5g，加入80ml超纯水中溶解，定容至100ml)中，颠倒混匀，15℃静置纯化4小时，所得混合液在15℃，2000g离心0.5h，所得沉淀即为外泌体。
实施例2
本实施例的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)无菌采集脐带：选取健康、足月、行剖宫产的初产妇，经产妇及家属同意后，在手术室无菌环境下，取整条脐带并快速置于含1％双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在超净台内，用无菌PBS反复冲洗脐带，纵向剖开脐带，剔除脐带内的动静脉血管，用手术剪将所得华通氏胶剪成体积为1mm3大小的组织匀浆块，用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片，获得大小符合要求的脐带组织块；
(3)将过滤得到的组织匀浆块均匀的铺于10cm细胞培养皿中，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内2小时；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，轻轻加入适量的干细胞培养基，放置于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(5)48小时后显微镜观察细胞贴壁情况，贴壁良好。轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，去除组织残渣和细胞碎片。并加入10ml干细胞培养基，于恒温培养箱(二氧化碳浓度5％，温度37℃，湿度90％)内静置培养；
(6)第7天，培养皿中贴壁细胞铺满约80％，用1ml的0.25％的重组胰蛋白酶消化3分钟，显微镜下观察见胞质回缩、细胞开始脱落漂起，此时加入10ml干细胞培养基终止消化，用10ml移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清，并用10ml干细胞培养基重悬。所得细胞即为原代脐带间充质干细胞(P0)；
(7)所得原代脐带间充质干细胞悬液按1：4的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)；
(8)待细胞生长铺满75％时，重复步骤(6)、(7)，继续进行传代至P5代；
(9)待P5代融合度达到80％后将其吸出培养基，更换干细胞培养基培养24h，收集上清液，离心去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；
(10)取上述包含外泌体的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后上述滤液在10℃，100000g离心90min，弃上清；
(11)取2.5ml温度为10℃无菌PBS重悬步骤(10)所得沉淀，得到外泌体悬液，加入10ml温度为10℃纯化液(纯化液的制备方法：将聚乙二醇18g和氯化钠3g，加入80ml超纯水中溶解，定容至100ml)中，颠倒混匀，10℃静置纯化4小时，所得混合液在10℃，8000g离心3h，弃上清液，所得沉淀即为外泌体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
培养：将P1-P10代脐带间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后收集上清液，离心去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；
提取：使用0.22μm无菌过滤膜对所述包含外泌体的溶液进行过滤，所得滤液在0-20℃，50000-200000g离心30-90min，弃上清；
纯化：用无菌PBS重悬，得到外泌体悬液，加入纯化液，颠倒混匀，0-20℃静置2-24h后，在0-20℃，2000-10000g离心0.5-4h，所得沉淀即为外泌体。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述干细胞培养基为无动物源成分培养基。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述离心去除细胞碎片的步骤包括：在0-20℃，800-1200g离心25min，取上清液，在相同条件下再次离心30min，保留上清液，即为包含外泌体的溶液。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述纯化液通过以下方法获得：将15-30g聚乙二醇和3-10g氯化钠添加到80ml超纯水中，溶解混匀，定容至100ml。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，纯化步骤中，所述无菌PBS和纯化液在使用前，进行0-20℃预冷处理；所述外泌体悬液和纯化液的体积比为1：0.25-4。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述P1-P10代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：
(1)将脐带快速置于脐带保存液中；
(2)脐带纵向剖开，剔除脐带内的动静脉血管，将所得华通氏胶剪成组织匀浆块，滤网过滤；
(3)将过滤得到的组织匀浆块平铺于细胞培养皿，置于细胞培养箱孵育；
(4)待组织匀浆块贴壁牢固后，向细胞培养皿中加入干细胞培养基，置于细胞培养箱内培养；
(5)24-48小时后，弃去原有培养基，更换为新鲜培养基；
(6)待细胞培养皿中贴壁细胞铺满60-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化，得到P0代细胞；
(7)所得P0代细胞进行传代，传至P1-P10代时收获细胞；
(8)对收获的细胞进行鉴定及检测。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脐带是健康、足月、行剖宫产的初产妇在胎儿娩出后结扎的人脐带；所述脐带保存液的组成如下：在PBS溶液的基础上，添加1％青霉素钠和1％硫酸链霉素。
8.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述组织匀浆块体积为1-2mm3，所述滤网孔径为200目。
9.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述细胞培养箱的条件为3-8％二氧化碳、温度36-39℃、湿度85-100％；所述培养/孵育为静置培养/孵育。
10.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，P0代细胞悬液按1：2-4的比例进行传代接种培养，所得细胞记为第一代(P1)，待贴壁细胞生长铺满60-90％时，重复步骤(6)的操作，继续进行传代至P1-P10代。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113040133A (zh) * 2021-03-22 2021-06-29 北京贝来药业有限公司 作为干细胞来源的脐带/胎盘组织采集试剂盒及方法
CN114591901A (zh) * 2022-03-24 2022-06-07 和携科技有限公司 动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法
WO2022204955A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Shenzhen ChuangSheng XinKe Biotechnology Co., Ltd. Method for preparation of exosomes from ipscs and its derivatives for any clinical use thereof
WO2022242189A1 (zh) * 2021-05-20 2022-11-24 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 干细胞来源的外泌体在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用
CN116445401A (zh) * 2023-06-14 2023-07-18 成都康景生物科技有限公司 间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法
CN118109401A (zh) * 2024-03-25 2024-05-31 东莞市第八人民医院（东莞市儿童医院） 一种脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170296626A1 (en) * 2014-09-05 2017-10-19 Exerkine Corporation Exosome isolation
CN108624557A (zh) * 2018-05-31 2018-10-09 章毅 间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN109112110A (zh) * 2018-09-10 2019-01-01 刘波 一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法
CN110179826A (zh) * 2019-05-29 2019-08-30 武汉五州润达生物医药科技有限公司 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
CN111346051A (zh) * 2020-03-19 2020-06-30 瑞太干细胞中心(沈阳)有限公司 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170296626A1 (en) * 2014-09-05 2017-10-19 Exerkine Corporation Exosome isolation
CN108624557A (zh) * 2018-05-31 2018-10-09 章毅 间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN109112110A (zh) * 2018-09-10 2019-01-01 刘波 一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法
CN110179826A (zh) * 2019-05-29 2019-08-30 武汉五州润达生物医药科技有限公司 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
CN111346051A (zh) * 2020-03-19 2020-06-30 瑞太干细胞中心(沈阳)有限公司 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郭莹;王秀伟;牛玉虎;王莉;周楠;李佰一;王振东;张;高亚杰;牛勃;: "人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较" *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113040133A (zh) * 2021-03-22 2021-06-29 北京贝来药业有限公司 作为干细胞来源的脐带/胎盘组织采集试剂盒及方法
WO2022204955A1 (en) * 2021-03-30 2022-10-06 Shenzhen ChuangSheng XinKe Biotechnology Co., Ltd. Method for preparation of exosomes from ipscs and its derivatives for any clinical use thereof
WO2022242189A1 (zh) * 2021-05-20 2022-11-24 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 干细胞来源的外泌体在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用
CN114591901A (zh) * 2022-03-24 2022-06-07 和携科技有限公司 动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法
CN114591901B (zh) * 2022-03-24 2023-11-24 和携科技有限公司 动物脐带间充质干细胞外泌体提取方法
CN116445401A (zh) * 2023-06-14 2023-07-18 成都康景生物科技有限公司 间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法
CN116445401B (zh) * 2023-06-14 2023-08-22 成都康景生物科技有限公司 间充质干细胞培养基、干细胞外泌体及制备方法
CN118109401A (zh) * 2024-03-25 2024-05-31 东莞市第八人民医院（东莞市儿童医院） 一种脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

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