CN110079555A - 一种利用外泌体转染干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用外泌体转染干细胞的方法。本发明采用天然或培养的细胞培养大量的外泌体，通过基因工程技术将需要转染的物质递送至外泌体中。干细胞的胞吞作用将外泌体高效摄入后，使得外源性的分子递送至干细胞内部。具有安全高效的优势。

Description

一种利用外泌体转染干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用外泌体转染干细胞的方法。

背景技术

外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30-150nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。

近年来外泌体作为药物递质，在肿瘤治疗领域也取得了长足的发展。如有科学家通过口服负载了紫杉醇的外泌体，进行肿瘤的治疗。由于外泌体结构的稳定性，使得药物有着较好的稳定性。同时与传统的给药方式相比，有着方便、低毒的优点。利用外泌体装载RNAi靶向药物的研究也表明，外泌体在血液循环系统中的递送效率比脂质体的递送效率要高。

对于许多研究人员来说，干细胞转染是一项重要技术，虽然目前转染方法发展迅速,有很多不同的方案可供选择，但是针对干细胞的转染方法依旧效率很低。这与干细胞本身的特性有关。随着干细胞研究的进展,对更先进的转染技术的需求仍然很大。目前关于干细胞的转染方法，一般采用物理、化学的方法或者利用病毒感染的方式。这些方法要么不可避免的会造成对干细胞本身的损伤，要么会导入新的因素，可能导致未知的风险。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用外泌体转染干细胞的方法，目的是利用外泌体的性质，以及干细胞本身的胞吞作用，对干细胞进行安全高效的转染，不对干细胞本身造成损伤降低风险。

本发明的利用外泌体转染干细胞的方法，按照以下步骤进行：

(1)采用天然或培养的细胞培养外泌体，从大体积的体液中分离外泌体；

(2)采用外泌体的转染试剂处理外泌体，通过基因工程技术将需要转染的物质递送至外泌体中；

(3)干细胞的胞吞作用将外泌体高效摄入后，使得外源性的分子递送至干细胞内部。

其中，所述的从大体积的体液中分离外泌体，按照以下步骤进行：

(1)将大体积的体液中蛋白质成分去除；

(2)通过聚乙二醇等沉淀外泌体。

(3)通过离心的方式分离沉淀的外泌体。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

本发明利用外泌体的性质，以及干细胞本身的胞吞作用，对干细胞不造成损伤，且不会引入新的风险因素。具有操作过程简单快捷，对细胞本身的损伤小，转染效率高等特点。

附图说明

图1是实施例1分离的外泌体电镜图；

图2是实施例1转染后的荧光图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

本实施例的利用外泌体转染干细胞的方法按照以下步骤进行：

1、外泌体的提取

1)巴氏消毒后的低脂牛奶25ml加入等体积的0.25M的EDTA(pH7.0)混匀后冰上放置15分钟。

2)12000×g 4℃离心1小时，取上清，将上清平均分成两管，分别加入12ml外泌体沉淀液，混匀后置于4℃，1小时以上。

3)12000×g 4℃离心1小时，小心弃去上清。用25ml磷酸缓冲液重悬沉淀。

4)将一个新的离心管中加入4ml外泌体纯化液后，小心的将重悬后的磷酸缓冲液加到外泌体纯化液上。

5)12000×g 4℃离心1.5小时，用5ml注射器吸取底部约4ml的外泌体纯化液，转移至一个新的离心管中，并加入45ml磷酸盐缓冲液。

6)12000×g 4℃离心1小时，小心弃去上清。所得沉淀即为外泌体，其电镜图如图1所示。

7)用100ul磷酸盐缓冲液溶解沉淀。

2、外泌体转染诱导的多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)

1)在1.5ml小离心管中配置反应体系

充分混匀，37℃振荡孵育10分钟后，立刻将其置于冰上。

2)加入30ul的ExoQuick-TC试剂终止反应。在冰上继续放置30分钟。

3)12000×g 4℃离心5分钟，小心弃去上层溶液。加入300ul无外泌体的培养基重悬。

4)将6孔板中培养的iPSC细胞用PBS清洗两次后，直接加入300ul外泌体。37℃培养2小时后再加入1ml无外泌体的培养基继续培养24小时。

3、荧光显微镜观察转染效率，如图2所示，通过外泌体能够对干细胞进行高效的转染。

实施例2：

1、培养细胞分泌的外泌体的提取

1)收取培养的iPSC细胞上清液，500×g离心5分钟，将上清液转移至一个新的离心管中；

2)2000×g离心10分钟，将上清转移至一个含有等体积提取液(16％PEG6000和1mol/LNaCl)中，混合均匀后放置于4℃冰箱内，过夜保存；

3)20000×g离心1小时，弃去上清液，加入5ml磷酸盐缓冲液中重悬，后加入等体积的洗涤液(10％PEG6000和1mol/L NaCl)中，混合均匀；

4)20000×g离心1小时，弃去上清液，加入500uL磷酸盐缓冲液重悬30分钟。

2、外泌体转染体外培养的干细胞

1)在1.5ml小离心管中配置反应体系

成分	体积
		标记的外泌体溶液	93ul
EV-Entry溶液A	5ul
		EV-Entry溶液B	2ul

充分混匀，室温静置45分钟。

2)将6孔板中培养的iPSC细胞用PBS清洗两次后，直接加入混合的转染溶液。37℃培养2小时后再加入1ml无外泌体的培养基继续培养24小时。

3、荧光显微镜观察转染效率

虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是专利所有者可以在所附权利要求的范围之内做出各种变形或修改，只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围，都应当在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种利用外泌体转染干细胞的方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)采用天然或培养的细胞培养外泌体，从大体积的体液中分离外泌体；

(2)采用外泌体的转染试剂处理外泌体，通过基因工程技术将需要转染的物质递送至外泌体中；

(3)干细胞的胞吞作用将外泌体高效摄入后，使得外源性的分子递送至干细胞内部。

2.根据权利要求1所述的一种利用外泌体转染干细胞的方法，其特征在于所述的从大体积的体液中分离外泌体，按照以下步骤进行：

(1)将大体积的体液中蛋白质成分去除；

(2)通过聚乙二醇等沉淀外泌体。

(3)通过离心的方式分离沉淀的外泌体。