CN101472622A - 用于牙周软组织再生的组合物及其制备方法 - Google Patents

用于牙周软组织再生的组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种用于牙周软组织低侵袭性再生的组合物以及所述组合物的制备方法。制备用于牙周软组织再生的组合物，使其包含选自具有形成牙龈能力的未分化/干细胞或胚细胞的细胞、基质材料和血小板血浆。使用该组合物，能够低侵袭性地再生具有效果和良好美感的游离龈以及附着龈。

Description

用于牙周软组织再生的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于牙周软组织再生的组合物以及这种组合物的制备方法。
背景技术
近年来，已经实现了多种用于牙周病的口腔外科治疗。在牙周病中，在其自身感染区域内或由于对其进行外科治疗，一部分的牙周组织会退缩或缺损。然而，为了确保治疗后的功能性并保持美感，对这类牙周组织修复和再生的需求日益增加。
牙周组织由硬组织(例如支撑牙齿的牙槽骨)和软组织(例如牙龈)构成。如图1所示，软的牙周组织包括附于牙槽骨的附着龈和不附着于这种硬组织的游离龈。
关于牙周组织的修复和再生，例如已经公开了利用细胞移植的再生方法，所述再生细胞如用于牙槽骨及其连接区域再生的成骨细胞(日本专利特开2004-201612和2004-000497)，该连接区域与牙周组织相连。还已知引导组织再生(GTR)法，其中通过在牙龈与牙根间建立一个用于发生牙周组织再生的空间，以促进新的结缔组织附着物、牙槽骨、结缔组织等的再生。还已知一种使用诱发牙周组织再生的材料(エムドゲイン(商品名)，由生化学工业公司(生化学工業株式會社)制造)的方法；这种材料包含从幼猪牙胚提取的釉基质蛋白质。
另外，关于修复牙龈组织的方法还包括如下技术：从患者口腔或其它组织采集结缔组织碎片或上皮组织碎片，并移植所述碎片，或利用所述碎片以覆盖因缝合牙龈而暴露的牙根表面。
在牙周组织中，为了美观，强烈期望软组织(如牙龈)的修复和再生。更具体地，龈缘和牙龈牙间乳头会强烈影响牙床和牙齿对齐的美观(图1)。特别地，由牙间乳头的退缩形成的间隙(被称为黑三角)能够明显地损坏牙床和牙齿对齐的外观。除了由牙周病造成的退缩，前述游离龈也会由于不适当的口腔护理而造成退缩。当对游离龈的退缩置之不理并超过一定时间间隔后，游离龈的自然再生会变得困难。
同时，上面引用的专利文献1和2的目的是硬组织的再生，诸如在功能性方面具有高优先度的牙槽骨的再生，这同样适用于GTR的用途以及促使牙周组织再生的材料的用途。因而，这些技术没有一个能够带来令人满意的牙龈组织的恢复。关于前述的组织碎片移植程序，除了关于组织移植的采集及其植入带来的侵袭问题外，至今仍未获得令人满意的美感。
鉴于前述讨论，至今尚未完成牙周软组织再生的低侵袭性方法的研究，也没有这样被发现。另外，有效再生游离龈(如牙间乳头)的方法的研究也未完成，也没有这样被发现。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于牙周软组织低侵袭性地再生的组合物以及这种组合物的制备方法。本发明的另一个目的是提供一种用于游离龈(如牙间乳头)有效再生的移植组合物以及这种组合物的制备方法。本发明的另外一个目的是提供一种用于再生高度美观的牙床的组合物以及这种组合物的制备方法。
本发明人研究了用于牙周软组织再生的间充质干细胞和成纤维细胞的用途，所述牙周软组织也就是被认为是难以再生的附着龈和游离龈，诸如龈缘和牙龈的牙间乳头，本发明人已经发现通过将这些细胞和基质材料一起注射到需要再生的软组织部位，能有效地再生牙周软组织。基于该发现完成了本发明。因此，本发明提供下列方法，这些方法能够解决至少一个上述问题。
本发明提供了一种牙周软组织再生组合物，所述组合物包括：选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，以及基质材料。本发明的组合物还可以包含细胞生长因子。用于本发明组合物的牙周软组织优选为附着龈和/或游离龈，所述游离龈优选为牙龈的牙间乳头。能够将本发明的组合物局部注射到牙周组织内。该牙周软组织还优选为牙间乳头。
本发明的组合物可包含选自下列(a)～(d)中的一项或多项作为基质材料：
(a)透明质酸及其衍生物，
(b)胶原及其衍生物，
(c)血纤蛋白和血纤蛋白原，
(d)血浆和血小板。
所述基质材料优选至少选自(a)透明质酸及其衍生物。此时，所述细胞优选为间充质干细胞。所述基质材料还优选至少选自(b)胶原及其衍生物。此时，所述细胞优选为牙龈成纤维细胞。
所述基质材料还可优选至少选自(d)血浆和血小板。而且，所述基质材料还可优选选自(a)透明质酸及其衍生物和(d)血浆和血小板中的每一种。此时，所述细胞可为间充质干细胞。所述基质材料还可优选选自(b)胶原及其衍生物和(d)血浆和血小板中的每一种。源于(d)血浆和血小板的基质材料能够为富血小板血浆。
本发明还可提供一种制备牙周软组织再生组合物的方法，所述方法包括如下步骤：
对选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞进行培养；以及
将基质材料与培养的间充质干细胞和/或牙龈成纤维细胞进行混合。
本发明制备方法中的细胞可以是间充质干细胞或牙龈成纤维细胞。牙周软组织可优选为附着龈或游离龈。所述牙周软组织还可优选为牙间乳头。
上述混合步骤优选使用选自下列(a)～(d)中的一项或多项作为基质材料：
(a)透明质酸及其衍生物，
(b)胶原及其衍生物，
(c)血纤蛋白和血纤蛋白原，
(d)血浆和血小板，
所述混合步骤还可使用选自至少(a)透明质酸及其衍生物的一种或多种作为基质材料。而且，所述混合步骤还可使用牙龈成纤维细胞作为细胞，并使用选自至少(b)胶原及其衍生物的一种或多种作为基质材料。此外，所述混合步骤还可使用至少(d)血浆和血小板的富血小板血浆作为基质材料。
附图说明
图1为牙龈组织区域的示意图。
图2为用于本发明组合物皮下注射的部位(隆起区域)的测量点示意图。
图3为显示当将试验液体注射到裸鼠的背部区域时，形成的注射部位高度随时间(手术后0天、6天和12天)变化的图。
图4为显示当将试验液体注射到裸鼠的背部区域时，形成的注射部位体积随时间(手术后0天、6天和12天)变化的图。
图5为显示当将试验液体注射到裸鼠的背部区域时，形成的注射部位的长轴长度随时间(手术后0天、6天和12天)变化的图。
图6为显示当将试验液体注射到裸鼠的背部区域时，形成的注射部位的短轴长度随时间(手术后0天、6天和12天)变化的图。
图7为显示实施例4中男性患者牙龈的牙间乳头再生过程图：
图片a显示手术前的牙间乳头；
图片b显示就在注射后的牙间乳头；
图片c显示注射后1周之时的牙间乳头；
图片d显示注射后3个月之时的牙间乳头。
图8显示实施例3中小鼠隆起部位处组织的显微照片：
图片a为HE染色后的显微照片图像(40倍)；
图片b为HE染色后的显微照片图像(400倍)；
图片c为荧光染色后的显微照片图像，其中橙色表示植入的MSCs，蓝色表示细胞核，绿色表示已经制备的胶原。
具体实施方式
本发明的牙周软组织再生组合物的特征在于包含：选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，以及基质材料。本发明的牙周软组织再生组合物，通过让患者避免关于可移植组织的获取和植入的负担，使牙周软组织的低侵袭性再生变得可能。另外，本发明的组合物使得游离龈的再生变得可能，在此以前这是很困难的，并且所述组合物能够容易地再生高度美观的牙床。
本发明的组合物对牙间乳头的再生也很有用。牙间乳头易于感染炎症，并易于通过例如牙龈退缩而产生缝隙。然而，牙间空间难以用外科方式治疗，因为其存在的用于执行游离移植或有蒂移植的空间狭窄，还因为对移植物供应的血液不足，且由于周围的牙根和牙冠而存在限制。然而，通过将本组合物注射到牙周组织中，本发明能够容易地使得牙间乳头再生，而不用进行移植牙槽骨或牙龈的移植术。
下面将描述用于牙周软组织再生的本发明组合物的实施方案和制备这种组合物的方法的实施方案。
牙周软组织再生组合物
本发明的用于牙周软组织再生的组合物(下文中也简称为本“组合物”)包含选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，以及基质材料。本组合物能够应用于人类和非人类哺乳动物，优选用于人类。
间充质干细胞和牙龈成纤维细胞
本组合物能够包含间充质干细胞。间充质干细胞是一种成体干细胞，并且具有与许多间充质细胞不同的自我复制能力和多能能力。间充质干细胞可根据标准方法按如下获得：从例如骨髓、骨膜、外周血、脐带血、脂肪细胞等采集，然后培养，并逐步形成。对于骨髓，参考Mark F.Pittenger等，Science(1999)284卷，143～147页和KatiaMareschei等，Haematologica(2001)6卷，1099～1100页；对于末梢血，参考Sergei A.Kuznetsov等，The Journal of Cell Biology(2001)153卷，1133～1139页；对于脐带血，参考Alejandro Erices等，British Journal ofHaematology(2000)109卷，235～242页；对于脂肪细胞，参考PatriciaA.Zuk等，Tissue Engineering(2001)7卷(2)，211～228页。在本发明的情况中，为了实现牙周组织再生的目的，或者考虑到采集的方便，还优选从口腔组织采集。这种口腔组织能够被列举的有牙槽骨骨髓、血小板、牙槽骨骨膜、牙囊组织、牙周膜、牙槽骨骨髓等。这些细胞还能从牙髓细胞或牙囊细胞回收，所述细胞源自例如伴随例如拔牙而获得的牙龈。
本发明组合物可还包含牙龈成纤维细胞。所述牙龈成纤维细胞可以是已经诱导分化以便表达牙龈形成能力的细胞，诸如源自未分化/干细胞(如间充质干细胞)的牙龈成纤维细胞。例如，通过碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能够诱发分化。
选自这些间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的一种或多种能够用于本发明中。因而，可以仅使用间充质干细胞，或者仅使用牙龈成纤维细胞，或者可以同时使用它们。另外，这些细胞可以是培养的细胞。关于使用本组合物的个体，本发明能够使用的细胞包括自体细胞、同种异源细胞和异种细胞；然而，优选同种异源细胞，更优选自体细胞。例如，当目的是为了再生人类牙周软组织时，优选使用自体细胞或显示大量匹配组织相容性抗原的异种细胞。
基质材料
本组合物中使用的基质材料是一种在其施用(给药)之前或在体内能够形成显示合适粘度的凝胶或流体的基质材料。优选在体内经历降解和吸收的基质材料。例如，所述基质材料能够是至今用作细胞支架的聚合材料。能够被列举的有合成聚合物，如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸/乙醇酸共聚物、聚-ε-己内酯、ε-己内酯/乳酸或乙醇酸共聚物、聚柠檬酸、聚苹果酸、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚-β-羟基丁酸、聚乙二酸丙二醇酯、聚乙二酸丁二醇酯、聚原酸酯、聚原碳酸酯、聚碳酸亚乙酯、聚碳酸亚丙酯、聚L-谷氨酸-γ-苯甲酯、聚L-谷氨酸-γ-甲酯、聚-L-丙氨酸等；多糖，如淀粉、海藻酸、透明质酸、甲壳素、果胶脂酸以及前述物质各自的衍生物；以及肽和蛋白质，如明胶、胶原(可使用任何采集程序的任何类型的胶原)、白蛋白、血纤蛋白、血纤蛋白原、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白等。对于各种前述基质材料，可以使用由它们获得的交联产物或通过部分化学改性获得的衍生物。还可以使用多种可商购获得的凝胶(マトリゲル(Matrigel，商品名)，BD PuraMatrixペプチドハイドロゲル，两者都来自碧迪公司(BD社))。在本发明组合物注射的部位处，这类基质材料能够被用作细胞、生长因子等的保持载体。这些基质材料被称作非凝血基质材料，与下面描述的凝血体系基质材料相对。
根据本发明人所掌握的知识，这些非凝血基质材料显示了优良的渗透注射部位的能力和优良的在注射部位处的维持力(保持力)，并能容易地促进本组合物渗透入注射部位的组织。这使得本组合物可到达具有优选注射部位形态的需要再生的部位(或其附近)，例如具有有效且平滑的隆起表面处。当本组合物很难渗透到组织内时，可能形成隆起区域，并伴随在注射部位表面上的多个微小隆起，因而注射部位以不适于组织再生的方式形成；而且，在此情况下，本组合物很难到达将要再生的缺损部位，并很难引起相应组织的再生。
还可用作基质材料的是源于血液部分的凝血体系基质材料，所述血液部分含有血浆和/或血小板。血浆包括粘着因子，例如血纤蛋白、血纤蛋白原、纤连蛋白等，这些因子适用于软组织的成纤维细胞和间充质细胞的支架。血小板包含促进血纤蛋白原形成的因子，并使得当经受特定的体内或体外的刺激时，通过释放这些因子而能形成粘稠流体或凝胶。
根据本发明人掌握的知识，认为凝血体系基质材料对于组织再生是有效的，尽管它们具有差的渗透行为和差的保持行为。
血小板本身可以单独使用，且血浆本身也可单独使用。然而，血小板优选与血纤蛋白和/或血纤蛋白原组合使用，还优选与血浆组合使用，血浆为另一种血液组分。富血小板血浆(PRP)优选用作含血浆和血小板的血液组分，富血小板血浆中血小板已经被浓缩。富血小板血浆包含源于血浆的粘着因子，例如血纤蛋白、血纤蛋白原等，且其粘度可通过添加例如氯化钙/凝血酶而容易地增加，添加这些物质引起胶凝化，并由此能在体内形成保持血小板和细胞的载体。
例如，根据Whitman等(Dean H.Whitman等，J Oral Maxillofac Surg，55，1294-1299(1997))的方法，通过经历离心分离过程采集血液能够制备PRP。已知PRP富含生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)等(Jarry J.Peterson，Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，85，638-646(1998))。
PRP制备方法的例子如下。首先向采集的血液中添加抗凝血剂如柠檬酸钠，然后在室温下保持指定的时间段。其后，在分离红血球和血沉棕黄层的条件下(例如，约54000rpm)进行离心处理。这使得分离成两层(其中将上层称作去血小板血浆，下层包含红血球和血沉棕黄层)。在将上层移除后，在分离红血球的条件下(例如，约2400rpm)进行离心处理。结果，回收基本上不含分离的红血球的部分(富血小板血浆或PRP)。PRP的制备方法不限于前述方法，且所述制备能够通过已经按需要修改过的方法进行。此外，优选使用源于自体血液的PRP。这消除了毒性或免疫排斥反应的风险。
尽管对于PRP中血小板的数目(也就是，血小板的浓缩率)没有通用的定义，但所含血小板数目为采集血液中的血小板数目的约150倍～约1500倍的血浆就可以用作本发明中的PRP。本发明中PRP的血小板浓缩率由下式给出：血小板浓缩率(％)＝(PRP中的平均血小板数目/起初整个血液中的平均血小板数目)×100。
因此，当例如PRP中的平均血小板数目为1,000,000，且整个血液中平均血小板数目为300,000时，血小板浓缩率为大约333％。PRP的血小板浓缩率优选为约150％～约1500％(当换算成平均血小板数目时，这通常对应于约240,000/μL～约6,150,000/μL)。更优选的血小板浓缩率为约300％～约600％(当换算成平均血小板数目时，这通常对应于约480,000/μL～约2,460,000/μL)。
PRP的血小板浓缩率能够通过适当地调节PRP制备过程中的离心处理条件来调节。例如，当进行上述两阶段离心处理时，通过如下操作能够获得血小板浓缩率为约300％～约600％的PRP：在约500rpm～约1500rpm(例如，1100rmp)下进行第一离心处理约5分钟～约15分钟(例如，约5分钟)，然后在约2000rpm～约5000rpm(例如，约2500rpm)下进行第二离心处理阶段约5分钟～约15分钟(例如，约5分钟)。通过常见方法(例如，使用商购获得的Sysmex XE-2100(Sysmex，东京，日本))能够测量PRP的血小板浓缩率。
另外，优选PRP，因为PRP是能够由末梢血制备的自体材料，所述末梢血是从将使用本组合物的个体中采集的。另外，如下所述，还优选PRP，因为其富含细胞生长因子。PRP能够例如利用普通方法从采集的末梢血制备，然而本领域技术人员可以根据需要进行修改。当制备PRP作为自体材料时，优选添加从相关个体的末梢血采集的自体凝血酶和/或自体血清。PRP能够以与CaCl2/凝血酶为1:1～10:1的混合形式使用。能够诱发凝血体系的组合物(例如，血小板、血小板与血纤蛋白和/或血纤蛋白原的混合物、血小板与血浆的混合物(以不同于富血小板血浆的形式)还能够作为选择用作PRP的等价物以代替PRP。
所述基质材料能够为单一的上述基质材料，或能够为两种以上上述基质材料的组合。根据本发明人所掌握的知识，为了在牙周组织的注射部位有效获得优良的组织渗透性和保持力，优选使用非凝血体系基质材料作为基质材料。更优选地，从(a)透明质酸及其衍生物、(b)胶原及其衍生物、和(c)血纤蛋白和血纤蛋白原中作出选择。所述基质材料甚至更优选选自(a)透明质酸及其衍生物和(b)胶原及其衍生物。另一方面，为了在牙周组织中有效获得细胞生长和组织再生能力，所述基质材料可以优选选自凝血体系基质材料，如(d)血小板和血浆，并优选PRP。
为了获得高度美观的牙龈，所述基质材料优选选自(a)透明质酸及其衍生物。使用透明质酸等能够阻止基质自身引起的变色，并能够使显示原始牙龈颜色的牙龈组织快速再生。在此情况下，优选使用间充质干细胞。当使用透明质酸和间充质干细胞的组合时，优选与下述凝血型基质材料(如PRP)组合使用。
为了游离龈的再生，所述基质材料尤其优选自(b)胶原及其衍生物。在此情况下，优选使用牙龈成纤维细胞。如下述的实施例所示，即使在缺少(d)的凝血型基质材料的条件下，含牙龈成纤维细胞和(b)胶原及其衍生物的组合物作为基质材料仍显示了高量的牙龈再生。这是由于胶原与牙龈成纤维细胞组合的协同效应，且单独一种组分自身不能获得该效应。另外，这种组合物能够容易地填充甚至诸如牙间牙龈中缺损(如黑三角)。
另外，从游离龈组织再生的观点看，所述基质材料优选选自(a)透明质酸及其衍生物和(b)胶原及其衍生物中的一种或多种，以及选自(d)血小板和血浆(如PRP)中的一种或多种。在此情况下，细胞可为间充质干细胞和/或牙龈成纤维细胞；然而，当所述基质材料选自(a)透明质酸及其衍生物时，优选间充质干细胞，而当所述基质材料选自(b)胶原及其衍生物时，优选牙龈成纤维细胞。在考虑的情况下，所述基质材料可从(a)透明质酸及其衍生物和(b)胶原及其衍生物两者中选择，或可仅从(a)和(b)的一种中选择。从游离龈美观和再生的观点看，优选使用选自(a)透明质酸及其衍生物的基质材料与选自(d)血小板和血浆(如PRP)的基质材料的组合。
凝血基质材料能够仅通过与间充质干细胞和/或牙龈成纤维细胞的结合提供牙龈再生；然而，优选使用与非凝血体系基质材料的组合。通过实施该操作，细胞渗透、到达并被保持在具有凝血基质材料的指定部位，然后开始实现其功能。
因此，本组合物优选包含PRP和/或PRP等价物(以下简称为“PRP等”)(作为(d)的凝血体系基质材料)以及另外的基质材料(非凝血体系基质材料)作为所述组合物的基质材料。所述非凝血体系基质材料优选选自(a)透明质酸及其衍生物和(b)胶原及其衍生物。通过制备含细胞+凝血体系基质材料(PRP等)+非凝血体系基质材料的组合物并通过将前述物质混合均匀，能够获得适于注射的粘度。
因为这类组合物具有由凝血体系基质材料(PRP等)和非凝血体系基质材料混合而成的复合基质材料，所以本组合物能够容易地渗透到注射部位的组织内。这使得本组合物可到达需要再生的部位(或其附近)，所述部位具有优选的注射部位构型，例如具有有效且平滑的隆起表面。另外，含PRP等以及其它基质材料的复合基质材料的存在，会由PRP等以及细胞而在注射部位产生优良的保持力。结果，能够在用于本组合物的注射部位确保优良的细胞生长行为和优良的组织再生性能，并且不仅会促进附着龈的有效再生，而且会促进游离龈的有效再生。因而，使用含PRP等的复合基质使得甚至如牙间牙龈中的缺损(如黑三角)也能容易地被填充。
基于前述教导，当本组合物包含凝血基质材料(PRP等)和非凝血基质材料时，所述组合物优选包含分别为一定量的非凝血基质材料和凝血基质材料，使得当将本组合物注射到组织内时保证渗透性和保持力。当非凝血体系基质材料太少或凝血基质材料太多时，会损害注射时向组织的渗透，导致易于形成具有微小凸起和凹陷的注射部位形状和组织，并损害注射部位的细胞和PRP等的保持力，往往导致注射部位组织再生性能的下降。
例如，基于在皮下注射部位保持隆起形状的能力，所述形状由当注射本组合物时形成的注射部位高度或体积所表示，能够确定本组合物中凝血基质材料(PRP等)与非凝血基质材料之间的优选混合比(下面进行描述)。例如，相对于1～3％的胶原溶液(优选2％的胶原溶液)或3mg/mL～15mg/mL的透明质酸溶液(优选10mg/mL)，优选以10v/v％(包含)～900v/v％(包含)的比例使用血小板含量在正常范围内的PRP。更优选至少为100v/v％，甚至更优选至少为200v/v％。当使用至少100v/v％时，能够可靠地实现PRP和其它基质材料的共用效果，当使用至少200v/v％时，有助于注射本组合物时产生细小的组织状况。另外，优选不超过250v/v％。这是因为超过250v/v％时，损坏外观的共用效果。在与PRP组合使用的那些情况中，载体或组合物中胶原的浓度优选为至少0.2％但不超过1.8％，更优选不超过1％，甚至更优选不超过0.6％。载体或组合物中透明质酸的浓度优选为至少1mg/mL但不超过9mg/mL，更优选不超过5mg/mL，甚至更优选不超过3mg/mL。
优选用于本组合物的基质组合物的例子示于表1中。这些组合物优选用于牙周软组织，但这些组合物尤其优选用于游离龈的再生，并尤其优选用于牙龈牙间乳头的再生。所述游离龈能够通过间充质干细胞+透明质酸+PRP等的组合以及通过成纤维细胞和胶原的组合而有效再生。示于表1中的每种组合物可同时包含间充质干细胞和成纤维细胞。
表1
Figure A200780022810D00191
细胞生长因子
本组合物能够包含细胞生长因子。这种细胞生长因子是通过存在于本组合物中的细胞来促进牙龈再生的细胞生长因子，对该细胞生长因子没有其它特殊限制。能够被列举的有促进细胞生长和伤口愈合的细胞生长因子。而且，其可优选为存在于例如血小板的α-颗粒中的细胞生长因子。这类生长因子能够被列举的有PDGF(促进细胞生长)、TGF-β(促进IV型胶原的产生，该胶原刺激细胞周期)、VEGF、EGF、bFGF等。
本组合物可以以血小板的形式或以血浆加血小板的形式包含这类生长因子，优选以PRP的形式。如已经说明的，能够将PRP用作本组合物中的基质材料，但其也能够用作细胞生长因子的来源。
因为本发明的组合物包含与具有牙龈形成能力的细胞相结合的基质材料，所以所述组合物容易到达需要再生的部位，且在该部位提供优良的细胞保持力。因此能够容易地再生牙周软组织。当使用本发明的组合物以再生作为特定牙周软组织的游离龈时，所述组合物优选具有保持注射部位隆起形状的能力。这是因为游离龈自身呈现独立或隆起构型。保持注射部位隆起形状能力的指标可以是，例如注射部位的高度或体积，所述注射部位是在当将本发明的组合物对啮齿动物如小鼠或大鼠(优选用作实验动物的啮齿动物)的背部区域皮下注射时形成的。
这类指标的例子是指定时间周期后注射部位的高度对注射时注射部位的高度的比。这是因为该高度是一种表示移植组织提供隆起或独立特点的能力的合适指标。例如，这种高度比能够如下确定：
(a)对于将所述组合物皮下注射入啮齿动物的背部区域时所形成的隆起区域，其在注射后144小时之时的高度对注射时的高度的比。
在这种测量方法中，所述啮齿动物优选为实验动物，更优选裸鼠。本发明组合物的注射量能够为0.5mL～3.0mL，优选1.0mL。隆起区域的高度是已经将所述组合物皮下注射入背部区域而形成的隆起区域的最大高度，并用测径计测量上述标记。
以这种方式确定的高度比优选为至少15％。当该高度比为至少15％时，即使以后也易于保持隆起状况。更优选至少30％。
高度比的另一个方面为，在本发明组合物注射后288小时之时隆起区域的高度对注射时隆起区域的高度的比。测量方法同上。该高度比优选为至少15％。当该高度比为至少15％时，还更容易保持隆起状况。更优选至少30％。为了本发明组合物的这个方面，在将所述组合物注射后288小时之时隆起区域的高度对注射时隆起区域的高度的比甚至更优选为至少10％。
另一个指标的例子是经指定时间周期后注射部位的体积对注射时皮下注射部位体积的比。这是因为体积是一个表示移植的组织提供隆起或独立特点的能力的合适指标。例如，这种体积比能够按如下确定：
(b)对于将所述组合物进行皮下注射入啮齿动物的背部区域所形成的隆起区域，其在注射后144小时之时的体积对注射时的体积的比。
测量该体积的方法还可采用与之前高度的测量相同的程序。为了测量体积，当注射本发明的组合物时，在隆起区域的轮廓上4个以上的位置制作标记，并根据这些标记，测量隆起区域的长径和短径，还测量其高度。如果隆起区域为半球形或半椭圆形的形状，根据相应直径或长径和短径的数据计算隆起区域体积的近似值。所述标记优选位于长径和短径与隆起区域轮廓的交叉处。长径和短径能够使用例如测径计的合适仪器进行测量。
由此确定的体积比优选为至少10％，该比值更优选为至少20％。甚至更优选为至少30％。
本组合物优选能够在使用时注射于牙周组织处，也就是，通过局部皮下注射。特别地，本组合物的非细胞成分在使用时可以是可溶性粉末，并且可进行预先制备以便获得适于注射的流动性，例如液体或凝胶，或者本组合物可以是在使用时通过预先稀释而制备的流体。另外，其可以为包含两种以上试剂的套装，在使用时通过混合将所述试剂进行配制。本组合物能够包含注射时使用的合适溶剂。这类溶剂能够被列举的有生理上相容的缓冲溶液、生理盐水和多种可注射溶剂。本组合物的非细胞组分按需要可包括稳定剂、防腐剂、pH调节剂和增稠剂等。
本组合物的制备方法
对本组合物的制备方法没有特殊限制，例如，所述方法可仅包括将本组合物构成成分的细胞和基质材料与任选成分如细胞生长因子等进行简单混合。如需要，可包括缓冲溶液、生理盐水和/或可注射溶剂。本组合物中的细胞数目优选为约1.0×104个细胞/mL～1.0×1010个细胞/mL。
已经说明的多种基质材料能够被用作细胞缓冲基质，并优选使用选自(a)透明质酸及其衍生物、(b)胶原及其衍生物、(c)血纤蛋白和血纤蛋白原以及(d)血浆和血小板(通常为PRP)中的一种或多种。用于本组合物的基质材料溶液能够具有例如浓度为3mg/mL～15mg/mL、优选10mg/mL的透明质酸，以及能够具有浓度为0.5～5wt％、优选为1～3wt％的胶原。
关于本发明的制备，使用的细胞必须按需要的量进行预先采集和制备。根据采集的细胞类型，采用常规方法对采集的细胞进行培养和增殖。因而，可以培养选自未分化间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，可以将选自培养的未分化间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞与基质材料混合。
细胞的采集、分离和培养
通过常规方法，例如如下述间充质干细胞的情况，可以进行细胞的采集、分离和培养等。
(1)对源于骨髓的间充质干细胞进行采集和分离的程序。
能够通过常规的方法从例如髂骨，采集人类或实验动物的骨髓。在从口腔骨髓采集的情况下，通过对牙槽骨进行打孔直至骨髓流体流出，可采集骨髓流体。将这种采集的骨髓流体与合适的介质(例如，含自体血清的10％FBS或DMEM介质)一起接种至组织培养皿中，并仅培养几天后粘附在培养皿上的细胞，而将悬浮的细胞洗掉。
(2)口腔骨膜细胞的采集和分离程序
剥离人类或实验动物的腭或上颌骨或下颌骨的牙槽粘膜，使牙槽骨上的骨膜暴露，并采集适当大小的骨膜；将采集的骨膜精细地切碎，然后与胶原酶在37℃下进行孵化。然后通过例如移液，分散所述细胞，并通过过滤或离心分离，对其进行浓缩。测量获得的细胞数目，并将它们与合适的介质(例如，含自体血清的10％FBS或DMEM介质)一起接种至组织培养皿中。
(3)源于牙髓组织或牙泡组织的干细胞的采集和分离程序
在从牙髓组织或牙泡组织采集中，在拔牙时采集牙胚；目测切开该组织，然后使其经历移植培养；仅对附着的细胞进行培养，并将漂浮的细胞洗掉。
(4)间充质干细胞的培养
可使用任何适于这类细胞培养的培养介质对按上述获得的各种间充质干细胞进行培养。如需要，可添加细胞生长因子如bFGF等进行培养(J.Bone Mineral Res.20(2005)，399-409；Biochem.Biophys.Res.Commun.288(2001)，413-419)。可以在任何适于哺乳动物培养的条件下进行培养，但通常优选在37℃于5％二氧化碳存在下进行培养。可采用干细胞培养领域中已知的合适方法进行连续的干细胞培养。
(5)牙龈成纤维细胞的分离、采集和培养程序
在牙龈成纤维细胞的情况下，例如，用胰蛋白酶处理采集自人类或实验动物牙龈的微小牙龈碎片，以分散所述细胞。除去上清液以提供细胞悬液。用培养瓶稀释并测量细胞数目，以提供合适的细胞数目(例如，1×102/mL)，或者，通过外植体培养将所述细胞接种至陪替氏培养皿中，然而于37℃在5％的CO2下在培养箱中进行培养。在形成单层片后，进行培养的传代。通过成纤维细胞培养领域中已知的适当方法能够进行成纤维细胞培养的传代。
优选通过牙周组织中的局部注射使用本组合物，更优选通过人类牙周组织中的局部注射来使用本组合物。注射部位能够在牙周软组织退缩的附近，或在牙周软组织缺损或缺乏部位的附近，还能够位于主要针对硬组织的常规再生外科手术后游离龈缺损部位的附近。具体例子为由牙龈退缩而已经暴露的牙根表面附近，以及牙间乳头缺损附近，例如黑三角。
以50～5000μL、更优选500～2000μL的给药量对每个给药部位施用具有1.0×104～1.0×1010个细胞/mL细胞浓度的本组合物。所述给药部位可以为面部或舌部，或两处都给药。通过经皮皮下注射进行给药，或通过切割将注射部位打开，其中本组合物可以被注射或填充，在此情况下然后可以缝合。还可将能够用作所述部位的特色支撑材料的基质材料分别填充到所述切开部位。可以对两处或多处部位同时给药。
用于牙周组织中局部注射的本发明组合物非常适合于非常小的再生部位(如龈缘和牙龈的牙间乳头)的再生。当本组合物通过经皮皮下注射而不需要附加切开的方式给药时，在其被单独注射或没有伴随从在牙龈表面的其它外科手术附加人造物品的情况下，牙龈表面的外观将基本不受影响，即使在治疗期间也保持美观。特别地，当使用透明质酸作为基质材料时，从最初的注射开始，就能保持期望的美观，几乎对牙龈的外观(例如，颜色等)没有影响。另外，当本发明的组合物包含基质材料时，由于细胞优良的组织渗透性和保持力，即使不大量给药也能够获得良好的组织再生效果。在这种情况下，由此还能实现低侵袭性。在局部注射的情况下，甚至单次给药就能实现附着龈和游离龈的优良再生并填充牙间乳头。
本组合物可以这样施加到给药部位：单独地使用常规GTR或基于釉质基质的方法，并单独地使用组织移植植入或外科手术以覆盖暴露的牙根表面。其还可以在实施这些常规方法或程序的同时给药，或作为它们的补充。还可以在牙槽骨或附属组织已经经历某种程度的修复后，在常规外科手术后给予本组合物。
本组合物对牙周软组织的低侵袭性再生/修复也是有效的，所述牙周软组织也就是附着龈和牙龈牙间乳头，如游离龈。本组合物能够有效地再生游离龈，如龈缘和牙龈牙间乳头，其中再生至今仍是困难的或不能令人满意的。因此，本组合物能够再生具有良好美感的牙床。由此，本组合物能够被用作再生游离龈的组合物，特别是作为再生龈缘的组合物和用作再生牙龈牙间乳头的组合物。
牙周软组织的再生方法
牙周软组织的再生方法是本组合物实施方案的一个例子。因此，通过对需要牙周软组织再生的个体(例如人)的牙周软组织退缩部位或牙周软组织缺损部位施用本组合物，能够再生这些部位的附着龈和/或游离龈，并能在功能上重建具有良好美感外观的牙床。使用本组合物的再生方法与向退缩或缺损部位直接施用组合物的方法划清了界限；事实上，可将本组合物施用到保留在退缩或缺损空间(空隙)的残余组织上，然后，以填充这类空间的方式在其中再生牙周软组织。因此，这根本不同于向空隙自身(例如，缺损部位)提供组合物以再生所述部位的方法。特别地，通过使用本发明的组合物能够有效地再生牙龈牙间乳头，其中具体使用包括胶原+成纤维细胞或者透明质酸+间充质干细胞+PRP。能够将这类再生方法与集中于牙槽骨的硬组织再生外科手术(例如，GTR、釉质基方法、细胞移植、组织碎片移植)结合起来使用。例如，其可以在这些再生外科手术的同时进行，或者在这些外科手术之后进行。根据这些，以上已经描述了用于再生方法中的本发明组合物、给药方法等等。
当牙周组织再生方法使用本组合物时，不需要将本组合物所包含的单个构成成分以组合物的形式进行注射；它们可以作为单种试剂，以单独的形式或两种或多种组合的形式进行注射等。例如，细胞悬液或含细胞和生长因子的流体，可在前述基质材料注射以后再进行注射，反之亦然。可设定将本组合物的一种或多种构成成分单独给药的程序以满足情况要求。
牙周软组织再生组合物的评价方法
本发明还提供了评价牙周软组织再生组合物的方法。因而，适用于游离龈再生的组合物能够通过执行如下步骤获得：使用前述游离龈或牙龈牙间乳头再生指标，评价不同组合物的游离龈再生能力。本发明组合物能够进行这种评价。评价指标能够是前述的通过皮下注射产生的隆起区域的“高度比”和/或“体积比”。所述评价还使用前述这些指标的数值。例如，当高度比等于或大于上面所引数值时，能够确认形成游离龈的能力，而当高度比不满足上面所引数值时，就排除了形成游离龈的能力。
本发明另外提供了一种制备游离龈再生组合物的方法，其中这种方法包括前述评价方法的评价步骤。因而，一旦通过这种评价方法确认了特定组合物具有形成游离龈组织的能力，就能够根据这种组合物的成分制备用于游离龈再生的组合物。
实施例
通过下面的实施例对本发明进行详细说明，但不能将本发明限制于下列实施例。
实施例1：制备人类间充质干细胞
在手术前，通过普通的方法从患者的髂骨进行采集。将采集的骨髓吸出物与合适的培养介质一起接种至组织培养皿。移除悬浮细胞，并用以恒定间隔进程更换的培养液培养和增殖细胞。
实施例2：制备人类牙龈成纤维细胞
在手术前，从患者牙龈上进行采集。通过移植培养接种至培养皿，且在37℃于5％的CO2下在培养箱中进行培养。通过通用的方法(与用于未分化间充质干细胞的方法相同)对细胞块进行培养、增殖和制备。
实施例3：细胞植入
在这个实施例中，为了评价用作附着龈和/或游离龈再生材料的可能性，将每个体系例子的细胞和基质材料注射入小鼠体内，并测量隆起区域尺寸随时间的变化。
(1)准备实验动物
对裸鼠进行乙醚麻醉，并使用戊巴比妥钠(预先稀释10倍，商品名：ソムノペンチル)的结核菌素接种注射器通过腹内腔注射(限量为10倍稀释体的0.6mL)以保持麻醉状态。麻醉后，用商购的脱毛霜进行除毛。
(2)制备流体再生组合物
为了制备植入实验动物体内的流体再生组合物，使用前面制备的人类间充质干细胞(MSCs)或人类牙龈成纤维细胞(FB)制备流体组合物(总计1.0mL)。各体系例子包括仅有相应非细胞成分(胶原，透明质酸，PRP+透明质酸，以及PRP)的液体形式的对照。注射前，完成PKH26染色。
Figure A200780022810D00281
将每种制得的液体示于表2中。使用带22号针头的注射器，将三种液体各自以1.0mL注射入单只裸鼠的背部区域。为了清晰地显示注射部位，用黑墨水标记出注射部位的圆周。这样，如图2所示，在注射部位(凸起)的边缘处标记位置，其中凸起根部的长径和短径相互正交，并分别测量注射部位的长径、短径和高度，将这些值作为手术后0天的测量值。使用测径计分别测量这些尺寸。
(3)手术后第6天
以与注射时相同的方式对每只裸鼠进行麻醉，并根据注射时所做标记的位置测量注射部位的尺寸。
(4)手术后第12天
通过过量的乙醚吸入将每只裸鼠杀死。测量注射部位的尺寸并取下小鼠的背部区域。在显微镜下观察摘除的切片。
在图3～6中分别显示了从手术后第0天、第6天和第12天的测量值获得的注射部位的高度、体积、长轴直径和短轴直径。将隆起区域假定为半球形或半椭圆形的形状，并根据相应直径或者长轴直径和短轴直径的数据计算所述隆起区域体积的近似值。
如图3～6所示，在所有注射部位的系列例子中，首先在试验液体注入后开始溶胀，随着其高度、短径和长径的变小，经历收缩。
高度分析
如图3中所示，使用胶原作为基质材料的胶原系列例子，不管是使用含间充质干细胞的液体还是含成纤维细胞的液体，在手术后第6天(144小时后)都保持了大约相同程度(50～65％)的隆起部位高度；然而，手术后第12天(288小时后)，对于使用含间充质干细胞的液体，发生收缩(10％)，而对于使用含成纤维细胞的液体，保持了40％。由此可以得出结论，胶原+成纤维细胞是一种提供合适的高度保持率的组合物。在透明质酸体系的情况中，手术后第6天，对于间充质干细胞和成纤维细胞两者，高度已经为10％或10％以下，因此，注射部位的高度几乎完全消失。PRP体系例子也具有与透明质酸体系例子相同的趋势。与此相比，对于(透明质酸+PRP)体系例子，在手术后第6天(即144小时后)时，对于含间充质干细胞的液体，保持率为约60％；对于含成纤维细胞的液体，保持率为约20％；手术后第12天(即288小时后)，对于含间充质干细胞的液体，保持率为约50％，对于含成纤维细胞的液体，保持率小于10％。因此，证明(透明质酸+PRP)体系例子在使用间充质干细胞和成纤维细胞两者时都提供了优良的高度保持率，尽管间充质干细胞显示了更优选的高度保持率。
体积分析
如图4中所示，使用胶原作为基质材料的胶原系列例子，不管是使用含间充质干细胞的液体还是含成纤维细胞的液体，在手术后第6天(144小时后)都保持了大约相同程度的注射部位体积；然而，手术后第12天(288小时后)，使用含间充质干细胞液体的注射部位已经几乎经历了完全退缩。与此相比，相对于手术后第0天的体积，含成纤维细胞的液体提供了约30％的体积保持率。也就是，可以得出结论，胶原+成纤维细胞是一种提供合适的体积保持率的组合物。在透明质酸体系情况下，手术后第6天(144小时后)时的间充质干细胞和成纤维细胞两者的注射部位体积已经几乎彻底消失了。PRP体系例子也具有与透明质酸体系例子相同的趋势。与此相比，对于(透明质酸+PRP)体系例子，在手术后6天(144小时后)时，对于含间充质干细胞的液体，保持率为约40％，对于含成纤维细胞的液体，保持率为约16％；手术后第12天(288小时后)时，对于含间充质干细胞的液体，保持率大于10％，对于含成纤维细胞的液体，保持率小于5％。因此，证明(透明质酸+PRP)体系的例子在使用间充质干细胞和成纤维细胞两者时都提供了优良的体积保持率，尽管间充质干细胞显示了更优选的体积保持率。
长径和短径的分析
如图5和6中所示，在所有体系的例子中，长轴长度(长径)和短轴长度(短径)也经历变小的过程，然而，所有体系都保持在某个值或在某个值以上，且在体系例子内部的差异和体系例子之间的差异与高度和体积的差异不在同一程度。
根据前述结果表明，含至少一种基质材料和间充质干细胞或牙龈成纤维细胞的组合物能够再生牙周软组织中的附着龈，因为使用这些组合物的隆起区域的短径和长径都保持为某一水平或在某一水平附近。特别地，还表明，关于隆起区域的高度和体积保持率，胶原+成纤维细胞的组合以及含透明质酸和PRP的组合(尤其是与间充质干细胞的组合)明显比其它的组合更加有效，而且，根据它们隆起区域的轮廓表明，它们不仅适用于附着龈的再生，还适用于独立龈缘的牙龈牙间乳头的再生。另外表明，注射部位的高度和体积相互关联，除了注射部位的体积以外，还能够将注射部位的高度用作游离龈再生活性的方便指标。
根据对皮下注射部位观察的结果，表明使用透明质酸能够提供具有优良外观的再生区域，其中粘膜表面呈现的颜色几乎与周围的颜色没有差别。
实施例4：牙龈牙间乳头的再生
该实施例是牙龈牙间乳头再生的例子，向由于牙龈牙间乳头的缺损而存在黑三角的三位患者注射含间充质干细胞的试验液体。患者如下：A男(年龄：54岁)，由于下颌牙列中牙间乳头的缺损而具有黑三角外观(具体地，下颌骨植入物修复后周围的牙间乳头)；B男(年龄：22岁)，由于上颌前牙的牙间乳头缺损而具有黑三角外观；以及一位48岁的女性，由于上颌牙列中牙间乳头缺损而具有黑三角的外观。对采集自各位患者骨髓的MSCs进行手术前培养。在手术当日，从每位患者采集50mL的血液，并将采集的血液进行离心分离以制备PRP。试验液体通过如下方法制备：分别将10wt％的CaCl2+凝血酶混入制备的混合物，使得在透明质酸溶液(10mg/ml的透明质酸钠)中具有100v/v％～230v/v％的PRP和1×107个细胞/mL的MSCs。制备好试验液体以后，将总量1.0mL的试验液体迅速注射到每位患者的上述每个缺损部位附近。在所有患者中，注射6天后，上述缺损部位中的牙龈牙间乳头开始再生，且黑三角消失。
将54岁A男手术前和手术经过一段时间后的观察结果示于图7中。如图7所示，尽管在手术前存在黑三角(参考图7中的图片a)，但是随着手术后时间的推移，牙龈开始再生，牙间乳头被再生的牙龈填充，且黑三角消失。
实施例5：对实施例3中小鼠注射部位的皮下组织观察
在裸鼠的每个注射部位采集组织切片，所述裸鼠注射了实施例3中制备的(MSCs/HA/PRP)组合物或(FB/HA/PRP)组合物，其为透明质酸+PRP体系的例子。这些样本经受HE染色和荧光染色，并将染色结果示于图8和9中。图8中的a和b为由HE染色产生的显微照片图像，而图8c为由荧光染色产生的显微照片图像。如图8的a～c所示，关于(MSCs/HA/PRP)注射部位，表明形成了良好品质的组织，作为移植MSCs(橙色)环境中I型胶原的优良产物。与此相比，如图9中所示，在从(FB/HA/PRP)注射部位采集的组织中所产生的I型胶原产物少于(MSCs/HA/PRP)，(FB/HA/PRP)也是透明质酸+PRP体系的例子。根据这些结果表明，(MSCs/HA/PRP)组合物提供了优秀量的胶原产物，且注射部位的高度比和体积比的结果(参考实施例3和4)与胶原产物的量相对应。
前述结果表明，通过使用具有能良好地保持隆起形状的再生组合物，甚至在难以再生的位置如牙龈牙间乳头处，也能够实现方便和高度美观的再生。
该申请以2006年4月19日提交的日本专利申请2006-115932的优先权为基础，且其全部内容并入该说明书中。

Claims (34)

1.用于牙周软组织再生的组合物，包括：
选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞；以及
基质材料。
2.如权利要求1所述的组合物，还包括细胞生长因子。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质材料包含一种或多种选自下列(a)～(d)中的成分：
(a)透明质酸及其衍生物，
(b)胶原及其衍生物，
(c)血纤蛋白和血纤蛋白原，
(d)血浆和血小板。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述基质材料至少选自(a)透明质酸及其衍生物。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述细胞为间充质干细胞。
6.如权利要求3所述的组合物，其中所述基质材料至少选自(b)胶原及其衍生物。
7.如权利要求3或6所述的组合物，其中所述细胞为牙龈成纤维细胞。
8.如权利要求3～7中任一项所述的组合物，其中所述基质材料至少选自(d)血浆和血小板。
9.如权利要求3所述的组合物，其中所述基质材料选自(a)透明质酸及其衍生物和(d)血浆和血小板中的每一种。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述细胞为间充质干细胞。
11.如权利要求10所述的组合物，其中源于(d)血浆和血小板的基质材料为富血小板血浆。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述基质材料选自(b)胶原及其衍生物和(d)血浆和血小板中的每一种。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述细胞为牙龈成纤维细胞。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述基质材料选自(b)胶原及其衍生物和(d)血浆和血小板中的每一种。
15.如权利要求1～14中任一项所述的组合物，其中，
对于将所述组合物皮下注射到啮齿动物的背部区域而形成的隆起区域，该隆起区域在注射后的144小时之时的高度对注射时的高度的比为至少15％。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述高度比为至少30％。
17.如权利要求1～16中任一项所述的组合物，其中，
对于将所述组合物皮下注射到啮齿动物的背部区域而形成的隆起区域，该隆起区域在注射后的288小时之时的高度对注射时的高度的比为至少15％。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述高度比为至少30％。
19.如权利要求1～18中任一项所述的组合物，其中，
对于将所述组合物皮下注射到啮齿动物的背部区域而形成的隆起区域，该隆起区域在注射后的144小时之时的体积对注射时的体积的比为至少10％。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述体积比为至少20％。
21.如权利要求1～20中任一项所述的组合物，其中所述牙周软组织为附着龈。
22.如权利要求1～21中任一项所述的组合物，其中所述牙周软组织为游离龈。
23.如权利要求1～22中任一项所述的组合物，其中所述牙周软组织为牙间乳头。
24.如权利要求1～23中任一项所述的组合物，其用于牙周组织的局部注射。
25.用于牙周软组织再生的组合物的制备方法，包括如下步骤：
培养选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞；以及
将基质材料与所培养的间充质干细胞和/或牙龈成纤维细胞进行混合。
26.如权利要求25所述的制备方法，其中所述细胞为间充质干细胞或牙龈成纤维细胞。
27.如权利要求25或26所述的制备方法，其中所述牙周软组织为附着龈。
28.如权利要求25～27中任一项所述的制备方法，其中所述牙周软组织为游离龈。
29.如权利要求25～28中任一项所述的制备方法，其中所述混合步骤使用一种或多种选自下列(a)～(d)中的成分作为基质材料：
(a)透明质酸及其衍生物，
(b)胶原及其衍生物，
(c)血纤蛋白和血纤蛋白原，
(d)血浆和血小板。
30.如权利要求29所述的制备方法，其中所述混合步骤使用一种或多种至少选自(a)透明质酸及其衍生物的成分作为基质材料。
31.如权利要求29所述的制备方法，其中所述混合步骤使用牙龈成纤维细胞作为所述细胞，并使用一种或多种至少选自(b)胶原及其衍生物的成分作为所述基质材料。
32.如权利要求29～31中任一项所述的制备方法，其中所述混合步骤至少使用作为(d)血浆和血小板的富血小板血浆作为所述基质材料。
33.用于牙周软组织再生的组合物的评价方法，包括如下步骤：
制备用于牙周软组织再生的试验组合物，所述试验组合物包含：选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，以及基质材料；
将用于牙周软组织再生的试验组合物皮下注射到啮齿动物的背部区域中，对于由此形成的隆起区域，获得该隆起区域在注射后的特定时间之时的高度对注射时的高度的比，和/或在注射后的特定时间之时的体积对注射时的体积的比；以及
根据获得的高度比和/或体积比评价再生游离龈的能力。
34.用于牙周软组织再生的组合物的制备方法，包括如下步骤：
制备用于牙周软组织再生的试验组合物，所述试验组合物包含：选自间充质干细胞和牙龈成纤维细胞中的细胞，以及基质材料；
将用于牙周软组织再生的试验组合物皮下注射到啮齿动物的背部区域，对于由此形成的隆起区域，获得该隆起区域在注射后的特定时间之时的高度对注射时的高度的比，和/或在注射后的特定时间之时的体积对注射时的体积的比；
根据获得的高度比和/或体积比评价游离龈再生能力；以及
根据游离龈再生能力，确定用于牙周软组织再生的组合物的组成，并根据所确定的组成制备用于牙周软组织再生的组合物。
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