CN109666632A

CN109666632A - 一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法

Info

Publication number: CN109666632A
Application number: CN201710961320.7A
Authority: CN
Inventors: 王振坤; 朱轶; 刘小龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Wang Zhenkun
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明涉及细胞医疗美容领域，公开了一种成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法。本发明通过组织块贴壁法从自体皮肤组织中获得成纤维前体细胞，本发明进一步利用自体富血小板因子血浆对自体皮肤成纤维前体细胞扩增，获得足量的自体皮肤成纤维前体细胞，皮肤成纤维细胞具有分泌胶原、透明质酸等细胞外基质的功能，对除皱、软组织修复和面部年轻化具有良好的效果。

Description

一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法

技术领域

本发明涉及一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法。本发明属于皮肤成纤维前体细胞医疗美容领域。

背景技术

年轻的皮肤中存在着大量的成纤维细胞，能够产生充足的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质，很好的支撑了皮肤的结构。然而，随着年龄的增长，体内各种成体干细胞逐步减少，皮肤内的成纤维细胞开始不断的流失，细胞新陈代谢能力减弱，相应的其产生的胶原蛋白、弹性纤维、透明质酸这些物质就会减少，不足以支撑皮肤的结构，导致真皮层变薄，皮肤开始松弛，出现皱纹。所以成纤维细胞的活力下降、数量减少，是造成皮肤衰老的根本原因。

自体成纤维前体细胞经过分离、扩增，然后注射到皱纹和疤痕部位，这些细胞增加皮肤内成纤维细胞的数量，增加自体的胶原蛋白产生，产生的这些胶原蛋白可将皱纹和疤痕填充从而达到消除皱纹和面部年轻化的目的。皮肤成纤维前体细胞提高皮肤的新陈代谢，改善微循环，激活皮肤细胞的分裂和增殖，促生皮肤功能细胞，加速胶原蛋白的合成，恢复细胞弹性，平复细纹。

皮肤成纤维前体细胞体外培养存在外源污染的风险，如培养体系中牛源血清的使用可能引入牛源支原体、病毒等病原微生物污染的风险，培养体系中猪源胰蛋白酶的使用可能引入猪源支原体、病毒等病原微生物污染的风险。在培养获得足够数量皮肤成纤维前体细胞的同时，应保持细胞功能，避免引入外源病原体污染的风险。通过贴壁法提取皮肤成纤维前体细胞，避免了胶原酶长时间的操作和外源胶原酶的引入；使用自体富血小板因子血浆及重组胰酶可规避以上污染风险；自体富血小板因子血浆能够有效对皮肤成纤维前体细胞扩增，且保持其分泌细胞外基质的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的成纤维前体细胞数量、细胞活性、操作程序、应用风险等缺陷，提供一种简单分离、高效扩增、高效分泌细胞外基质、移植后存活效率高的皮肤成纤维前体细胞制剂方法。

为了达到上述目的，本发明提出了一种皮肤成纤维前体细胞分离方法，本发明采用了以下技术手段：

本发明提供一种皮肤成纤维前体细胞分离方法，包括以下步骤：

1)采集外周血，在生物安全柜内转移至离心管。700g离心10分钟，吸取上层黄色血浆至洁净离心管中，剩下的血液加入生理盐水至原体积。

2)向离心管中加入密度为1.057的Percoll，再按缓慢加入上述生理盐水稀释的外周血，500g离心20分钟。

3)吸取中上层血小板，至洁净50ml离心管中，400g离心8分钟。

4)上清转移至洁净50ml离心管，1600g离心5分钟。

5)弃上清，取步骤1中的血浆重悬血小板沉淀。

6)将含有富血小板血浆的离心管置于液氮中30秒，然后于37℃水浴锅解冻，如此重复操作3遍。

7)将冻融后的富血小板血浆2000g离心5分钟，上清液转移至注射器中，用0.22um滤头过滤，滤出液即为富血小板因子血浆，置于4℃冰箱待用。

8)耳后取皮，置于含青、链霉素双抗的PBS浸泡30分钟。

9)在生物安全柜内，将皮肤组织置于无菌洁净容器内，用含青、链霉素双抗的PBS冲洗。

10)用剪刀将皮肤组织剪成1mm³以内的小块，用盐水重悬至50ml离心管，300g离心洗涤2遍。

11)用500ul含富血小板因子血浆的培养基重悬皮肤组织，均匀接种于T25培养瓶，37℃、5％CO2培养。

12)第二天、第五天分别向培养瓶加入0.5-1ml含富血小板因子血浆的培养基，37℃、5％CO2培养。

14)待皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，向培养瓶中加入5mlPBS轻轻摇晃，取出含皮肤组织的上清液，300g离心5分钟，弃上清，500ul含富血小板因子血浆的培养基重悬，接种于新的T25培养瓶，37℃、5％CO2培养。

15)重复步骤13)。

进一步的，本发明还提出了一种皮肤干细胞培养方法，包括以下步骤：

1)待皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

2)300g离心5分钟，弃上清，加入含富血小板血浆的培养基重悬，按1传3接种到新的培养瓶，37℃、5％CO2培养。

3)每隔两天换液，待皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，重复步骤1)和步骤2)对细胞行传代处理。

更进一步的，本发明还提出了一种皮肤成纤维前体细胞制剂方法，包括以下步骤：

1)取培养后的皮肤成纤维前体细胞，待其融合度达到80-90％，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

2)300g离心5分钟，弃上清，加入生理盐水洗涤两遍。

3)弃上清获得皮肤成纤维前体细胞沉淀，用注射溶剂重悬细胞至注射器中。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明克服了现有技术中皮肤成纤维前体细胞培养过程中引入具有免疫原性的培养物、细胞增殖活性效率低的问题，提供了一种安全、高效的自体皮肤干细胞分离培养和制剂制备方法。

和常规皮肤制剂相比：1.本发明通过高效扩增获得大量自体皮肤成纤维前体细胞；2.本发明通过自体富血小板因子血浆扩增自体皮肤成纤维前体细胞，避免引入具有免疫原性的外源培养物；3.本发明通过自体富血小板因子血浆扩增自体皮肤成纤维前体细胞，能够更好维持成纤维前体细胞分泌细胞外基质的能力。

综上，本发明通过优化的方法对皮肤成纤维前体细胞进行提取，再选用自体血液和皮肤来源的材料对皮肤成纤维前体细胞进行培养、扩增，摒弃了有外源生物源性污染风险的成份，为细胞美容安全、有效的实施提供了基本的保障。与现有的技术相比，本发明不仅安全性高，不使用有潜在致病风险的动物源性血清等，通过自体来源材料安全无排斥。并且该方法简便易行，效果优于常规皮肤成纤维细胞填充。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

1)EDTA抗凝管采集外周血60，在生物安全柜内转移至2支50ml离心管。700g离心10分钟，吸取上层黄色血浆至洁净50ml离心管中，剩下的血液加入生理盐水至原体积。

2)向2支50ml离心管中加入15ml密度为1.057的Percoll，再缓慢加入30ml上述生理盐水稀释的外周血，500g离心20分钟。

3)吸取中上层血小板，至洁净50ml离心管中，400g离心8分钟。

4)上清转移至洁净50ml离心管，1600g离心5分钟。

5)弃上清，取步骤1中的血浆重悬血小板沉淀。

7)将冻融后的富血小板血浆2000g离心5分钟，上清液转移至50ml注射器中，用0.22um滤头过滤，滤出液即为富血小板因子血浆，置于4℃冰箱待用。

8)耳后取皮3mm×3mm，于含青、链霉素双抗的PBS浸泡30分钟。

12)第二天向培养瓶加入500ul含富血小板因子血浆的培养基，37℃、5％CO2培养。

13)第五天向培养瓶加入1ml含富血小板因子血浆的培养基，37℃、5％CO2培养。

14)第七天，皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，向培养瓶中加入5mlPBS轻轻摇晃，取出含皮肤组织的上清液，300g离心5分钟，弃上清，500ul含富血小板因子血浆的培养基重悬，接种于新的T25培养瓶，37℃、5％CO2培养。

15)瓶中细胞用PBS洗涤后，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

16)300g离心5分钟，弃上清，加入含富血小板血浆的培养基重悬，按1传3接种到新的培养瓶，37℃、5％CO2培养。

17)每隔两天换液，待皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，重复步骤1)和步骤2)对细胞行传代处理。

18)重复贴壁法的皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％后，重复步骤14)至步骤17)。

19)待扩增培养后的皮肤成纤维前体细胞其融合度达到80-90％，用0.05％的重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小变圆，立即加入胰酶抑制剂终止消化，将细胞转移至50ml离心管。

20)300g离心5分钟，弃上清，加入生理盐水洗涤两遍。

21)弃上清获得皮肤成纤维前体细胞沉淀，用生理盐水重悬细胞密度为1×10⁷/ml至注射器中。

以上实施例只为说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

Claims

1.一种皮肤成纤维前体细胞分离培养及制剂制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)血小板分离和富血小板因子血浆制备；

2)皮肤成纤维前体细胞的分离、培养；

3)皮肤成纤维前体细胞制剂制备。

2.根据权利要求1所述的血小板分离和富血小板因子血浆制备，其特征在于，用密度梯度离心法和差速离心法获得血小板，用自体血浆重悬血小板后，经过3次反复冻融，2000g离心，上清夜过滤至洁净容器中。

3.根据权利要求1所述的皮肤成纤维前体细胞的分离，其特征在于，取皮后，、链霉素双抗浸泡皮肤组织30分钟，用剪刀剪成1mm³以内的小块，用500ul-1ml含富血小板因子血浆的培养基重悬、接种于T25培养瓶。

4.根据权利要求1所述的皮肤成纤维前体细胞的培养，其特征在于，待皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，皮肤组织继续接种到新的T25培养瓶，细胞用胰酶消化后接种到T75培养瓶。

5.根据权利要求1所述的皮肤成纤维前体细胞制剂的制备，其特征在于，待多次扩增后的皮肤成纤维前体细胞生长融合至80％，用重组胰蛋白酶消化，待细胞缩小，用胰酶抑制剂终止消化，离心洗涤两遍，将其与注射溶剂混合。

6.根据权利要求5所述的注射溶剂，包括但不限于生理盐水、玻尿酸、自体血浆、富血小板因子血浆。

7.根据权利要求2所述的密度梯度离心法，其特征在于，分离液密度为1.037-1.077，优选的分离液密度为1.057，其原料包括但不限于聚蔗糖-泛影葡胺和聚乙烯吡咯烷酮硅胶。

8.根据权利要求2所述的密度梯度离心法和差速离心法，其特征在于，离心条件为400-800g/15-30分钟/慢升慢降，优选的离心条件为500g/20分钟/慢升慢降，吸取中上层血小板后加入生理盐水，400g/8分钟离心取上层液体，1600g/5分钟离心弃上清。

9.根据权利要求2所述的冻融，其特征在于，置于液氮中30秒后迅速于37℃水浴锅解冻。

10.根据权利要求3所述的含富血小板因子血浆的培养基，其特征在于，富血小板因子血浆使用浓度为1％-5％，优选的浓度为2.5％，培养基包括但不限于MEM、DMEM基础培养基及各种无血清培养基。