CN107937342A - 一种通过内皮细胞来源的外泌体扩增神经干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用内皮细胞来源的外泌体扩增神经干细胞的方法，使用无血清培养基培养P3‑P4代的人原代内皮细胞72小时后，收集培养基上清液；将培养上清液离心后，再经滤膜过滤，加入终浓度为12％的聚乙二醇6000并混匀；混匀后12小时进行转速为12000g/分钟的1小时离心，从而得到外泌体；将人原代血管内皮细胞来源的外泌体加入小鼠神经干细胞中，共孵育12小时,培养5天后，神经干细胞自我更新及增殖能力增强；本发明的方法操作简便，耗时短，并能维持NSCs的正常干细胞特性与多向分化潜能，为以NSCs为细胞来源的干细胞替代疗法提供充足的细胞量。

Description

一种通过内皮细胞来源的外泌体扩增神经干细胞的方法

技术领域：

本发明属于生物医药领域，涉及一种内皮细胞的外泌体及其扩增神经干细胞的方法，尤其涉及一种人原代脐静脉内皮细胞来源的外泌体在小鼠神经干细胞扩增方面的应用。

背景技术：

经过近十年的囊泡研究，外泌体等是细胞间普遍的通信方式。几乎生物体中所有的细胞都可以释放外泌体，细胞释放的外泌体或者被周围细胞摄取，或者在各种液体，如血液、尿液、脑脊液和母乳中循环最终被远端的细胞摄取。外泌体来自于内涵体，是由脂质包裹的一个内容物载体，可运输蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子。核酸，蛋白和脂质被包装到外泌体后经多囊泡体与细胞膜融合后释放，外泌体接触于受体细胞表面，接触细胞的外泌体或者用其膜蛋白刺激细胞上相应受体，或者与细胞膜融合进入细胞，或者由胞吞途径进入内吞小室，由此向受体细胞传递蛋白，脂质与核酸，外泌体携带的蛋白质部分具有其来源细胞的特异性，也有部分是外泌体所保守的如胞浆蛋白，内体蛋白等。外泌体携带的核酸包括mRNA，microRNA，rRNA，lncRNA以及一些DNA，并且这些核酸成份会受到细胞自身状态的影响而改变。外泌体产生过程大致如下：质膜向内出芽形成早期内体，早期内体融合来自内质网筛选的蛋白并在在高尔基复合体中被加工，产生多囊泡内体，其命运或者是与质膜融合将内含的外泌体释放出去，或者是与溶酶体融合被降解。

缺血性脑卒中、外伤性脑损伤和神经退行性疾病等中枢神经系统疾病均伴随着神经细胞的大量死亡，最终造成病人的认知障碍或残疾、甚至死亡。如何补充损失的神经细胞是恢复正常脑功能的关键。各类型的神经细胞均来源于神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)，脑损伤会激活NSCs增殖分化来修复受损脑区，但此过程效率极低，此外脑中NSCs数目有限，因此內源性修复远不能补充大量受损的神经细胞。外源NSCs为此类疾病的治疗提供了机遇，然而目前扩增NSCs的方法均有明显的缺陷，如诱导多能干细胞的潜在的癌变风险、胚胎干细胞治疗存在伦理问题、以及细胞因子扩增NSCs造成的细胞老化。因此如何扩增功能正常的NSCs是一个挑战性的问题。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，解决NSCs体外扩增问题，提供一种静脉内皮细胞的外泌体及其扩增神经干细胞的方法，操作简便，耗时短，并能维持NSCs的正常的干细胞特性与多向分化潜能，为以NSCs为细胞来源的干细胞替代疗发提供充足的细胞量。在以上基础上，本发明的另一目的在于提供一种扩增NSCs的方法在神经细胞和组织修复中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案具体是这样实现的：

一种静脉内皮细胞的外泌体及其扩增神经干细胞的方法使用无血清培养基培养P3-P4代的人原代脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)72小时(hour，h)后，收集培养基上清液；将培养上清液离心后，再经滤膜过滤，加入终浓度为12％的聚乙二醇6000并混匀；混匀后12h进行转速为12000g/分钟的1h离心，从而得到外泌体；将HUVECs来源的外泌体加入小鼠NSCs中，培养至第5天，相对于对照组，小鼠NSCs自我更新和增殖能力增强。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在获取P3-P4的人原代内皮细胞还包括：

步骤一：用PBS缓冲液冲洗15-20cm长的新生儿脐带脐静脉中血污3-5次；

步骤二：用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶(1mg/ml)室温下消化15-20分钟；

步骤三：消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次；

步骤四：将上清以2000转/分钟离心5分钟收集细胞；

步骤五：弃上清液，将所得细胞培养于含有10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素的内皮细胞培养基中。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在获取人原代内皮细胞时所用胶原酶为溶于含有Ca²⁺和Mg²⁺HANKS溶液的I型胶原酶，消化时间为30分钟，消化温度为37℃±1℃。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在培养人原代内皮细胞时每3天更换一次培养基。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在获取融合度为85％-90％时的P3-P4代的人原代内皮细胞时所用培养基含有10％胎牛血清、内皮生长因子以及1％青霉素/链霉素。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在获取P3-P4的人原代内皮细胞外泌体时所用培养基含有内皮生长因子以及1％青霉素/链霉素。

本发明提供的HUVECs来源外泌体的方法，在获取P3-P4的人原代内皮细胞外泌体时当细胞融合度达85％-90％时收集的细胞培养基上清液，经500g离心5分钟和3000g离心30分钟后，进行0.22μm滤膜过滤，并收集滤液，最后经12000g离心1h获得外泌体。

有益效果：

通过外泌体与原代小鼠NSCs的共孵育，经DiI染色证实外泌体可在与NSCs孵育12h内进入NSCs胞浆、经实时定量PCR证实外泌体可使NSCs的6种干性标志分子表达水平均明显上升、经克隆球计数和EdU染色证实外泌体的加入可促进NSCs的自我更新和增殖，经TUNEL染色证实外泌体减少了NSCs的凋亡。并且分化染色实验证实经外泌体处理后的NSCs依旧保持有多项分化的能力。

原代HUVECs来源的外泌体可通过体外培养HUVECs从而快速大量生产，可促进NSCs的增殖、抑制其凋亡，在提高NSCs干性的同时保持其多向分化潜能，因此有望成为体外扩增NSCs或体内刺激NSCs增殖分化的一种新策略，对缺血性脑卒中、外伤性脑损伤和神经退行性疾病等伴随大量神经细胞死亡的中枢神经系统疾病具有潜在的治疗作用。

附图说明：

图1为HUVECs来源外泌体的鉴定图。A图为透射电镜下可见到典型的外泌体“杯状”形态；B图为分别用HUVECs来源外泌体及HUVECs细胞裂解液进行Westernblot实验检测图；C图为外泌体粒径分析显示图；

图2为外泌体与NSCs共孵育12h后进入NSCs的观察图；

图3为HUVECs来源的外泌体与NSCs共孵育12h后，NSCs生长5天时克隆球分析图；A左图为克隆球的明场显微镜取相图，A右图为克隆球计数显示外泌体处理组较PBS对照处理组数目显著增多；B图为检测生长5天克隆球的干细胞标志物水平图；

图4为HUVECs来源的外泌体与NSCs共孵育后细胞增殖与凋亡检测图。A图为外泌体与NSCs共孵育12h，NSCs生长4天后行EdU掺入24h，EdU染色可见外泌体处理组的EdU阳性增殖细胞比例较PBS对照组显著升高，同时Ki67实时定量PCR检测显示，细胞周期标志分子Ki67的mRNA表达水平也显著升高；B图为外泌体与NSCs共孵育12h，NSCs生长5天后行TUNEL检测，可见外泌体处理组TUNEL阳性的凋亡细胞比例较PBS对照组显著降低。

图5为HUVECs来源的外泌体处理NSCs后多向分化潜能分析图。A图为外泌体处理组及PBS对照组在诱导分化5天后，都能够分化为Map2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及O4阳性少突胶质细胞。B图为细胞计数显示，外泌体处理组分化神经细胞比例较对照组少，有更多的细胞处于未分化状态，说明外泌体处理在保留NSCs多向分化潜能的同时，提升了NSCs的干性。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明是HUVECs来源的外泌体可促进小鼠NSCs体外扩增。

原代HUVEC来源的外泌体是将原代HUVEC在无血清条件下培养72h后收集培养基，随后依次进行500g和3000g的离心除去凋亡细胞与细胞碎片，再经0.22μm滤器过滤除去大于220nm的囊泡后，与PEG6000孵育12h，再进行12000g离心1h后所得到的直径介于20-200nm的外泌体。

参见图1，A图为透射电镜下可见到典型的“杯状”外泌体结构；B图为分别用HUVECs来源外泌体及HUVECs细胞裂解液进行Westernblot实验检测，可见外泌体标志蛋白CD9和Alix表达于HUVECs来源外泌体中，CD31作为在HUVECs中高表达的蛋白同时存在于HUVECs来源外泌体中；而高尔基体标志物GM130作为阴性对照分子仅在HUVECs细胞裂解液中被检测到，不存在于HUVECs来源外泌体中。C图为外泌体粒径分析显示，提取物中70％以上的微粒直径介于20-200nm之间，正对应于典型外泌体粒径大小。

参见图2，将提取的外泌体标记荧光染料DiI(红色荧光)，加入NSCs培养基12h后在荧光显微镜下观察，可见阳性信号位于NSCs胞膜与胞浆，证明DiI标记的外泌体可以进入NSCs并发挥潜在的生物学作用。

参见图3，A左图为克隆球的明场显微镜取相，右图为克隆球计数显示外泌体处理组较PBS对照处理组数目显著增多。B图为检测生长5天克隆球的干细胞标志物水平，实时定量PCR结果显示5个干细胞标志物Nestin，Pax6，CD133,Vimentin,Sox2,Glast的表达水平显著上升。

参见图4，A图为外泌体与NSCs共孵育12h，NSCs生长4天后行EdU掺入24h，EdU染色可见外泌体处理组的EdU阳性增殖细胞比例较PBS对照组显著升高，同时Ki67实时定量PCR检测显示，细胞增殖标志分子Ki67的mRNA表达水平也显著升高；B图为外泌体与NSCs共孵育12h，NSCs生长5天后行TUNEL检测，可见外泌体处理组TUNEL阳性的凋亡细胞比例较PBS对照组显著降低。

参见图5，A图为外泌体处理组及PBS对照组在诱导分化5天后，都能够分化为Map2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞及O4阳性少突胶质细胞。B图为细胞计数显示，外泌体处理组分化神经细胞比例较对照组少，有更多的细胞处于未分化状态，说明外泌体处理在保留NSCs多向分化潜能的同时，提升了NSCs的干性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明使用较佳实施例展示如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内，利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例；但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种体外扩增神经干细胞的方法，其特征在于：

(1)使用无血清培养基培养P3-P4代的人原代脐静脉内皮细胞，收集培养基上清液；

(2)将培养上清液离心，再经滤膜过滤及聚乙二醇6000混匀后，12000g/分钟离心1小时，从而得到外泌体；

(3)将外泌体加入小鼠神经干细胞中，浓度为10μg/ml，孵育时间为12小时，培养5天，实现体外扩增神经干细胞。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的人原代脐静脉内皮细胞的外泌体加至小鼠神经干细胞后的自我更新及增殖能力增强，凋亡比例减少。其自我更新指标为：相对于对照组，外泌体处理组神经干细胞产生的神经克隆球数目增多；神经干细胞内的细胞增殖因子Ki67经实时定量PCR检测后表达水平增高；神经干细胞经EdU掺入染色后阳性增殖信号比例上升；神经干细胞TUNEL染色阳性凋亡信号比例下降。

3.一种来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体，其特征在于：

所述的人脐静脉内皮细胞的外泌体经过透射电子显微镜可观察到呈“杯状”的典型外泌体形态，并且直径介于20nm至200nm之间，另外经过蛋白印迹实验检测外泌体抗原CD9、Alix和CD31均为阳性。

4.如权利要求3所述外泌体，其制备方法的特征在于：

(1)使用无血清培养基培养P3-P4代的人原代脐静脉内皮细胞72小时，至细胞融合度为85％-90％时，收集培养基上清液；

(2)将培养上清液离心后，再经0.22μm滤膜过滤，加入终浓度为12％的聚乙二醇6000并混匀；

(3)混匀12小时后在4℃条件下进行转速为12000g/分钟的1小时离心，从而得到外泌体。

5.如权利要求4所述外泌体的制备方法，其特征在于：所述无血清培养基含有10％(体积比)胎牛血清、内皮生长因子(ECGS)以及100U/ml青霉素100μg/ml链霉素。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胶原酶为溶于含有Ca²⁺和Mg²⁺HANKS溶液的I型胶原酶，其消化时间为30分钟，消化温度为37℃±1℃。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，获取人原代脐静脉内皮细胞包括以下步骤：

(1)用PBS缓冲液冲洗15-20cm长的新生儿脐带脐静脉中血污3-5次；

(2)用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶(1mg/ml)室温下消化15-20分钟；

(3)消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次；

(4)将上清以2000转/分钟离心5分钟收集细胞；

(5)弃上清液，将所得细胞培养于含有10％(体积比)胎牛血清以及100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的内皮细胞培养基中。