CN109112110A - 一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法 - Google Patents

一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法，间充质干细胞外泌体制备方法包括：制备间充质干细胞培养基上清液，提取上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。由于使用电转染的方式将目标miRNA负载于间充质干细胞外泌体中，明显提高了外泌体治疗的针对性，加快皮肤伤口的修复；采用先提取间充质干细胞外泌体后电转染的制备步骤，提高了转染的效率，缩短整体制备时间，易控制miRNA用量，提升转染质量；敷料采用负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体结合水凝胶在伤口局部以涂层的方式给药，提高了外泌体及miRNA的利用率，同时将外泌体与水凝胶分开保存，有利于含外泌体敷料的长期保存和长途运输。

Description

一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其 制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一组源于基质的异质细胞群，具有自我更新、多向分化潜能，其在组织修复、免疫调节方面有较为显著的能力和广阔前景。间充质干细胞来源广泛，易于获得，可在脂肪、骨髓、牙髓、脐带、脐带血、经血、尿液、角膜等组织中获得。
外泌体(exosome)为微小囊泡，直径约为30-140nm，是在生理或病理情况下由多种细胞内膜以出芽方式形成的多泡体，参与细胞间的信息交流，并参与到多种生理病理过程中。来源于不同组织的外泌体本身携带有多种MicroRNA(miRNA)、mRNA、lncRNA、蛋白质、脂质分子等物质，在组织修复过程中，外泌体所负载的生物大分子可以促进控制炎症、促进参与修复的细胞增殖、迁移、促进血管化及再上皮化等。然而，由于其外泌体负载的非特异性，往往促进修复的作用不甚显著。
通过生物工程改造外泌体的负载，使之能根据伤口修复的状态负载特异性的促修复因子，则可以明显提高其促进修复的作用。
但是在现有技术中，外泌体的miRNA负载效果并不理想，仍然存在效率低、过程难控制的缺陷。
同时，外泌体的给药途径中局部给药不仅可以提高利用率，还可避免有创性给药，提高患者依从性，故构建含外泌体敷料十分有必要。然而既往的含外泌体敷料制备技术是将外泌体与原料混合后再交联制备敷料。这种方法弊端其一会使有生物活性的外泌体破裂而导致作用大大下降；其二外泌体在敷料中无法迁移，其释放率相当有限，造成珍贵外泌体的大量浪费；其三，外泌体与水凝胶的保存条件不同，这种混合敷料无法长期保存和长途运输，十分不利于临床转化与推广。
发明内容
为解决上述问题，本申请提供一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法，该间充质干细胞外泌体的制备方法具有强度高的特点，同时具有提高目标miRNA的负载效率和质量的优点。
根据第一方面，一种实施例中提供一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤:
制备间充质干细胞培养基上清液,提取上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。
进一步地，具体步骤包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
进一步地，其具体步骤包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后按照1:2比例进行接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到70-80％时，使用PBS洗涤3次，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出S11中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS重悬并再次在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用1ml电转染缓冲液重悬间充质干细胞外泌体，通过NTA检测间充质干细胞外泌体浓度并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，100000-120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
进一步地，目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种；miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129的序列分别如SEQIDNO:1-12。
进一步地，间充质干细胞包括脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、脐带血干细胞、牙髓干细胞、经血干细胞、尿液来源干细胞中的至少一种。
根据第二方面，一种实施例中提供由第一方面所述制备方法制备得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体。
根据第三方面，一种实施例中提供一种敷料，包括用于涂布于伤口表面的外泌体悬液以及用于涂布在外泌体悬液表面的水凝胶，外泌体悬液与水凝胶分别保存，外泌体悬液是由第一方面所述制备方法得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体形成的外泌体悬液；
目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种，序列分别如SEQIDNO:1-12。
根据第四方面，一种如上述敷料的制备方法，步骤包括：
制备外泌体悬液：从间充质干细胞培养基上清液中提取间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，从而得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，保存于-80℃备用；
制备水凝胶：在无菌条件下，高分子材料与交联剂产生交联，得到水凝胶，采用冷冻干燥将水凝胶冻干至体积减半，并于无菌条件下常温保存备用，使用前将其置于复发氯化钠注射液中浸泡至质量稳定。
进一步地，交联剂为乙二胺、二亚胺、戊二醛、钙离子或糖胺聚糖中的至少一种；
高分子材料包括藻酸盐、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉、PEG/PLGA中的至少一种。
进一步地，外泌体悬液的制备方法包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
依据上述实施例的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法：
1、使用电转染的方式将目标miRNA负载于间充质干细胞外泌体中，相对于无负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体而言特异性较强，有利于实现精准治疗；
2、采用先提取间充质干细胞外泌体后电转染的制备步骤，提高了转染的效率，缩短整体制备时间，且相对现有方法而言易控制miRNA用量，提升转染质量；
3、敷料采用负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体结合水凝胶在伤口局部以涂层的方式给药，提高了外泌体及miRNA的利用率，同时将外泌体与水凝胶分开保存，有利于含外泌体敷料的长期保存和长途运输。
附图说明
图1为本发明一种实施例中负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体制备流程示意图。
图2为电转染后间充质干细胞外泌体负载miRNA的表达量变化示意图。
图3为脂肪干细胞外泌体及藻酸盐水凝胶递送miRNA21促进2型糖尿病大鼠皮肤伤口愈合率示意图。
图4为小鼠再生皮肤病理切片HE染色图。
图5为小鼠再生皮肤病理切片masson染色图。
图6为脐带干细胞外泌体及藻酸盐水凝胶递送miRNA148促进2型糖尿病大鼠皮肤伤口愈合率示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
说明书中方法描述的各步骤也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。
本发明的发明思路主要在于优化负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，采用先提取间充质干细胞外泌体后电转染的制备步骤，提高了转染的效率，也便于控制miRNA的用量。同时，提供一种含有负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的敷料，使用间充质干细胞外泌体与水凝胶相结合的伤口表面涂层形式给药方案，优化了给药途径，在保证精准治疗的同时，水凝胶保证了间充质干细胞外泌体的生物活性，避免其大量破裂；将间充质干细胞外泌体与水凝胶分别保存，不仅能够使得两种材料分别处于最佳保存条件，而且还能解决长期保存和长途运输的问题。
本发明一实施例提供一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：制备间充质干细胞培养基上清液，提取上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。
在其中一具体实施例中，其具体步骤包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后按照1:2比例接种于培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，在一些具体实施例中，融合度为60％、65％、70、75％或80％等，使用PBS洗涤3次以去除残留血清成分，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集约40ml培养基上清液于-80℃保存备用。其中，间充质干细胞包括脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、脐带血干细胞、牙髓干细胞、经血干细胞、尿液来源干细胞中的至少一种。
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出S11中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS重悬并再次在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体。间充质干细胞外泌体是由干细胞分泌形成，作为细胞间通讯的生物膜性微囊泡，与其他载体相比具有无毒性、体内停留时间长、靶向性等优点。
S13、电转染目标miRNA：用1ml电转染缓冲液重悬间充质干细胞外泌体，通过NTA检测间充质干细胞外泌体的浓度，并调整其浓度，直至得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染。转染条件以及外泌体浓度、miRNA溶液浓度等，均根据间充质干细胞的种类和目标miRNA的种类决定。如选择脂肪干细胞和miRNA21时，外泌体悬液浓度为1×109/ml-1×1012particles/ml，miRNA溶液浓度为200uM-400uM，外泌体悬液与RNA溶液等体积混合，转染条件为：500V、20ms、1次电击。电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，100000-120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS重悬，得到导入了目标miRNA的间充质干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
其中，目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种；miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129的序列分别如SEQIDNO:1-12。本发明利用电转染人工改造间充质干细胞外泌体，使其负载天然促修复分子外，还可装载入不同的人工合成的miRNA mimic，实现对伤口修复不同的阶段进行特异性的调节，提高伤口修复效率。例如在伤口修复的炎症期转入miR21、miR146a、miR155、miR132等控制过度炎症反应；在增殖阶段转入miR21、miR31、miR29a、miR29b、miR210、miR132、miR148等调节细胞增殖及细胞外基质的形成；在伤口修复重塑期转入miR29a、miR29b、miR29c、miR192、miR129促进伤口组织重塑，减少瘢痕形成。相对于现有的先转染后提取外泌体的工艺而言，本实施例的制备方法可缩短制备工艺时间，并且能够解决目标miRNA与间充质干细胞外泌体的结合率，大大提高了负载目标miRNA的成功效率，并且能够较好地控制目标miRNA的用量。
在本实施例中，提供一种由上述制备方法制备得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体。
在本实施例中，提供一种敷料，该敷料可在糖尿病状态下或非糖尿病状态下的皮肤、肌肉、跟腱、骨质缺损、胃肠道等机体组织损伤后的修复。
该敷料包括用于涂布于伤口表面的外泌体悬液以及用于涂布在外泌体悬液表面的水凝胶，外泌体悬液与水凝胶分别保存，外泌体悬液在4℃或-20℃或-80℃及液氮条件下保存，水凝胶在常温或4℃条件下保存，使用时首先在伤口表面涂布外泌体悬液，再将水凝胶涂布于外泌体悬液表面。外泌体悬液是由上述制备方法得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体形成的外泌体悬液。
目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种，序列分别如SEQIDNO:1-12。miRNA的选择根据伤口修复的不同阶段而定。
采用将间充质干细胞外泌体形成的外泌体悬液与水凝胶分离保存，具有以下优点：
1、节约外泌体、提高外泌体应用效率。使用前分离保存，在使用时运用涂层覆盖的方法涂布于伤口表面，大大地减少了以往在交联制备水凝胶外泌体混合敷料过程中的外泌体破裂，并且使所有的外泌体均能直接达到伤口表面，实现最大程度的利用；
2、解决了长期保存和长途运输困难问题，外泌体悬液在4℃或-20℃或-80℃及液氮条件下保存，而水凝胶在常温或4℃条件下保存，避免以往直接制备成混合敷料情况下低温保存改变水凝胶性质，高温保存外泌体悬液失去生物活性的问题。
3、降低成本，该保存方法不仅可降低珍贵外泌体失活带来的高额成本浪费，还可以减少因伤口换药而带来的含外泌体敷料的损失。
4、工艺简单，稳定性好，重复性强，可规模化生产。
在本实施例中，提供一种上述敷料的制备方法，步骤包括：
S1、制备外泌体悬液：从间充质干细胞培养基上清液中提取间充质干细胞外泌体，电转染间充质干细胞外泌体，从而得到导入了目标miRNA的间充质干细胞外泌体悬液，保存于-80℃备用。具体步骤如下：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，在一些具体实施例中，融合度为60％、65％、70、75％或80％等，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的RNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的间充质干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
S2、制备水凝胶：在无菌条件下，高分子材料与交联剂产生交联，得到水凝胶，采用冷冻干燥将水凝胶冻干至体积减半，并于无菌条件下常温保存备用，使用前将其置于复发氯化钠注射液中浸泡至质量稳定。其中，交联剂为乙二胺、二亚胺、戊二醛、钙离子或糖胺聚糖中的至少一种；高分子材料包括藻酸盐、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉、PEG/PLGA中的至少一种。
实施例一
在本实施例中，提供一种负载miRNA21的脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S101、制备脂肪干细胞培养基上清液：将3代的脂肪干细胞(购于广东省赛莱拉干细胞公司)胰酶消化后按照1:2比例接种于培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基(购于GIBICO公司)，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80％时，使用PBS磷酸缓冲溶液(pH7.4，Sigma)洗涤3次以去除残留血清成分，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集约40ml培养基上清液于-80℃保存备用。
S102、提取间脂肪干细胞外泌体：取出S101中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS磷酸缓冲溶液重悬并再次在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到脂肪干细胞外泌体。
S103、电转染miRNA21：用1ml电转染缓冲液(购于Thermofisher)重悬脂肪干细胞外泌体，通过NTA检测间脂肪干细胞外泌体的浓度，并调整其浓度，直至得到浓度为1×1012particles/ml的外泌体悬液，同时用无核酶水将hsa-miR21-5p mimic(购于广州市锐博生物科技有限公司)溶解配制成200uM-400uM的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液等体积混合，用电转染仪(购于Transfection System，Thermofisher)进行转染，转染条件为：500V、20ms、1次电击。电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS磷酸缓冲溶液重悬，得到导入了目标miRNA的脂肪干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
在本实施例中，提供一种由上述制备方法制备得到的负载miRNA21的脂肪干细胞外泌体。
对照组
一种脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
制备脂肪干细胞培养基上清液：将3代的脂肪干细胞(购于广东省赛莱拉干细胞公司)胰酶消化后按照1:2比例接种于培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80％时，使用PBS磷酸缓冲溶液(pH7.4，Sigma)洗涤3次以去除残留血清成分，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集约40ml培养基上清液于-80℃保存备用。加入miRNA21溶液，在37℃的条件下孵育适当时间，如72h。
提取脂肪干细胞外泌体：取出上述培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS磷酸缓冲溶液重悬并再次在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到脂肪干细胞外泌体。
实验一：检测脂肪干细胞外泌体中hsa-miR21-5p的表达水平
将实施例一得到的负载miRNA21的脂肪干细胞外泌体与对照组(T0)得到的脂肪干细胞外泌体进行qRT-PCR检测，结果如图2，实施例一得到的负载miRNA21的脂肪干细胞外泌体在图2中为Electroporation组，对照组为control组。从图2中可看出，Electroporation组中，hsa-miR21-5p的表达量较control组而言增加了约24-32倍，说明使用本发明的制备方法负载目标miRNA可提高miRNA的表达量，特异性强，有利于针对性治疗。
实施例二
在本实施例中，提供一种敷料，该敷料包括用于涂布于伤口表面的外泌体悬液以及用于涂布在外泌体悬液表面的水凝胶，外泌体悬液与水凝胶分别保存，外泌体悬液在4℃或-20℃或-80℃及液氮条件下保存，水凝胶在常温或4℃条件下保存，使用时首先在伤口表面涂布外泌体悬液，再将水凝胶涂布于外泌体悬液表面。外泌体悬液是由实施例一的制备方法得到的负载目标miRNA21的脂肪干细胞外泌体形成的外泌体悬液。
在本实施例中，提供一种上述敷料的制备方法，步骤包括：
S21、制备外泌体悬液：从脂肪干细胞培养基上清液中提取脂肪干细胞外泌体，电转染脂肪干细胞外泌体，从而得到导入了miRNA21的干细胞外泌体悬液，保存于-80℃备用。具体步骤如下：
S211、制备脂肪干细胞培养基上清液：将3代的脂肪干细胞(购于广东省赛莱拉干细胞公司)胰酶消化后按照1:2比例接种于培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基(购于GIBICO公司)，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80％时，使用PBS磷酸缓冲溶液(pH7.4，Sigma)洗涤3次以去除残留血清成分，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集约40ml培养基上清液于-80℃保存备用。
S212、提取间脂肪干细胞外泌体：取出S211中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS磷酸缓冲溶液重悬并再次在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到脂肪干细胞外泌体。
S213、电转染miRNA21：用1ml电转染缓冲液(购于Thermofisher)重悬脂肪干细胞外泌体，通过NTA检测间脂肪干细胞外泌体的浓度，并调整其浓度，直至得到浓度为1×1012particles/ml的外泌体悬液，同时用无核酶水将hsa-miR21-5p mimic(购于广州市锐博生物科技有限公司)溶解配制成200uM-400uM的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液等体积混合，用电转染仪(购于Transfection System，Thermofisher)进行转染，转染条件为：500V、20ms、1次电击。电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS磷酸缓冲溶液重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
S22、制备水凝胶：在无菌条件下，称量12.5g海藻酸钠干粉，倒入1L蒸馏水中混合并搅拌1小时至溶解，得到溶解液；在溶解液中加入5％氯化钙溶液500ml，在室温下保持48h以形成凝胶，除去多余的氯化钙溶液后，将海藻酸钠水凝胶样品在-20℃放置过夜，在冻干机下干燥至体积减半，并于无菌条件下常温保存水凝胶。
实验二：建立高脂饮食及佐链脲菌素联合诱导的2型糖尿病大鼠背部皮肤缺损模型
1、实验步骤
高脂饲料(购于广东省动物实验中心)喂养4周龄SD大鼠(SPF级，购于广东省动物实验中心)4周后，禁食不禁水12小时，给予腹腔注射40mg/kg剂量的佐链脲菌素(STZ，Sigma)，监测大鼠尾静脉血空腹血糖值>7.1mmol/L，在其他实施例中也可检测随机血糖值>11.1mmol/L，持续稳定一周后，戊巴比妥钠(Sigma)80mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，于背部切除直径1cm的圆形皮肤，构建皮肤缺损模型，模型构建完成后随机分为4组，每组6只。
实验组(T1)：本实验组使用的是实施例二中的敷料(exo+miR21-hydrogel)。将S22中所制备的水凝胶在室温、无菌条件下置于复发氯化钠注射液(购于大冢制药)中浸泡充分吸水2小时备用；取S21中制备的外泌体悬液溶解后取100ul，均匀涂抹于伤口表面，使伤口表面外泌体浓度为1×1011/cm2-2×1011/cm2，然后将充分吸水2小时后的藻酸盐水凝胶涂抹于伤口表面，充分覆盖。
对照组二(T2)：本对照组使用未经电转染处理的天然脂肪干细胞外泌体+水凝胶(exo-hydrogel)，制备方法除无须经过S213外，其余步骤同S21和S22。
对照组三(T3)：本对照组使用水凝胶敷料(hydrogel)，制备方法同S22。
空白对照组(Control)：本对照组不对小鼠皮肤伤口做任何处理。
每72h分别更换一次敷料，并测量伤口直径，观察伤口愈合情况。
2、实验结果
观察2周，小鼠伤口愈合情况如图3和表1所示。与空白对照组相比，在各个检测时间点内，涂布T1-T3组敷料的小鼠，其伤口直径均小于空白对照组，愈合速度均较空白对照组加快，且加载了miR21的T1组有更显著加快伤口愈合的效果，时间越长，T1的愈合效果越明显，其初期的炎症反应也显著减轻。
表1动物实验数据表
如图4所示，HE染色显示T1组伤口部位的角质细胞增殖、迁移更快，伤口再上皮化明显加快。如图5所示，小鼠皮肤伤口及周围组织的massion染色显示T1组小鼠新生皮肤组织的胶原纤维含量明显增加。说明T1组中小鼠皮肤修复较其他组明显加快，进一步说明了使用本发明所述制备方法得到的加载了miRNA21的间充质干细胞外泌体比天然的间充质干细胞外泌体具有更好的皮肤伤口修复效果，且其与水凝胶分离保存的方式使得在给药的时候能够克服混合敷料制备过程中的外泌体破裂等缺陷，在一定程度上提高了负载目标miRNA间充质干细胞外泌体的利用率。
实施例三
在本实施例中，提供一种负载miRNA148的脐带干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
S301、制备脐带干细胞培养基上清液：将3代的脐带干细胞(购于广东省赛莱拉干细胞公司)胰酶消化后按照1:2比例接种于培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基(购于GIBICO公司)，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到80％时，使用PBS磷酸缓冲溶液(pH7.4，Sigma)洗涤3次以去除残留血清成分，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集约40ml培养基上清液于-80℃保存备用。
S302、提取间脐带干细胞外泌体：取出S301中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS磷酸缓冲溶液重悬并再次在4℃、120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体。
S303、电转染miRNA148：用1ml电转染缓冲液(购于Thermofisher)重悬脐带干细胞外泌体，通过NTA检测间脐带干细胞外泌体的浓度，并调整其浓度，直至得到浓度为1×1012particles/ml的外泌体悬液，同时用无核酶水将hsa-miR148-5p mimic(购于广州市锐博生物科技有限公司)溶解配制成200uM-400uM的miRNA溶液，将外泌体悬液与miRNA溶液等体积混合，用电转染仪(购于Transfection System，Thermofisher)进行转染，转染条件为：500V、20ms、1次电击。电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS磷酸缓冲溶液重悬，得到导入了目标miRNA的脐带干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
在本实施例中，提供一种由上述制备方法制备得到的负载miRNA148的间脐带干细胞外泌体。
实施例四
在本实施例中，提供一种敷料，该敷料包括用于涂布于伤口表面的外泌体悬液以及用于涂布在外泌体悬液表面的水凝胶，外泌体悬液与水凝胶分别保存，外泌体悬液在4℃或-20℃或-80℃及液氮条件下保存，水凝胶在常温或4℃条件下保存，使用时首先在伤口表面涂布外泌体悬液，再将水凝胶涂布于外泌体悬液表面。外泌体悬液是由实施例三的制备方法得到的负载目标miRNA148的脐带干细胞外泌体形成的外泌体悬液。
在本实施例中，提供一种上述敷料的制备方法，步骤包括：
S41、制备外泌体悬液：从脐带干细胞培养基上清液中提取脐带干细胞外泌体，电转染脐带干细胞外泌体，从而得到导入了miRNA148的干细胞外泌体悬液，保存于-80℃备用。具体步骤如实施例三。
S42、制备水凝胶：在无菌条件下，称量12.5g海藻酸钠干粉，倒入1L蒸馏水中混合并搅拌1小时至溶解，得到溶解液；在溶解液中加入5％氯化钙溶液500ml，在室温下保持48h以形成凝胶，除去多余的氯化钙溶液后，将海藻酸钠水凝胶样品在-20℃放置过夜，在冻干机下干燥至体积减半，并于无菌条件下常温保存水凝胶。
实验三：利用脐带干细胞外泌体及藻酸盐水凝胶递送miRNA148促进糖尿病大鼠皮肤缺损伤口修复
1、实验步骤
高脂饲料(购于广东省动物实验中心)喂养4周龄SD大鼠(SPF级，购于广东省动物实验中心)4周后，禁食不禁水12小时，给予腹腔注射40mg/kg剂量的佐链脲菌素(STZ，Sigma)，监测大鼠尾静脉血空腹血糖值>7.1mmol/L，在其他实施例中也可检测随机血糖值>11.1mmol/L，持续稳定一周后，戊巴比妥钠(Sigma)80mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，于背部切除直径1cm的圆形皮肤，构建皮肤缺损模型，模型构建完成后随机分为4组，每组6只。
实验组(T4)：本实验组使用的是实施例三中的敷料(exo+miR148-hydrogel)。将S42中所制备的水凝胶在室温、无菌条件下置于复发氯化钠注射液(购于大冢制药)中浸泡充分吸水2小时备用；取S41中制备的外泌体悬液溶解后取100ul，均匀涂抹于伤口表面，使伤口表面外泌体浓度为1×1011/cm2-2×1011/cm2，然后将充分吸水2小时后的藻酸盐水凝胶涂抹于伤口表面，充分覆盖。
对照组四(T5)：本对照组使用未经电转染处理的天然脐带干细胞外泌体+水凝胶(exo-hydrogel)，制备方法除无须经过电转染步骤外，其余步骤同S41和S42。
对照组五(T6)：本对照组使用水凝胶敷料(hydrogel)，制备方法同S42。
空白对照组(Control)：本对照组为无处理组，不对小鼠皮肤伤口做任何处理。
每72h分别更换一次敷料，并测量伤口直径，观察伤口愈合情况。
2、实验结果
观察2周，小鼠伤口愈合情况如图6和表2所示。与空白对照组相比，在各个检测时间点内，涂布T4-T6组敷料的小鼠，其伤口直径均小于空白对照组，愈合速度均较空白对照组加快，且加载了miR148的T4组有更显著加快伤口愈合的效果，时间越长，T4的愈合效果越明显，其初期的炎症反应也显著减轻。
表2动物实验数据表
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
序列表
<110> 刘波
<120> 一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体、应用的敷料及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1080
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
muncsngmsa nsmuncsngm sansugucgg guagcuuauc agacugaugu ugacuguuga 60
aucucauggc aacaccaguc gaugggcugu cugacamsan sccgaugugu auccucagcu 120
uugagaacug aauuccaugg guugugucag ugucagaccu cugaaauuca guucuucagc 180
ugggauaucu cugucaucgu msanscuguu aaugcuaauc gugauagggg uuuuugccuc 240
caacugacuc cuacauauua gcauuaacag msansccgcc cccgcgucuc cagggcaacc 300
guggcuuucg auuguuacug ugggaacugg agguaacagu cuacagccau ggucgccccg 360
cagcacgccc acgcgcmsan sggagaggag gcaagaugcu ggcauagcug uugaacuggg 420
aaccugcuau gccaacauau ugccaucuuu ccmsansaug acugauuucu uuugguguuc 480
agagucaaua uaauuuucua gcaccaucug aaaucgguua umsanscuuc aggaagcugg 540
uuucauaugg ugguuuagau uuaaauagug auugucuagc accauuugaa aucaguguuc 600
uugggggmsa nsaucucuua cacaggcuga ccgauuucuc cugguguuca gagucuguuu 660
uugucuagca ccauuugaaa ucgguuauga uguaggggga msansacccg gcagugccuc 720
caggcgcagg gcagccccug cccaccgcac acugcgcugc cccagaccca cugugcgugu 780
gacagcggcu gaucugugcc ugggcagcgc gacccmsans gaggcaaagu ucugagacac 840
uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucucms ansgccgaga 900
ccgagugcac agggcucuga ccuaugaauu gacagccagu gcucucgucu ccccucuggc 960
ugccaauucc auaggucaca gguauguucg ccucaaugcc agcmsansgg aucuuuuugc 1020
ggucugggcu ugcuguuccu cucaacagua gucaggaagc ccuuacccca aaaaguaucu 1080

Claims (10)

1.一种负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备间充质干细胞培养基上清液，提取所述上清液中的间充质干细胞外泌体，电转染所述间充质干细胞外泌体，使其负载目标miRNA。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出所述S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的所述培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬所述间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将所述外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其具体步骤包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后按照1:2比例进行接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到70-80％时，使用PBS洗涤3次，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出所述S11中的培养基上清液，在4℃或37℃的条件下解冻，以2000rpm的转速离心30min，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的所述培养基上清液在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min后去上清，PBS重悬并再次在4℃、100000-120000rpm的条件下超速离心70min，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用1ml电转染缓冲液重悬所述间充质干细胞外泌体，通过NTA检测所述间充质干细胞外泌体的浓度并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将所述外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复5min，并对其在4℃，100000-120000rpm的条件下超速离心70min，去上清后PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种；所述miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129的序列分别如SEQIDNO:1-12。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、脐带血干细胞、牙髓干细胞、经血干细胞、尿液来源干细胞中的至少一种。
6.一种由权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体。
7.一种敷料，其特征在于，包括用于涂布于伤口表面的外泌体悬液以及用于涂布在所述外泌体悬液表面的水凝胶，所述外泌体悬液与水凝胶分别保存，所述外泌体悬液是由权利要求1所述的制备方法得到的负载目标miRNA的间充质干细胞外泌体形成的外泌体悬液；
所述目标miRNA为miR21、miR146a、miR155、miR132、miR31、miR29a、miR29b、miR29c、miR210、miR148、miR192、miR129中的其中一种，序列分别如SEQIDNO:1-12。
8.一种如权利要求7所述敷料的制备方法，其特征在于，步骤包括：
制备外泌体悬液：从间充质干细胞培养基上清液中提取间充质干细胞外泌体，电转染所述间充质干细胞外泌体，从而得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，保存于-80℃备用；
制备水凝胶：在无菌条件下，高分子材料与交联剂产生交联，得到水凝胶，采用冷冻干燥将所述水凝胶冻干至体积减半，并于无菌条件下常温保存备用，使用前将其置于复发氯化钠注射液中浸泡至质量稳定。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为乙二胺、二亚胺、戊二醛、钙离子或糖胺聚糖中的至少一种；
所述高分子材料包括藻酸盐、透明质酸钠、壳聚糖、羟乙基淀粉、PEG/PLGA中的至少一种。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体悬液的制备方法包括：
S11、制备间充质干细胞培养基上清液：将2-5代的间充质干细胞胰酶消化后接种，培养基为含10％胎牛血清DMEM培养基，接种完成后放置于温度为37℃、CO2体积浓度比为5％的培养箱中培养，当融合度达到60-80％时，使用PBS洗涤，用不含酚红、不含血清的DMEM培养基继续培养48小时，收集培养基上清液-80℃保存备用；
S12、提取间充质干细胞外泌体：取出所述S11中的培养基上清液，解冻离心后，经过0.22um滤膜过滤，用100KDa超滤管浓缩至1/30体积，再将浓缩的培养基上清液超速离心后去上清，PBS重悬并再次超速离心，洗涤外泌体沉淀物，得到间充质干细胞外泌体；
S13、电转染目标miRNA：用电转染缓冲液重悬所述间充质干细胞外泌体，并调整其浓度，得到预定浓度的外泌体悬液，同时用无核酶水将目标miRNA溶解配制成预定浓度的miRNA溶液，将所述外泌体悬液与miRNA溶液混合，用电转染仪器进行转染，电击完成后将外泌体悬液置于37℃下恢复，并对其超速离心、去上清、PBS重悬，得到导入了目标miRNA的干细胞外泌体悬液，调整粒子数为1×1012/ml后保存于-80℃备用。
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