CN103468639A - 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用,属于细胞生物技术领域。该方法中,卵母细胞的处理时期为生发泡期至第一次减数分裂后末期;所述处理时间为18小时;所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为0.5-10ng/mL。本发明通过使用TSA短期处理体外成熟培养的牛卵母细胞增加了体细胞核在卵母细胞质中的稳定性,使克隆胚胎激活前的组蛋白修饰与正常卵母细胞类似,并且显著的提高了牛体细胞克隆胚胎的体外发育率及胚胎质量。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域,尤其是涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用。
背景技术
目前,人们已在不同物种中利用体细胞克隆技术生产出了克隆动物。但是,克隆动物出生率低,后代发育异常制约着该项技术的广泛应用。随着研究的不断深入,体细胞核在受体胞质中的不完全重编程或重编程异常是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。正常受精及胚胎发育过程中,DNA修饰经历甲基化的去除和重建,组蛋白的修饰也经历动态变化。然而,在克隆胚胎的早期发育过程中则存在异常高DNA水平,以及异常的组蛋白修饰。
组蛋白氨基酸残基的修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、苏素化、ADP核糖基化、脯氨酸异构化等,这些修饰导致染色体构象的改变,从而调控基因的表达、沉默。组蛋白赖氨酸乙酰化、甲基化在基因表达调控及染色体构象变化中起重要作用。组蛋白乙酰化修饰受乙酰化转移酶、去乙酰化酶(HDAC)的调节,去乙酰化酶活性的抑制,导致细胞组蛋白乙酰化明显增加,激活沉默的基因表达。
TSA是一种可逆的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。TSA处理牛供体细胞可显著增加体细胞的组蛋白乙酰化水平,但是没有促进克隆胚胎的发育和重编程。当使用该药物处理早期克隆胚胎时,明显改善了牛克隆胚胎的体外发育。但是,是否促进了正常重编程的发生还不清楚。然而,目前还未见到相关该药物处理牛卵母细胞对牛克隆胚胎和重编程影响的报道。
卵母细胞成熟过程需要多种酶的周期调控,并且进入卵母细胞中的体细胞核也同样受到卵母细胞内酶类的调控。因此,卵母细胞的胞质环境在调控体细胞核表观遗传重编程方面起着更为关键的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用;通过使用TSA短期处理体外成熟培养的牛卵母细胞增加了体细胞核在卵母细胞质中的稳定性,使克隆胚胎激活前的组蛋白修饰与正常卵母细胞类似,并且显著的提高了牛体细胞克隆胚胎的体外发育率及胚胎质量。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理培养卵母细胞的方法,其特征是,所述卵母细胞的处理时期为生发泡期至第一次减数分裂后末期;所述处理时间为18小时;所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为0.5-10ng/mL。
优选的,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为1ng/mL。
优选的,其特征是,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA,其中,TSA为Trichostatin A。
本发明还提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理培养卵母细胞的方法在改善牛体细胞克隆胚胎制备技术中的应用。
采用了上述技术方案,本发明的有益效果为:本发明通过使用TSA短期处理体外成熟培养的牛卵母细胞增加了体细胞核在卵母细胞质中的稳定性,使克隆胚胎激活前的组蛋白修饰与正常卵母细胞类似,并且显著的提高了牛体细胞克隆胚胎的体外发育率及胚胎质量。
附图说明
附图1不同来源重构胚融合2hr后不同组蛋白乙酰化修饰位点的免疫细胞化学染色的动态变化研究;
附图2体外成熟牛卵母细胞MII期不同组蛋白乙酰化修饰位点的免疫细胞化学染色;
附图3TSA处理卵母细胞对激活前重构胚染色质稳定性的影响;
附图4TSA处理卵母细胞激活前重构胚正常核型率统计。
其中,附图1中,A、A’-G、G’:未处理重构胚融合2hr后H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色;B、B’-H、H’:卵母细胞处理组后的重构胚融合2hr后H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。标尺所示为50μm。
附图2中,A、A’、A”-D、D’、D”:体外成熟牛卵母细胞MII期H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac和H4K5ac免疫染色。
附图3中,A、A’,B、B’为未处理组供体细胞染色体。A、A’:融合2hr(F2h);B、B’:融合4hr(F4h)。C、C’,D、D’为1ng/mL TSA处理组。C、C’:融合2hr(F2h);D、D’:融合4hr(F4h);A、B、C、D:DNA;A’、B’、C’、D’:DNA+Tubulin。标尺所示为50μm。
附图4中,字母不同表示组间存在显著性差异(P<0.01)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
如附图1-4所示,
1、TSA处理卵母细胞及其核型检测
用带18#针头的10mL注射器吸取卵巢表面直径为2-8mm的卵泡,在体视显微镜下收集卵泡液中的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),在成熟培养液(M199+25mmol/L Hepes+0.38mmol/L丙酮酸钠+10μg/mL FSH+1μg/mL17-β雌二醇+50μg/mL青霉素+100μg/mL链霉素+10%FBS)中清洗3-4遍,将80-100个COCs置于预平衡,且覆盖矿物油的含有0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL和10ng/mL TSA药物的1mL成熟培养液中,在38.5℃、5%CO2和饱和湿度条件下,成熟培养18小时后,去除药物继续培养至24小时进行孤雌激活处理,或药物处理后直接进行克隆胚胎的制备。
经TSA处理的卵母细胞进行免疫细胞化学染色确定处理后组蛋白乙酰化水平和分析卵母细胞核型显示,从1ng/mL开始即显著影响了卵母细胞组蛋白的修饰。然而,随着TSA浓度的增加,卵母细胞成熟率明显下降,当TSA浓度大于2.5ng/mL时,成熟率与其他各组出现显著性差异,较低浓度TSA没有影响卵母细胞的成熟。但是经高浓度药物处理后,减数分裂明显被抑制于MI期。
将处理18小时的卵母细胞继续在无药物培养液中培养至24小时后,进行孤雌激活发育,见下表1。1ng/mL TSA处理组明显促进了孤雌囊胚的发育,而随着药物浓度的不断增加,孤雌胚胎的发育率逐渐下降。因此,1ng/mLTSA效果较好。
表1TSA处理牛卵母细胞对成熟及孤雌胚胎发育的影响
2、处理后重构胚的组蛋白乙酰化、甲基化修饰分析
收集未融合重构卵、融合2小时、融合4小时、激活4小时及激活18小时的重构胚用4%多聚甲醛固定液室温固定15-20min,用含1%Triton X-100的PBS室温通透1小时。通透后的胚胎用含10%山羊血清的PBS-+2%BSA室温封闭1小时。然后与用PBS-+2%BSA溶液稀释好的一抗孵育(1:100),4℃过夜。用PBS-+2%BSA清洗三遍后,胚胎用FITC标记的二抗(1:500)避光染色,37℃,2小时。细胞核用10μg/mL PI染色5min。使用激光共聚焦显微镜检测1ng/mL处理组与对照组未融合重构卵、融合2小时、激活4小时、激活18小时重构胚供体细胞在卵母细胞中的重编程能力。结果显示,融合2小时后,药物处理的卵母细胞显著促进了体细胞核的去乙酰化,致使H3K9ac、H3K18ac、H4K8ac修饰完全消失,H4K5ac明显减弱。而未处理对照组H4K8ac和H4K5ac还保持较强的荧光染色(附图1)。药物处理组重构胚的组蛋白乙酰化修饰模式与MII期卵母细胞的类似(附图2)。当卵母重构胚被激活后,对照与处理组在各乙酰化位点的修饰上没有明显差异,并且TSA没有影响组蛋白甲基化的修饰。
相关研究显示,融合后供体核在卵母细胞中受蛋白激酶的作用,发生核膜破裂及早期染色体凝聚,使供体染色质达到类似MII期卵母细胞的状态,但随着融合后恢复时间的延长,将明显增加供体染色体的不稳定性。为了验证处理后的卵母细胞是否会导致异常染色体的出现,检测了融合后不同时间体细胞核和微管的定位分布。显示,处理的卵母细胞融合入体细胞后4小时明显降低染色体的异常率(图3、图4,P<0.01)。
3、牛体细胞克隆胚胎的制备和发育
以上结果显示,牛卵母细胞体外成熟过程中经TSA的短期处理显著改善组蛋白乙酰化的修饰模式,使融合后重构胚的组蛋白修饰明显类似于正常成熟的卵母细胞,并且显著提高了供体染色体在卵母细胞胞质中的稳定性。
进一步生产克隆胚胎。将体外成熟18小时的卵母细胞从含药培养液中取出,用0.1%的透明质酸酶消化,去除卵丘细胞,挑选排出第一极体且胞质匀称,形态良好的卵母细胞,置于含7.5μg/mL的CCB操作液中,在镜下通过显微操作仪去除第一极体及其胞质染色质,并注入体细胞。将操作完的重构卵置于预热的融合液中,室温平衡5min,然后转入融合槽内,施以2次190V/mm,20μs,间隔100ms的方波电脉冲,进行融合。30min后检查融合情况。在卵母细胞成熟23-24小时时对重构胚进行激活处理,挑选融合的重构胚置于含5μM离子霉素的发育液(SOFaa)中处理5min,然后在含10μg/mL放线菌酮(Cycloheximide,CHX)的SOFaa中,在38.5℃、5%CO2和饱和湿度条件下激活5小时。激活完毕,用SOFaa洗三次,放入矿物油覆盖的40μL小滴中进行培养。7天后统计囊胚率和囊胚细胞数。观察处理与对照组的胚胎发育显示,处理后的卵母细胞明显提高了克隆胚胎的发育率和胚胎细胞数,如下表2所示。
表2TSA处理牛卵母细胞对体细胞克隆胚胎发育的影响
字母不同表示组间存在显著性差异(P<0.05)
本发明不局限于上述具体的实施方式,本领域的普通技术人员从上述构思出发,不经过创造性的劳动,所作出的种种变换,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法,其特征是,所述卵母细胞的处理时期为生发泡期至第一次减数分裂后末期;所述处理时间为18小时;所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为0.5-10ng/mL。
2.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法,其特征是,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂的处理浓度为1ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法,其特征是,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA。
4.根据权利要求1所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法在改善牛体细胞克隆胚胎制备技术中的应用。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107142241A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-08 | 中山大学 | 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法 |
JP2020534020A (ja) * | 2017-09-30 | 2020-11-26 | 中国▲農▼▲業▼大学 | 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 |
CN113174366A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-27 | 广西壮族自治区畜牧研究所 | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102344941A (zh) * | 2010-07-29 | 2012-02-08 | 内蒙古大学 | 一种培育克隆动物或转基因克隆动物的方法 |
CN102344940A (zh) * | 2010-07-29 | 2012-02-08 | 内蒙古大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆胚胎或转基因胚胎中的应用 |
CN103146643A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-06-12 | 孔凡锋 | 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 |
-
2013
- 2013-08-31 CN CN2013104042831A patent/CN103468639A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102344941A (zh) * | 2010-07-29 | 2012-02-08 | 内蒙古大学 | 一种培育克隆动物或转基因克隆动物的方法 |
CN102344940A (zh) * | 2010-07-29 | 2012-02-08 | 内蒙古大学 | 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在培育克隆胚胎或转基因胚胎中的应用 |
CN103146643A (zh) * | 2013-03-22 | 2013-06-12 | 孔凡锋 | 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
吴侠: "牛体外受精胚胎及克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰表观遗传重编程的研究", 《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)基础科学辑》 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107142241A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-08 | 中山大学 | 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法 |
CN107142241B (zh) * | 2017-05-08 | 2021-02-26 | 中山大学 | 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法 |
JP2020534020A (ja) * | 2017-09-30 | 2020-11-26 | 中国▲農▼▲業▼大学 | 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 |
JP7138359B2 (ja) | 2017-09-30 | 2022-09-16 | 中国▲農▼▲業▼大学 | 未成熟卵母細胞の体外成熟培養液、及びその応用 |
US11767506B2 (en) | 2017-09-30 | 2023-09-26 | China Agricultural University | In vitro maturation culture medium of immature oocytes and use thereof |
CN113174366A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-27 | 广西壮族自治区畜牧研究所 | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 |
CN113174366B (zh) * | 2021-03-29 | 2023-04-11 | 广西壮族自治区畜牧研究所 | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 |
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