CN104818240A - 一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法。它将小鼠输卵管连同子宫角端放在平皿中，用针头磨钝的注射器从子宫角端注入胰酶消化液，37℃消化5-8分钟，然后剪掉子宫端，用眼科镊子轻轻挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到培养瓶中，在含有对上皮细胞增殖有明显促进作用的能量物质丙酮酸钠、调节培养微环境的表皮生长因子以及利于细胞贴壁的胶原蛋白的培养液中培养，18-24小时后有细胞贴壁生长，4-5天后约80-90％细胞贴壁。

Description

一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法

技术领域

本发明涉及一种生物培养技术，具体是一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法。

背景技术

对于哺乳动物来说，输卵管是许多重要生殖事件发生的场所，包括卵子成熟、精子选择和储存、精卵结合、胚胎早期发育以及胚胎与母体第一次建立紧密联系等，因此输卵管在生殖发育及其调控研究中具有重要作用。研究表明，输卵管上皮细胞作为与配子或早期胚胎进行物质交换和通讯连接的第一道屏障，可以有效地模拟体内输卵管环境，非常适合用于研究妊娠早期生殖事件。目前已成功建立牛、山羊、人、猪等较大哺乳动物的输卵管上皮细胞体外培养体系，然而小鼠作为重要的实验动物，迄今为止还没有公认最佳的输卵管上皮细胞体外培养方法。这主要是由于小鼠输卵管管腔特别细且整体在系膜的连接下扭曲为团状，使在进行输卵管上皮细胞原代培养时，无法像处理牛或羊等大动物那样采用刮取、挤压或结扎管腔注入蛋白酶液消化等方法获取细胞。

目前小鼠输卵管上皮细胞培养方法主要有两种：一种是对整个输卵管剪碎后经蛋白酶消化处理，然后加入培养液进行培养；另一种是将剪碎的输卵管组织块直接接种到培养瓶底壁，待组织块稍微干燥后加入培养液培养(赵晓娥，兰杰，王妍，杨培先，胡林勇，马保华.小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究，动物医学进展，2009,30(2):30-34)。这两种方法都有输卵管上皮细胞生长，但缺陷也是显而易见的，就是培养的细胞中既有上皮细胞又有成纤维细胞，上皮细胞混杂于成纤维样细胞中生长，造成上皮细胞纯度较低。因此，为了保证实验结果的可靠性、稳定性和可重复性，必须在传代过程中对上皮细胞进行纯化培养。有报道提出利用两步消化法(即根据成纤维细胞比上皮细胞对胰酶的敏感性更强，加入胰酶后控制消化时间，待成纤维细胞从培养瓶底壁消化下来后弃去，再加入胰酶将上皮细胞消化下来继续培养)和差速贴壁法(即利用成纤维细胞比上皮细胞贴壁稍快的特性，传代后控制贴壁时间，待成纤维细胞贴壁后将未贴壁的上皮细胞转移到其他培养瓶中继续培养)逐步去除混杂的成纤维细胞，获得纯度较高的上皮细胞。然而这种处理势必会造成输卵管上皮细胞传代次数过多，使细胞活性和分泌功能降低，某些特征性生物学活性如纤毛摆动等丧失。

发明内容

为了克服上述小鼠输卵管上皮细胞体外培养方法的缺点，本发明提供了一种新的小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法。该培养方法不将输卵管剪碎处理，而是从子宫端向输卵管管腔中注入胰酶消化液，待粘膜组织从管壁松散甚至游离下来后，用镊子轻轻挤压输卵管，这时会有大量粘膜组织和细胞从管腔中流出来，收集这部分组织和细胞接种培养后发现，细胞生长均匀，上皮细胞纯度达98％以上。

本发明的技术方案是：一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，将小鼠输卵管连同子宫角端放在平皿中，用针头磨钝的注射器从子宫角端注入胰酶消化液，37℃消化5-8分钟，然后剪掉子宫端，用眼科镊子轻轻挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到培养瓶中培养，18-24小时后有细胞贴壁生长，4-5天后约80-90％细胞贴壁。

备注：本发明需要事先将注射器的针头尖端磨钝，以免尖细的针头刺破子宫端；使用前注射器用75％酒精反复冲洗5-6遍，然后放在超净台内采用紫外线照射半小时。

具体包括以下步骤：

(1)培养液配制

每450-500ml细胞培养液(DMEM/F12)中加入50-60ml胎牛血清(FBS)、2-3ml青链霉素混合液、0.1-0.2克的丙酮酸钠、0.03-0.1ml的0.1mg/ml表皮生长因子溶液(EGF，将200微克EGF溶于2毫升五蒸水中，-20℃保存备用)和0.05-0.1ml的5mg/ml的Ⅰ型胶原溶液(将50mg胶原粉末溶解在8毫升五蒸水中，逐滴加入乙酸将PH调至3.0，充分溶解后用五蒸水定容至10毫升)；然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，两周内用完。细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热。

(2)输卵管上皮细胞培养

将处死的小鼠剪开腹部后取下卵巢至子宫角端，放在含1％青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液(PBS)平皿中，在超净台内去除脂肪、卵巢，用PBS液反复涮洗输卵管连同子宫角端4-5遍，然后放在干燥的平皿内；用针头磨钝的注射器从子宫角端注入1-1.5毫升0.25％胰酶消化液(含0.05％ EDTA)，37℃消化5-8分钟，之后剪掉子宫端，用眼科镊子轻轻挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心(150-200×g、5分钟)，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到培养瓶中(每2-3只小鼠接种1个T25培养瓶)，最后置于37.5℃、5％ CO₂饱和湿度培养箱内培养，每48小时后换液一次。

本发明的有益效果是：(1)由于用眼科镊子直接挤压小鼠输卵管，发现很难仅将含上皮细胞的粘膜层从管腔中挤出，而从输卵管管口处注入蛋白酶消化液虽然有助于松散粘膜组织，但由于输卵管管腔非常细，不易操作。因此，本发明从子宫端注入蛋白酶消化液，由于输卵管在系膜的连接下扭曲为团状结构且非常细，所以注完后不用将管腔两端结扎消化液也不会流出，消化5-8分钟后粘膜组织从管壁松散甚至游离下来，这时用镊子轻轻挤压输卵管，会有大量粘膜组织和细胞从管腔中流出，收集这些组织和细胞接种后培养即可获得具有典型上皮细胞形态的单层。(2)本发明在培养液中添加对上皮细胞增殖有明显促进作用的能量物质丙酮酸钠、调节培养微环境的表皮生长因子以及利于细胞贴壁的胶原蛋白，使培养环境更利于上皮细胞增殖、分化，因此在接种后4-5天即可获得80-90％细胞贴壁。

附图说明

图1为小鼠输卵管上皮细胞采用实施例1的方法培养5天后的100×照片。

具体实施方式

实施例1

(1)培养液配制

将50毫升FBS、2.5毫升青链霉素混合液[青霉素-链霉素混合液(100X)，青霉素含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml]、0.15克丙酮酸钠、100微升表皮生长因子(EGF，将200微克EGF溶于2毫升五蒸水中，-20℃保存备用)、50微升Ⅰ型胶原溶液(C8919，美国Sigma；将50mg胶原粉末溶解在8毫升五蒸水中，逐滴加入乙酸将PH调至3.0，充分溶解后用五蒸水定容至10毫升)溶解在450毫升DMEM/F12培养液中，经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的50毫升离心管中，每管40毫升，放置4℃保存。细胞培养前半小时将1管培养液放在37℃水浴锅中预热。

(2)注射器处理

将注射器的针头尖端磨钝；使用前注射器用75％酒精反复冲洗5-6遍，然后放在超净台内采用紫外线照射半小时。

(3)输卵管上皮细胞培养

断颈处死6周龄昆明白母鼠4只，放在75％酒精中浸泡2秒后立刻取出，剪开腹部后取下卵巢至子宫角端，放在含1％青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液(PBS)平皿中。在超净台内去除脂肪、卵巢，用PBS液反复冲洗输卵管连同子宫角端5遍，然后放在干燥的平皿内，用针头磨钝注的射器从子宫角端注入1毫升0.25％胰酶消化液(含0.05％ EDTA)，37℃消化6分钟，之后剪掉子宫端，用眼科镊子轻轻挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心(200×g、5分钟)，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到两个T25培养瓶中，最后置于37.5℃、5％ CO₂饱和湿度培养箱内培养，每48h换液。经相差显微镜下观察发现，22小时后有细胞贴壁生长，5天后约80-90％细胞贴壁。如图1所示，细胞形态呈不规则多角形，犹如鹅卵石状，而且边界清楚、成簇生长，这些都是上皮细胞的典型特征，上皮细胞纯度达98％以上。

Claims (6)

1.一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，将小鼠输卵管连同子宫角端放在平皿中，用针头磨钝的注射器从子宫角端注入胰酶消化液，37℃消化5-8分钟；然后剪掉子宫端，用眼科镊子挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到培养瓶中培养。

2.如权利要求1所述的一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，具体包括以下步骤：

(1)培养液配制

每450-500ml DMEM/F12细胞培养液中加入50-60ml胎牛血清、2-3ml青链霉素混合液、0.1-0.2g的丙酮酸钠、0.03-0.1ml的0.1mg/ml的表皮生长因子溶液和0.05-0.1ml的5mg/ml的Ⅰ型胶原溶液；然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中；

(2)输卵管上皮细胞培养

将处死的小鼠剪开腹部后取下卵巢至子宫角端，放在含1％青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液平皿中，在超净台内去除脂肪、卵巢，用PBS液反复涮洗输卵管连同子宫角端4-5遍，然后放在干燥的平皿内；用针头磨钝的注射器从子宫角端注入1-1.5毫升0.25％胰酶消化液，37℃消化5-8分钟；之后剪掉子宫端，用眼科镊子轻轻挤压输卵管，收集流出的粘膜组织和细胞于离心管中并离心，之后去掉上清液加入培养液，吹打混匀后接种到培养瓶中，最后置于37.5℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养，每48小时后换液一次。

3.如权利要求2所述的一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述0.25％胰酶消化液含0.05％EDTA。

4.如权利要求2所述的一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，每2-3只小鼠接种1个T25培养瓶。

5.如权利要求2所述的一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热。

6.如权利要求1-5中任一项所述的一种小鼠输卵管上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述针头磨钝的注射器使用前用75％酒精反复冲洗5-6遍，然后放在超净台内采用紫外线照射半小时。