CN103071191A - 一种自体富血小板因子血浆pfrp制剂的制备方法 - Google Patents
一种自体富血小板因子血浆pfrp制剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,采集自体全血,利用离心加冻融的方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP;B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到PFRP制剂。通过对自体全血的特殊处理得到的自体富血小板因子血浆PFRP,减少了因添加激活剂可能导致的污染风险,避免了异体使用时膜抗原存在的免疫风险。通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂,不仅对半月板等组织损伤具有很好的修复作用;还具有很好的抗皱、填充及提升效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种自体富血因子血浆PFRP制剂,具体涉及一种自体富血因子血浆PFRP(Platele-factor-rich plasma)制剂的制备方法。
背景技术
临床研究中有报道用富血小板血浆PRP(Plate-rich plasma)凝胶治疗半月板损伤,制备富血小板血浆PRP凝胶需要在富血小板血浆PRP中添加凝血酶和钙离子。凝血酶是血小板活化剂中最有效的成分。动物原性凝血酶以及钙离子的使用,有可能导致外源性的污染,使用剂量不当时也有可能导致组织的损伤。此外,使用富血小板血浆PRP凝胶皮下注射,疼痛明显且充填效果不持久。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足,提供一种创新型的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,制备出疗效好、无明显副作用的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。
本发明的另一个目的是提供一种多用途的自体富血小板因子血浆PFRP制剂,异体使用时也不存在免疫风险。不仅能够加速半月板损伤、外伤组织的修复愈合,还能满足医疗美容等多方面的需求。
为达到上述目的,本发明采取的技术方案是:提供一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,采集自体全血,利用离心+冻融的方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP;
B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂;
步骤A包括以下分步骤:
A1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体全血,离心后,弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP并深低温(低于-20℃)冻存;
A2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将自体富血小板血浆PRP冻融后离心,取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片。
步骤A1中利用抗凝管采集自体外周血。
步骤A1,离心过程中的离心力小于2000g,离心时间为8-10min。
步骤A2,离心过程中的离心力为4000g,离心时间为8-10min。
步骤A2制备的自体富血小板因子血浆PFRP包含的细胞活性分子包括自体全血血浆中的所有非细胞成分,例如细胞因子、生长因子、趋化因子、免疫调节因子、酶、激素等;其中,生长因子包括胰岛素样生长因子IGF-1、转录生长因子TGF-β1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-b和血管内皮细胞生长因子VEGF等。
步骤A2制得的自体富血小板因子血浆PFRP中各种生长因子的浓度为自体全血中相应生长因子浓度的2~5倍。
步骤B中的生物支架为商品化的胶原蛋白、透明质酸钠、纳米羟基磷灰石、聚乳酸等可应用于组织修复的生物支架。
步骤B中的自体成体细胞为自体脂肪细胞、自体成纤维细胞、自体间充质干细胞及其它可应用于修复作用的细胞。
所述透明质酸钠包括交联透明质酸钠和不交联透明质酸钠。
一种通过自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。
一种含有自体富血小板因子血浆PFRP制剂的敷料,由敷布浸在自体富血小板因子血浆PFRP制剂中制得。
本发明采用的生物支架为生物体可吸收、可降解的材料;生物支架起到载体、填充和缓释的作用。
本发明采用的胶原蛋白(collagen)是一种生物性高分子物质,是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质。它可以补充皮肤各层所需的营养,使皮肤中胶原活性增强,有滋润皮肤,延缓衰老、美容、消皱、养发等功效;本发明中采用的是双美(Sunmax)胶原蛋白植入剂,注册证号为国食药监械(许)字2009第3460037号,由台湾双美生物科技有限公司研制。
本发明采用的透明质酸钠本身是人体皮肤的构成成分之一,是人体内分布最广的一种酸性黏糖,存在于结缔组织的基质中,具有良好的保湿作用,促进伤口愈合的作用。本发明采用的注射级透明质酸钠,生产厂家为西安力邦制药有限公司,国药准字H20054738。
本发明采用的纳米羟基磷灰石,是一种典型的生物材料,具有优良的生物相容性和生物活性,可作为骨替代材料、整形和整容外科、齿科、层析纯化、补钙剂等。本发明采用的是医用纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合骨充填材料,生产厂家为四川国纳科技有限公司,国食药监械(准)字2007第3460598号。
本发明采用的聚乳酸具有优异的生物相容性和生物可降解性,以及良好的抗拉强度及延展度,可作为优良的组织工程材料。本发明采用的是美国NatureWorks LLC聚乳酸PLA Ingeo3251D。
本发明采用的自体成体细胞包括自体脂肪细胞、自体成纤维细胞、自体间充质干细胞及其它可应用于组织修复的细胞,上述细胞从自体获得,如手术等,可以预存。
本发明提供的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法具有以下有益效果:
1、通过对自体全血的特殊处理得到自体富血小板因子血浆PFRP,避免引入污染源,减少了污染风险;
2、由于采用的自体富血小板因子血浆PFRP不含膜抗原,即使异体使用也不存在免疫风险;
3、通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂,对半月板损伤等具有很好的组织修复作用,无疼痛且疗效持久;
4、通过该方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂,具有很好的抗皱、填充和提升效果;
5、制备方法简便、成本低,适于普通人群,具有很好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为患者脸部凹陷部位图片;
图2为经治疗后患者脸部凹陷部分图片;
图3为患者手部黑斑图片;
图4为经治疗后患者手部黑斑图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述,但它们不是对本发明的进一步限制。
实施例
1、材料:自体外周抗凝血,注射级透明酸钠溶液(透明质酸钠分子量为30万~300万,质量浓度范围为0.01~2%,质检合格),一次性离心管、吸管等;
2、设备:生物安全柜、低速离心机、低温冰箱等;
3、操作地点:无菌实验室
实施例1
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体外周抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1800g,离心时间为8min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP(上段贫血小板血浆、中段富血小板血浆PRP、下段红细胞的颜色各不相同,因此可以以颜色区分),制备得到的自体富血小板血浆PRP放入-80℃冻存备用,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出,在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片;离心过程中的离心力为4000g,离心时间为10min,全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按1:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是含有透明质酸钠的注射级透明质酸钠溶液,透明质酸钠分子量为100万,质量浓度为0.5%;全程无菌操作。
实施例2
1、自体富血小板因子血浆PRP的制备,采集自体抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1600g,离心时间为10min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP低温冻存,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将制备的自体富血小板血浆PRP冻融后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片;离心过程中的离心力为4000g,离心时间为10min,全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按2:1体积比.混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是注射级透明质酸钠溶液,透明质酸钠分子量为30万,质量浓度为0.01%;全程无菌操作。
实施例3
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体外周抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1200g,离心时间为10min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP,制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃保存备用,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出,在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片。离心过程中的离心力为4000g,离心时间为10min,全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与透明质酸钠按3:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。本实施例采用的是注射级透明质酸钠溶液,透明质酸钠分子量为300万,质量浓度为2%;全程无菌操作。
实施例4
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1800g,离心时间为9min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP低温冻存;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将自体富血小板血浆PRP冻融后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片,离心过程中的离心力为4000g,离心时间为8min;全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与胶原蛋白按2:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂,全程无菌操作。
实施例5
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体外周抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1800g,离心时间为9min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP,制备得到的自体富血小板血浆PRP放入-80℃保存备用,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出,在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片;离心过程中的离心力为4000g,离心时间为10min;全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与纳米羟基磷灰石按1:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂,全程无菌操作。
实施例6
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体外周抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1800g,离心时间为8min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP,制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃保存备用,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出,在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片;离心过程中的离心力为4000g,离心时间为10min;全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与聚乳酸按1:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂,全程无菌操作。
实施例7
1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体外周抗凝血20ml,采血后2h内离心,离心力1800g,离心时间为8min;离心后弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP,制备得到的自体富血小板因子血浆PRP放入-80℃冻存备用,全程无菌操作;
2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将-80℃保存的自体富血小板血浆PRP取出,在37℃溶化后离心取富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片。离心过程中的离心力为4000g,离心时间为9min;全程无菌操作;
3、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与自体脂肪细胞按1:1体积比混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂,全程无菌操作;
试验例:
试验例1:
甲、乙、丙、丁分别代表不同的自体供者,各采集自体抗凝血20ml,采用实施例1方法制备PFRP,用酶标法测定原血浆和PFRP中数种生长因子的浓度,结果见表1
表1
从上表中可以看出,对于甲、乙、丙、丁4个个体,自体富血小板因子血浆中的胰岛素样生长因子IGF-1、转录生长因子TGF-β1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-b和血管内皮细胞生长因子VEGF的浓度相对于自体原血浆的浓度提高了2~5倍,个别达到6倍、9倍。生长因子浓度的增加,能够有效地促进组织再生和修复。
试验例2
对象:一脸部划伤留下凹陷多年的患者;
方法:患者脸部真皮内注射<2ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂(通过实施例1提供的方法制备得到),1个月后观察疗效;
结果:如图1及图2所示,治疗前凹陷最深的地方约有1mm,经治疗后凹陷明显减轻,有些地方凹陷甚至已经消失。
试验例3
对象:一手部因擦伤留下黑斑多年的患者,
方法:向患者受伤手部真皮内注射<2ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂(通过实施例2提供的方法制备得到),1个月后观察疗效;
结果:如图3及图4所示,治疗前黑斑覆盖面积大约有3cm2,经治疗后黑斑明显淡化且黑斑覆盖面积也减小为原来的一半左右。
试验例4
对象:一膝关节退行病变患者,局部疼痛,向患者膝关节部位真皮下注射<5ml自体富血小板因子血浆PFRP制剂(通过实施例3提供的方法制备得到),观察疗效周期为1个月;
结果:患者无不良反应,感觉舒适,疼痛消失。
综上所述,通过本发明提供的自体富血小板因子血浆PFRP制剂,在避免引入污染源、膜抗原的同时,获得的自体富血小板因子血浆PFRP,各种生长因子的浓度浓缩为自体全血血浆浓度的2~5倍,甚至更多,从而获得更有效的组织再生,促进受损部分修复。上述自体富血小板因子血浆PFRP制剂可以用于治疗外伤、烧伤、半月板损伤,也可以用于溃疡修复,治疗退行性牙周炎、关节炎;还可以用于面部和身体除皱、填充、提升等。
Claims (10)
1.一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,采集自体全血,利用离心加冻融方式制备得到自体富血小板因子血浆PFRP;
B、自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备,将得到的自体富血小板因子血浆PFRP与生物支架/自体成体细胞按体积比3:1-1:1混合得到自体富血小板因子血浆PFRP制剂。
2.根据权利要求1所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤A包括以下分步骤:
A1、自体富血小板血浆PRP的制备,采集自体全血,离心分层后,弃去上段贫血小板血浆和下段红细胞,留取中段自体富血小板血浆PRP,立即深低温冻存;
A2、自体富血小板因子血浆PFRP的制备,将自体富血小板血浆PRP冻融后,离心取上层富血小板因子血浆PFRP备用,弃去底部膜碎片。
3.根据权利要求2所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤A1中利用抗凝管采集自体外周血。
4.根据权利要求2所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤A1,离心过程中的离心力小于2000g,离心时间为8-10min。
5.根据权利要求2所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤A2,离心过程中的离心力为4000g,离心时间为8-10min。
6.根据权利要求2所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤A2制得的自体富血小板因子血浆PFRP中的生长因子的浓度为自体全血中生长因子的2~5倍。
7.根据权利要求2所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:步骤B中的生物支架为商品化的胶原蛋白、透明质酸钠、纳米羟基磷灰石、聚乳酸中的一种;自体成体细胞为自体脂肪细胞、成纤维细胞、间充质干细胞中的一种。
8.根据权利要求8所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法,其特征在于:所述透明质酸钠包括交联透明质酸钠和不交联透明质酸钠。
9.一种通过权利要求1至8任一所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法制备的自体富血小板因子血浆PFRP制剂。
10.一种含有权利要求9所述的自体富血小板因子血浆PFRP制剂的敷料,其特征在于:由敷布浸在自体富血小板因子血浆PFRP制剂中制得。
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