CN103305551B - 一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于囊胚上基因表达水平筛选供体细胞系的方法，将来源不同个体的供体细胞系进行核移植后，在囊胚期检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，选择在克隆囊胚上这些基因的表达水平全部与正常发育的体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞，可显著提高牛体细胞克隆效率。
Description
技术领域
本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法。
背景技术
体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。其中供体细胞的遗传背景对动物克隆效率的影响很大，有的细胞系用于核移植，最终的克隆效率很高，且出生的克隆动物没有表现明显的发育异常；但有的细胞系虽然活力很好，用于核移植后克隆胚胎的囊胚发育也较高，但胚胎移植后的妊娠率和出生率极低，或出生的克隆动物全部在围产期死亡，且常伴随有各种发育异常。
克隆动物出生存活率是判断哪株供体细胞系用于体细胞克隆后克隆效率最高的最好方法。但由于大动物的怀孕周期长，所以等克隆动物出生后依据克隆效率来筛选易于被重编程的、克隆效率高的供体细胞系很费时费力。所以，在胚胎发育早期筛选易于被卵母细胞重编程、利于克隆胚胎发育且克隆效率高的优质细胞系是动物克隆亟待解决的科学问题。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，通过在克隆囊胚上基因的表达水平来选择核供体细胞，可显著提高牛体细胞克隆效率。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，包括以下操作：
将作为供体细胞的动物细胞株与去核后的卵母细胞融合后得到体细胞克隆胚，然后将其激活并于体外培养7～10天后，在囊胚期检测指定基因的表达水平，同时以体外受精第7.5天胚胎为对照，根据这些基因的表达是否正常作为筛选供体细胞的依据：
筛选指定基因表达水平与体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞；
所述的指定基因包括高效克隆细胞系、低效克隆细胞系在囊胚期与体外受精囊胚表达差异显著的基因。
所述的指定基因包括：
免疫和发育相关基因：TCF7、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、Vimentin；
多能性和分化相关基因：OCT4、NANOG、SOX2、CDX2；
印迹基因：XIST和IGF2R；
microRNA合成和表观修饰调控基因：DGCR8、SENP7、DNMT3B。
所述的检测指定基因的表达水平的方法为：
用基因芯片检查囊胚上基因的表达水平，当基因在两组间差异倍数大于2，且P<0.05视为差异显著。
所述的体细胞克隆胚的制备及培养为：
将来源不同个体的供体细胞株注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在用离子霉素和6-DMAP激活后在G1.5续贯培养液中培养72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养至第7d。
所述筛选供体细胞的依据为：
以体外受精第7.5d胚胎为对照，在第7.5d克隆胚胎上检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，筛选全部基因表达水平与体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞。
所述的表达水平差异不显著是指差异倍数小于2，且P>0.05。
所述的牛体细胞克隆胚在进行激活处理或培养时，要在激活液和胚胎培养液中添加1μmol/L的Oxamflatin，共12h。
所述的去核后的卵母细胞的制备为：
采集的COCs在26μM BCB的PBS中在38.5°C、5%CO2、95%饱和湿度条件下90min后挑选胞质蓝色的COCs作为候选体细胞核移植的卵母细胞；
在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst33342和体积浓度10%FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植。
指定基因表达水平的差异性在筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系中的应用，所述的指定基因包括TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R基因的一种或几种。
一种筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系的试剂盒，该试剂盒包括对照检测试剂和待测检测试剂；所述的对照检测试剂和待测检测试剂均包括检测指定基因表达水平的试剂或基因芯片；
所述的指定基因包括TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R基因。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的基于囊胚上基因表达水平筛选供体细胞系的方法，将来源不同个体的供体细胞系进行核移植后，在囊胚期检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，选择在克隆囊胚上这些基因的表达水平全部与正常发育的体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞，可显著提高牛体细胞克隆效率。
具体实施方式
本发明提供的基于囊胚上基因表达水平筛选供体细胞系的方法，将来源不同个体的供体细胞系进行核移植后，在囊胚期检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，选择在克隆囊胚上这些基因的表达水平全部与正常发育的体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞，可显著提高牛体细胞克隆效率。
下面结合具体的操作过程和对比分析结果对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下面给出基于囊胚上基因表达水平筛选供体细胞系的方法及其操作：
首先给出以下试剂和培养液/处理液的来源或制备：
Oxamflatin、DMSO、胰蛋白酶、EDTA、青霉素、链霉素、无机盐、石蜡油为sigma公司产品，DMEM/F12液体培养基和特级胎牛血清(FBS)为Giboco产品，胚胎培养液G1.5、G2.5均购买于vitrolife公司。其他未标明的均为sigma公司产品。
a、BCB工作液
26μM BCB（B-5388,Sigma）+5%FBS+PBS
b、卵母细胞体外成熟培养液
成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHCO3、0.075IU/mL HMG、1μg/mL17β-E2、0.33mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
c、mSOF溶液
mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2%的BME、体积分数1%的MEM、体积分数1%的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；
d、电融合液
电融合液的组成为：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1%BSA。
e、Oxamflatin储存液和工作液体的配置
i）Oxamflatin储存液浓度10mM:
称取1mg Oxamflatin于灭菌的1.5ml离心管中，加入291μL DMSO后混匀，储存于-20°C冰箱待用。
ii）Oxamflatin工作液浓度为1μM:
首先配成浓度为100μM：用移液枪取990μL mSOF于灭菌的的1.5ml离心管中，然后添加10μL浓度为10mM的Oxamflatin储存液，混匀。
工作液：取1μL浓度为100μM的Oxamflatin液体，分别加入到99μL胚胎激活液（含有1.9mM6-DMAP的mSOF）中和99μL胚胎培养液G1.5中。Oxamflatin工作液可放于4°C，一周内使用。
下面给出体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备
a．牛皮肤成纤维细胞的培养
从液氮中取不同来源个体的荷斯坦奶牛的2-5代的牛皮肤成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Media）细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛皮肤成纤维细胞达到80%汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1：3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。
为了检测基于囊胚上基因表达水平来分析不同来源个体的供体细胞对体细胞克隆效率的影响效果，同时设设置两组异常表达组，其余操作方法相同。
正常表达组：供体细胞用于核移植后发育到囊胚阶段，检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，如果在克隆囊胚上这些基因的表达水平全部与正常发育的体外受精囊胚上的表达水平差异不显著，则选为正常表达组的供体细胞系。
异常表达组1：三株已知遗传背景差的细胞系，用于供体细胞后，在克隆囊胚上TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2和NEK6等大部分基因表达异常。
异常表达组2：三株细胞系用于供体细胞后，在克隆囊胚上OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R等几个多能性基因和印迹基因大部分表达异常。
b．卵母细胞的成熟培养
用于收集卵母细胞的牛卵巢采自西安屠宰场，于20-25℃含双抗的生理盐水的保温瓶中，在母牛屠宰后4小时内送回实验室。卵巢用20-25℃生理盐水液洗涤数次至干净后，用高压灭菌过的纱布擦拭干净，用带12号针头的一次性注射器抽吸卵巢表面2～8mm的卵泡，抽出的卵泡液用含3%FBS的PBS稀释后在60mm一次性平皿中收集卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocytecomplexes，COCs）。在体视显微镜下挑选胞质均一且有数层卵丘细胞紧密包裹的COCs在PBS中洗3次后，入26μM BCB的PBS中在38.5°C、5%CO2、95%饱和湿度条件下90min。BCB处理后，COCs用PBS洗2遍，挑选胞质蓝色的COCs进行后续试验分析。
将挑选的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm平皿中（提前在培养箱平衡一小时），在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1%透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。
c．牛体细胞克隆胚的构建
去核：
去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst33342和10%FBS的PBS中孵育15min。在显微操仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
注核和电融合：
注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d、牛体细胞克隆胚融合后的处理
牛体细胞克隆胚的激活：
在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理（用离子霉素（Ionomycin）联合6-DMAP激活）：首先在含2～5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含1～2mmol/L6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养4h。
牛克隆胚的体外培养：
牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L Oxamflatin的G1.5培养液中，在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养8h，G1.5培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再用G1.5培养液清洗多次，继续在G1.5培养液中培养至72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。
所述的作为培养基的G1.5培养液上还覆盖有石蜡油（Sigma,M8410），并预先在CO2培养箱中平衡至少2h。
与两个异常表达组相比，利用正常表达组细胞株用于核移植后，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和体内发育率以及出生率。具体表现为：
1）牛体细胞克隆囊胚的发育率
如表1所述的基于囊胚上基因表达水平筛选的供体细胞株对牛克隆胚胎体外发育的影响，可以看出囊胚上19个基因正常表达的细胞株用于核移植，可显著提高囊胚的发育率。
表1不同来源个体细胞株对牛克隆胚胎体外发育的影响
a,b(P<0.05)同列数据之间上标不同表示显著性差异。
括号内的数为发育率(mean±SEM%),其他数为重复实验的胚胎总数。卵裂率和囊胚的发育率分别在重组胚培养48和168h检测(0h代表胚胎激活后转入G1.5的时候).在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P<0.05)。
2）牛体细胞克隆囊胚的发育率
如表2所述的基于囊胚上基因表达水平筛选的供体细胞株对牛克隆胚胎体内发育的影响，可以看出囊胚上19个基因正常表达的细胞株用于核移植，胚胎移植后，克隆胚胎的妊娠率和出生率显著高于异常表达组细胞株。
表2各组牛克隆胚胎的体内发育能力
第7d囊胚移植同期发情的受体牛，每头受体牛移植2枚胚胎。
a,b(P<0.05)同列数据之间上标不同表示显著性差异
在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P<0.05)。
在上述检测的基础上，因此提出以下应用及筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系的试剂盒。
所述的应用为：指定基因表达水平的差异性在筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系中的应用，所述的指定基因包括TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R基因的一种或几种。
而一种筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系的试剂盒，该试剂盒包括对照检测试剂和待测检测试剂；所述的对照检测试剂和待测检测试剂均包括检测指定基因表达水平的试剂或基因芯片；
所述的指定基因包括TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R基因。
Claims (5)
1.一种基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，其特征在于，包括以下操作：
将作为供体细胞的牛皮肤成纤维细胞株与去核后的牛的卵母细胞融合后得到牛体细胞克隆胚，然后将其激活并于体外培养7～10天后，在囊胚期检测指定基因的表达水平，同时以体外受精第7.5天的牛胚胎为对照，根据这些基因的表达是否正常作为筛选供体细胞的依据：筛选指定基因表达水平与体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞；
所述的牛体细胞克隆胚在进行激活处理或培养时，要在激活液和胚胎培养液中添加1μmol/L的Oxamflatin，共12h；
所述的指定基因包括高效克隆细胞系、低效克隆细胞系在囊胚期与体外受精囊胚表达差异显著的基因；
所述的指定基因共19个，包括：
免疫和发育相关基因：TCF7、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE 1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、Vimentin；
多能性和分化相关基因：OCT4、NANOG、SOX2、CDX2；
印迹基因：XIST和IGF2R；
microRNA合成和表观修饰调控基因：DGCR8、SENP7、DNMT3B；
所述的检测指定基因的表达水平的方法为：
用基因芯片检查囊胚上基因的表达水平，当基因在两组间差异倍数大于2，且P<0.05视为差异显著；表达水平差异不显著是指差异倍数小于2，且P>0.05。
2.如权利要求1所述的基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，其特征在于，所述的牛体细胞克隆胚的制备及培养为：
将来源不同牛个体的供体细胞株注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在用离子霉素和6-DMAP激活后在G1.5续贯培养液中培养72h；然后将牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养至第7d。
3.如权利要求1所述的基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，其特征在于，所述筛选供体细胞的依据为：
以体外受精第7.5d的牛胚胎为对照，在第7.5d克隆胚胎上检测TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R的表达水平，筛选全部基因表达水平与体外受精囊胚上的表达水平差异不显著的供体细胞系为核供体细胞。
4.如权利要求1所述的基于囊胚基因表达水平筛选供体细胞系的方法，其特征在于，所述的去核后的卵母细胞的制备为：
采集的COCs在26μM BCB的PBS中在38.5℃、5％CO2、95％饱和湿度条件下90min后挑选胞质蓝色的COCs作为候选体细胞核移植的卵母细胞；
在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核移植。
5.一种筛选动物体细胞克隆胚的供体细胞系的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括对照检测试剂和待测检测试剂；所述的对照检测试剂和待测检测试剂均包括检测指定基因表达水平的试剂或基因芯片；
所述的指定基因包括TCF7、DGCR8、SENP7、DNMT3B、Vimentin、IFI6、EFNA2、F5、IRAK1、PRICKLE 1、TNFRSF1A、ARG2、NEK6、OCT4、NANOG、SOX2、CDX2、XIST和IGF2R基因。
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