CN102747033A - 一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法 - Google Patents

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周向荣
邓铭权
陈庭鹏
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Abstract

本发明提供一种安全、简单的间充质干细胞和成纤维细胞的培养方法，能通过从活体牙龈中抽取的牙龈组织培养出间充质干细胞和成纤维细胞，该方法能容许组织样本被长距离运输,而不受地域的界限；且提取出来的成纤维细胞及间充质干细胞的纯度及一致性比起现有技术要高。

Description

一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法
技术领域
本发明涉及间充质干细胞和成纤维组织的培养技术。
背景技术
现有的间充质干细胞分泌素的美容产品(如苹果干细胞)已经为大众所接受,而且学术界对于来自间充质干细胞的分泌素的潜在医疗用途正展开深入的探讨，近年已有分泌素的正面医疗效果的文献出现,如改善皮肤皱纹,心衰竭,脑退化,视力,寿命延长,等等。近年有大量文献亦指出分泌素的其它潜在医药价值,暂时研究得最深入的便是其改善心脏衰竭的功用,研究指出干细胞分泌物中所含的外吐小体(exosome)具有一定医疗用途如美国专利2011/0003008A1所揭示的。
现有技术中，医院主要从病人的骨髓提取组织去培养出间充质干细胞，其方法是：首先通过手术获取骨髓组织，然后用胶原蛋白酶消化骨髓组织,将离心后所沉淀出来的细胞团利用磷酸盐缓冲液进行清洗，之后将细胞置于含有细胞培养液的培养瓶中培养以提取间充质干细胞，数天后更新细胞培养液,提取到的间充质干细胞便会附在培养瓶的壁上继续生长。现有成纤维细胞的提取是主要从耳背提取皮肤组织(约5mm x 5mm x 2mm),然后再将提取得到的皮肤组织采用上述骨髓组织相同的提取方法进行处理得到。
现有技术的缺点主要表现为：
1）间充质干细胞和成纤维组织需要分别从不同的活体组织中提取和培养，培养复杂度大；
2）间充质干细胞和成纤维组织的提取源组织需要进行手术，如骨髓组织的提取，提取过程需要进行手术，给身体受到严重创伤(如严重烧伤)不能接受手术提取体内组织(如骨髓,脂肪)的病人带来限制；而成纤维细胞的提取会在客人的耳背抽取约5mm x 5mm x 2mm的皮肤组织(参看美国专利US 5,665,372),造成可能会形成疤痕的伤口；
3）手术提取得到骨髓组织的存活时间短，需要马上进行间充质干细胞的提取工作，给培养带来了时间和地域上的限制；
发明内容
本发明为克服上述现有技术的缺点，提供一种更为安全、更为简单的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维细胞的方法。
本发明实现发明目的采用的技术方案是，一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，所述培养方法包括以下步骤：
a．从活体牙龈中抽取牙龈组织，将牙龈组织置于组织保持液中保存，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、牛血清、抗生素和抗真菌素；
b．以磷酸盐缓冲液对所述牙龈组织进行清洗,再加入胶原蛋白酶对所述牙龈组织进行消化；
c．对消化后的混合液进行离心分离，得到细胞团；
d．将上述细胞团置于含有MEM培养基底液的培养瓶中培养，收集培养得到的细胞并将所述细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中；
e．在步骤d的磷酸盐缓冲液中加入带有磁铁的成纤维细胞抗体，混合后静置反应；
f．将步骤e反应后的产物置于磁化细胞分离器的分离管中，加入磷酸盐缓冲液进行分离，收集磁化细胞分离器的洗脱物即为间充质干细胞；
g.取出所述分离管，加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。
优选地，其特征在于，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为5-20%的牛血清、80-120U/ml的抗生素和0.25-2.5ug/ml抗真菌素。
优选地，所述步骤b中胶原蛋白酶的浓度为50-100U/ml。
优选地，所述步骤c中，离心的转速为1000-2500rpm,离心时间为3-5分钟。
优选地，所述步骤d中利用质量体积比为0.2-0.3%的胰蛋白酶或dispase分散酶收集培养得到的细胞。
优选地，所述步骤e中成纤维细胞抗体的加入量为10-30ul每四百万颗细胞。
优选地，所述步骤f中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液进行分离，再收集洗脱物。
优选地，所述步骤g中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。
优选地，所述步骤g后还包括，将收集到的间充质干细胞和成纤维组织分别置于含有细胞培养液的培养瓶进行培养，得到目标数量的间充质干细胞和成纤维组织。
本发明的有益效果是：
1）本发明通过一种源组织（牙龈组织）即可同时提取和培养出间充质干细胞和成纤维细胞，具有方法简单，安全的优点；
2）本发明中之组织取样过程是微创进行的,伤口于数天内便完全康复,非常适合身体受到严重创伤(如严重烧伤)而不能接受手术提取体内组织(如骨髓,脂肪)但需要间充质干细胞作治疗的病人；大大减低了病人手术时的痛楚及安全风险.
3）利用本发明的组织保持液,能够支持组织样本在常温下存活72小时,而其中的成份能有效抑制细菌及真菌的生长,容许组织样本被长距离运输,而不受地域的界限；
4）本发明提取出来的成纤维细胞及间充质干细胞的纯度及一致性比起现有技术要高。
具体实施方式
实施例1:
用体积比70%的乙醇溶液给人体消毒口腔,然后利用2mm直径的活检器在人体牙龈中抽取组织样本,将牙龈组织置于组织保持液中保存，组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为5%的牛血清、80U/ml的抗生素和0.25ug/ml抗真菌素；组织样本在该组织保持液可保存72小时，在该时间范围内以磷酸盐缓冲液对牙龈组织进行清洗,再加入50U/ml胶原蛋白酶对牙龈组织进行消化；再对消化后的混合液进行离心分离，得到细胞团；将上述细胞团置于含有MEM培养基底液的培养瓶中培养，收集培养得到的细胞并将细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中；在磷酸盐缓冲液中加入10ul带有磁铁的成纤维细胞抗体，混合后在3摄氏度下反应20分钟；将反应后的产物置于磁化细胞分离器的分离管中，加入磷酸盐缓冲液进行分离，收集磁化细胞分离器的洗脱物即为间充质干细胞；取出分离管，加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。
实施例2
首先利用体积比70%的乙醇溶液给人体消毒口腔,然后利用2mm直径的活检器在人体牙龈中抽取组织样本,将牙龈组织置于组织保持液中保存，组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为10%的牛血清、120U/ml的抗生素和2.5ug/ml抗真菌素；组织样本在该组织保持液可保存72小时，在该时间范围内将组织样本利用20ml的磷酸盐缓冲液清洗2次，再加入20ml的胶原蛋白酶(Type II,浓度100U/ml)消化组织样本1小时；然后将上述混合液进行离心分离得到细胞团，分离转速200rpm,分离4min,利用磷酸盐缓冲液清洗细胞团两次；把细胞团混合10ml alpha-MEM培养基底液放入T-75培养瓶中培养数天,直至细胞生长到不少于一百万颗，然后用5ml 0.25%胰蛋白酶收集细胞，利用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次,然后将细胞悬浮于0.5ml的磷酸盐缓冲液中,混合30ul带有磁铁的成纤维细胞抗体并置放于4摄氏度下反应15分钟，将反应产物全数载入已安装在磁化细胞分离器（MACS）的分离管（MACS管）中，收集磁化细胞分离器的洗脱物并进行离心分离(转速200rpm,4min),将分离得到的细胞即为间充质干细胞。
将MACS管经磷酸盐缓冲液冲洗，再将MACS管从磁化细胞分离器中移除出来，加入2ml磷酸盐缓冲液到MACS管中并利用柱塞将MACS管中的细胞压出并收集，重复以上步骤两次，对收集物进行离心(转速200rpm,4min)得到的细胞即为成纤维细胞。
实施例3
首先利用体积比70%的乙醇溶液给人体消毒口腔,然后利用2mm直径的活检器在人体牙龈中抽取组织样本,将牙龈组织置于组织保持液中保存，组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为20%的牛血清、100U/ml的抗生素和1ug/ml抗真菌素；组织样本在该组织保持液可保存72小时，在该时间范围内将组织样本利用20ml的磷酸盐缓冲液清洗2次，再加入20ml的胶原蛋白酶(Type II,浓度100U/ml)消化组织样本1小时；然后将上述混合液进行离心分离得到细胞团，分离转速200rpm,分离4min,利用磷酸盐缓冲液清洗细胞团两次；把细胞团混合10ml alpha-MEM培养基底液放入T-75培养瓶中培养数天,直至细胞生长到不少于一百万颗，然后用5ml0.3%的dispase分散酶收集细胞，利用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次,然后将细胞悬浮于0.5ml的磷酸盐缓冲液中,混合20ul带有磁铁的成纤维细胞抗体并置放于4摄氏度下反应15分钟，将反应产物全数载入已安装在磁化细胞分离器（MACS）的分离管（MACS管）中，收集磁化细胞分离器的洗脱物并进行离心分离(转速200rpm,4min),将分离得到的细胞即为间充质干细胞。将间充质干细胞混合细胞培养液放到T-150细胞培养瓶中培植至4百万个细胞。
将MACS管经磷酸盐缓冲液冲洗，再将MACS管从磁化细胞分离器中移除出来，加入2ml磷酸盐缓冲液到MACS管中并利用柱塞将MACS管中的细胞压出并收集，重复以上步骤两次，对收集物进行离心(转速200rpm,4min)得到的细胞即为成纤维细胞。将得到成纤维细胞的混合细胞培养液放到T-150细胞培养瓶中培植至目标数量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (9)

1.一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
a．从活体牙龈中抽取牙龈组织，将牙龈组织置于组织保持液中保存，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、牛血清、抗生素和抗真菌素；
b．以磷酸盐缓冲液对所述牙龈组织进行清洗,再加入胶原蛋白酶对所述牙龈组织进行消化；
c．对消化后的混合液进行离心分离，得到细胞团；
d．将上述细胞团置于含有MEM培养基底液的培养瓶中培养，收集培养得到的细胞并将所述细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中；
e．在步骤d的磷酸盐缓冲液中加入带有磁铁的成纤维细胞抗体，混合后静置反应；
f．将步骤e反应后的产物置于磁化细胞分离器的分离管中，加入磷酸盐缓冲液进行分离，收集磁化细胞分离器的洗脱物即为间充质干细胞；
g.取出所述分离管，加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述组织保持液包含有MEM培养基底液、体积分数为5-20%的牛血清、80-120U/ml的抗生素和0.25-2.5ug/ml抗真菌素。
3.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤b中胶原蛋白酶的浓度为50-100U/ml。
4.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤c中，离心的转速为1000-2500rpm,离心时间为3-5分钟。
5.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤d中利用质量体积比为0.2-0.3%的胰蛋白酶或dispase分散酶收集培养得到的细胞。
6.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤e中成纤维细胞抗体的加入量为10-30ul每四百万颗细胞。
7.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤f中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液进行分离，再收集洗脱物。
8.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤g中还包括，重复加入磷酸盐缓冲液到分离管中,利用柱塞将分离管中的细胞压出，收集得到的细胞即为成纤维细胞。
9.根据权利要求1所述的由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法，其特征在于，所述步骤g后还包括，将收集到的间充质干细胞和成纤维组织分别置于含有细胞培养液的培养瓶进行培养，得到目标数量的间充质干细胞和成纤维组织。
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